專利名稱：來自肝外膽管樹的專能干細胞及其分離方法
技術領域：
本發明總體上涉及膽管樹、肝和胰中的專能祖細胞，包括專能干細胞，及包括前述祖細胞或干細胞的細胞群。更具體地，本申請涉及采自肝外膽管樹部分的專能祖細胞或干細胞及包括前述祖細胞或干細胞的細胞群。本申請包括包括前述祖細胞或干細胞及相應細胞群的組成及在體外及體內鑒定、分離、培養、擴增和分化這些細胞及細胞群的 方法。
背景技術：
死細胞、垂死的細胞或功能障礙的系統是許多已知疾病的起因，包括糖尿病和阿爾茨海默氏病。治療這些疾病的一種方法為從供體移植整個器官或其部分以替代“患病”細胞的部分或所有功能。盡管通常在遏制或延緩一些疾病的進程方面成功，但器官移植伴隨相當大的發病率/死亡率，與所有主要外科手術干預一樣，移植的器官的存活取決于長期給服強效的、系統的免疫抑制劑，這些免疫抑制劑通常導致不合需要的副作用。然而，無論這些方法成功與否，它們固有地受供體可用性的限制。“再生醫學”中的替代方法是使用干細胞及祖細胞重新填充整個器官或其部分，或至少其功能。實際上，干細胞可以相當小的外科手術注入或植入，通常不利事件的發生率可忽略。由于干細胞不產生免疫性(或最低程度地產生免疫性)，對于這些細胞的初始種植，它們需要相當少的免疫抑制劑(如果需要的話)。干細胞是罕見的、需要精確的分離技術和嚴格定義的體內和體外增殖條件的細胞。因此，迫切需要建立備選及互補的、可移植功能性干細胞和祖細胞及組織源以用于臨床使用。

發明內容
根據本發明的一實施例，提供包括能夠分化至多個內胚層譜系(如肝譜系、膽譜系、胰腺譜系或其組合)的哺乳動物專能干/祖細胞的組成，其中這些細胞從哺乳動物的膽管樹組織(例如，膽管樹的任何部分，包括門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管、膽囊和膽管周圍腺體或采自膽管周圍腺體的祖細胞或干細胞)獲得，前述哺乳動物包括人哺乳動物、胎兒、嬰兒、兒童(小兒科)、成人或死后長達72小時的死人。還提供包括含前述哺乳動物專能干/祖細胞的細胞群和/或富集前述專能干/祖細胞的哺乳動物細胞群的組成。專能干/祖細胞可表達(i)指示早期肝細胞譜系(如HNF6、HES1、CK19、白蛋白或AFP)的至少一標記物；(ii)指示早期胰腺細胞譜系(如roXl、PROXl、NGN3或胰島素)的至少一標記物；及選自(a)-(c)類別的至少一標記物(a)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物(如 CD 133 (prominin)、CD44H(透明質酸受體)、N-CAM、CXCR4 或 EpCAM) ； (b)指示內胚層干/祖細胞(SOX 9、S0X17或F0XA2)的至少一轉錄因子 ’及U)多能基因(如S0X2、NANOG, LF4、0CT4A或0CT4)的中弱表達。在一些情形下，專能干/祖細胞可表達來自每一類別或(a)-(c)的一標記物。表達可通過體內組織、剛分離的細胞或培養的細胞的端點和數量RT-PCT化驗分析和/或免疫組織化學進行確定。專能細胞也可表達至少下述之一 (i)端粒酶蛋白的核表達；(ii)多能基因的中低水平表達；(iii)典型內胚層轉錄因子(如S0X17, SOX 9，F0XA2, HES 1，HNF6, PROXl,HNF3B(肝細胞核因子-3B，F0XA2, SALL4(Sal類蛋白4)，PDX 1，NGN3或其組合)的核或核周表達；(iv)內胚層干/祖細胞表面標記物的表達；(ν)成熟肝臟(P450-3A4，轉鐵蛋白，酪氨酸轉氨酶(TAT)及高水平白蛋白；用于成熟膽管的譜系標記物包括AE2，CFTR，分泌素受體，水通道蛋白或其組合)、成熟膽管或成熟內分泌胰腺(如胰島素，高血糖素，生長抑制激素，淀粉酶)的譜系標記物的缺乏表達或低及可變水平的表達；(vi)間質細胞、內皮細胞或造血細胞的標記物的缺乏表達。在本發明的另一實施例中，提供獲取、分離和/或鑒定能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的方法，其中這些細胞從哺乳動物的膽管樹組織(例如，膽管 樹組織包括門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管、膽囊或其組合)獲得，該方法包括獲取膽管樹組織，然后依次、以任何順序或實質上同時獲取對下述標記物呈陽性的細胞(i)指示早期肝細胞譜系(如HNF6、HES1、CK19、白蛋白或AFP)的至少一標記物；(ii)指示早期胰腺細胞譜系(如H)X1、PR0X1、NGN3或胰島素)的至少一標記物；及非必須地，選自(a)-(c)的至少一標記物(a)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物(如⑶133 (prominin)、⑶44H(透明質酸受體)、N-CAM、CXCR4或EpCAM); (b)指示內胚層干/祖細胞(SOX 9、S0X17或F0XA2)的至少一轉錄因子 '及Ce)多能基因(如S0X2、NAN0G、LF4、0CT4A或0CT4)的中弱表達。還提供鑒定和分離富集哺乳動物專能干/祖細胞的哺乳動物專能細胞群的方法。根據本發明方法，基礎培養基可以是營養物豐富、沒有銅及低鈣(低于O. 5mM)的任何基礎培養基，優選補充胰島素、轉鐵蛋白/Fe、硒、鋅、與血清血蛋白結合的游離脂肪酸，及非必須地，高密度脂蛋白?；A培養基的例子為RPMI 1640。非必須地，這些細胞可在塑料上或涂覆膠原蛋白IV、膠原蛋白III、層粘連蛋白、透明質酸、來自胚胎、胎兒、新生組織或其組合的其它基質成分的塑料上培養。這些細胞培養至少24小時，優選7-21天。根據本發明方法，分離的細胞為80^^90^^95%優選100%富集本發明的干細胞。分離可經免疫選擇技術(如篩選、磁珠選擇、流式細胞計數或其組合)和/或選擇性培養條件進行。在本發明的又一實施例中，增殖和/或擴增新的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞或其同伴細胞(如間質細胞、成血管細胞及星狀細胞前體)的群的方法，包括在塑料或透明質酸上培養這些細胞，或非必須地，在涂覆III或IV型膠原蛋白或透明質酸或來自胎兒、新生或胚性組織的其它基質成分的塑料上，在基礎培養基中不含銅、低鈣(〈O. 5mM)、包含胰島素、轉鐵蛋白/Fe、游離脂肪酸與血清血蛋白結合的混合物，及非必須地，包含高密度脂蛋白。在本發明的另一實施例中，提供新的專能干/祖細胞至成熟肝細胞命運的譜系限制方法。該方法包括(a)獲取包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞懸液，其中這些細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲?。?b)將細胞懸液埋入包括透明質酸或包括與其它基質成分(如IV型膠原蛋白、層粘連蛋白或二者)組合的透明質酸的水凝膠內 '及(C)在補充銅、鈣(彡O. 5mM)、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、bFGF、氫化可的松、高血糖素、半乳糖、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、高密度脂蛋白、及游離脂肪酸與血蛋白結合的混合物的基礎培養基中培養細胞懸液足夠的時間以使它們能分化至肝細胞。在本發明的另一實施例中，提供新的專能干/祖細胞至成熟胰腺細胞命運的譜系限制方法。該方法包括(a)獲取包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞懸液，其 中這些細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲??；(b)將細胞懸液埋入包括透明質酸或包括與其它基質成分組合的透明質酸的水凝膠內 ’及(C)在補充銅、鈣(彡O. 5mM)、B27、抗環血酸、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、bFGF、環巴胺、視黃酸、艾塞那肽-4、高密度脂蛋白、及游離脂肪酸與血蛋白結合的混合物且缺少氫化可的松的基礎培養基中培養細胞懸液足夠的時間以使它們能分化至胰腺細胞。在本發明的另一實施例中，提供新的專能干/祖細胞至成熟膽細胞命運的譜系限制方法。該方法包括(a)獲取包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞懸液，其中這些細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲取；(b)將細胞懸液埋入包括透明質酸或包括與其它基質成分(如I型膠原蛋白)組合的透明質酸的水凝膠內；及((3)在補充銅、鈣(彡O. 5mM)、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、氫化可的松、bFGF、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、高密度脂蛋白、及游離脂肪酸與血蛋白結合的混合物的基礎培養基中培養細胞懸液足夠的時間以使它們能分化至膽管細胞。在本發明的又一實施例中，提供體內分化細胞的方法，包括將哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群按細胞懸液或移植物或移植片移植到肝臟內，具有或沒有先前的、適當培養條件下的譜系限制，在那里它們分化至肝組織。在本發明的又一實施例中，提供體內分化細胞的方法，包括將權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群按細胞懸液或移植物或移植片移植到膽管內，具有或沒有先前的、適當培養條件下的譜系限制，在那里它們分化至膽管樹組織。在本發明的又一實施例中，提供體內分化細胞的方法，包括將權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群按細胞懸液或移植物或移植片移植到胰腺內、腎囊下方或附睪脂墊內，具有或沒有先前的、適當培養條件下的譜系限制，在那里它們分化至功能性胰腺組織。在詳細闡述本發明的至少一實施例之前，應當理解，本發明不受在下面的描述中提出的或圖中所示的構造詳圖及成分安排的限制。除了所描述的以外，本發明能夠以不同的方式實施和實現。同樣，應當理解，在此采用的措詞和術語及摘要均用于描述的目的，而不應視為限制。同樣，本領域的技術人員將意識到，本發明基于其上的概念可容易地用作設計實現本發明的幾個目的的其它結構、方法和系統的基礎。因此，權利要求應視為包括這樣的等效構造，因為它們并未脫離本發明的精神和范圍。


圖I為本發明的、具有分化至幾種類型的內胚層組織的能力的專能膽干細胞的示意圖。所有這些細胞表達“內胚層”(E)轉錄因子(如SOX 9, SOX 17，F0XA2)和干/祖細胞群的其它標記物(表面抗原如⑶133，⑶44H，EpCAM, CXCR4，NCAM)。譜系限制導致不同的成熟命運，包括肝臟、胰腺和膽管樹。圖2為膽管樹的示意圖，示出了其與肝臟、胰腺和十二指腸的連接。在其處可發現高量的膽管周圍腺體、膽管樹的干細胞龕的地方由五角星指示。圖3為膽管樹的不同區域的組織學和免疫組織化學圖像的合成，其用于鑒定標記物和遍及膽管樹的膽管周圍腺體的數量及大小。(a)肝外膽管樹中的膽管周圍腺體(PBG)的分布和特征。PBG存在于膽管樹的管壁中且為膽管樹干/祖細胞的部位。測量(n=5個檢查的人膽管樹)在膽管樹內不同部位處膽管周圍腺體的數量和大小、PBG的標記物輪廓。PBG的密度，表達為PBG腺泡占用的表面除以總面積，通過成像分析進行估計；在人肝外膽管樹的不同部位中組織學上分析數量和圓周。肝胰管壺腹表現出最高密度和數量的PBG ；在膽囊管和門中發現大約相等的數量；在膽管中發現較少；及在膽囊中沒有。*p〈0.01。初始放大倍率xlO。b :原位置的PBG免疫組織化學圖像。PBG對CK7、CK19、NCAM、CD 133、胰島素、EpCAM、S0X9、SOX 17和TOXl呈陽性，但對血蛋白呈陰性(或非常低的水平)。這些早 期譜系標記物的變化(如血蛋白)在多個膽管周圍腺體之中看到(參見圖7關于血蛋白的證據)。初始放大倍率x40。圖4示出了干細胞主要位于膽管周圍腺體(PBG)內。應注意，在單一膽管周圍腺體內表達干細胞標記物(在該例子中為roxi)有可變性。紅色箭頭指示表達轉錄因子的細胞核；黑色箭頭指示未表達轉錄因子的細胞核。圖5示出了膽囊管的膽管周圍腺體中的S0X17(A)和TOXl (B)，連同EpCAM (綠色)和具有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的核染色藍。圖6提供人膽管組織上的免疫組織化學數據并示出了膽囊管和門中的膽管周圍腺體中的EpCAM、SOX 9和SOX 17表達。圖7提供專能膽管樹干細胞的關鍵性質的概覽。這些包括干/祖細胞的表面標記物；內胚層祖細胞的典型轉錄因子；肝臟、膽管樹及胰腺的早期譜系標記物的可變表達；及在圖8中示出了多能基因的中弱表達。肝門的代表性RT-PCR化驗分析指示廣泛的內胚層轉錄因子(SOX 9，SOX 17，F0XA2, PDXl，NGN3等)和典型干/祖細胞表面標記物(如EpCAM,NCAM, CXCR4, CD 133)。圖8示出了通過膽囊管和門組織指示多能基因的表達的RT-PCR數據。它們的中弱表達為膽管樹干細胞自我復制的能力提供另外的證據。多能基因為在胚胎干(ES)細胞中表達的基因且為能夠產生誘導的多能干(iPS)細胞的基因，如果這些基因的變化的組合轉染為體細胞的話。至少5個基因已被鑒定0CT 4、S0X2、NAN0G、KLF4和c_MYC。對于OCT
4、S0X2、NANOG、KLF4，表達的中弱水平發生在膽管樹組織中和分離的膽管樹干細胞中，但對c-MYC并非如此。圖9，膽囊不包含膽管周圍腺體(如圖3中所示)。然而，表達部分干/祖細胞轉錄因子和表面標記物的細胞存在于膽囊細胞中。應注意，指示所化驗的標記物(EpCAM或roXl)的表達的呈褐色染色出現在膽囊表面的細胞中。圖10示出了沒有膽管周圍腺體的膽囊組織的免疫組織化學數據。(a，c，d)。這些細胞對EpCAM呈陽性(綠色)及對于內胚層轉錄因子具有核周染色(所示為S0X17-紅色)。(b)這些細胞也表達roxi (粉紅色)且按Ki67染色所示明顯增殖(綠色)。圖11，來自膽管樹組織的干/祖細胞集落。細胞在無血清Kubota培養基中及培養塑料上進行分離和培養。三種不同的集落類型即類型1-3在對成熟細胞不允許相反對內胚層干/祖細胞選擇的條件下進行觀察。免疫組織化學染色按標記物標示的顏色指示特定基因。所有切片均用提供指示核的藍色的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。集落類型I (a)聚集強表達EpCAM、NCAM和ASBT的細胞。這些細胞生長緩慢(每3_4天或更長時間才分裂)。集落類型2細胞(b)具有與hHpSC極類似的顯型及具有100%的EpCAM、NCAM細胞表達但不表達AFP (每36-40小時分裂)。集落類型3 (c)由波動旋渦細胞組成，其在集落邊緣處具有EpCAM表達但在集落內部沒有及在內部細胞中具有高水平的SOX 17,PDXl或SOX 9表達(每36-40小時分裂)。所有圖像的放大倍率為20倍。這些圖片為從集落被監視4-8周的、10個以上實驗中找到的代表圖片。
集落類型2和3的細胞之間的關系的證據在低放大倍率(4倍)圖像(d)中示出。不知道一個是否為另一個的前體。RT-PCR化驗分析指示來自膽囊管對來自膽囊的集落中的不同基因的表達。兩個組織的RT-PCR化驗分析非常類似，但來自膽囊管的組織具有白蛋白和胰島素弱表達，兩個基因未被從膽囊取得并在無血清Kubota培養基中和塑料上生長的祖細胞表達。圖12，膽管樹干細胞，尤其類型2和3集落的膽管樹干細胞，穩定擴增幾個月，從而導致細胞集落具有穩定的干/祖細胞標記物表達。這是細胞自我復制的部分證據；另外的證據由多能基因的表達提供(圖8)。在此示出了類型3的集落維持培養一個月后集落中心處的細胞中I3DXl的表達(橙/紅)及在集落邊緣處僅表達EpCAM (綠)，所在部位稍有區別。DAPI染色(藍)指示細胞核。圖13，在培養塑料上及無血清Kubota培養基中培養8周以上的膽管樹干細胞集落的相顯微圖。該集落從取自成人膽管樹組織的1-2個細胞開始。為估計該集落內的細胞數量，從該集落的多個區域(代表性區域為彩色邊框劃分的矩形區域)準備放大的圖像，及這些區域用Metamorph軟件成像并用于獲得細胞數量。這些區域的采樣導致集落中有500000個以上細胞的估計量。從胎兒膽管樹組織，常規觀察到>50個這樣的集落；從成人的膽囊管和門組織，常規獲得>100個這樣的集落。圖14，組織(原位)中或膽管樹干細胞的培養物中轉錄因子(或端粒酶蛋白)的位置。免疫組織化學表明轉錄因子和端粒酶蛋白存在于一些細胞的細胞核內，而在其它細胞中存在于細胞核周圍或細胞質中。其意義尚不知道，盡管我們假定核定位暗示起作用的因子及核周或細胞質位置為儲存形式。在這些圖像中，S0X17表達在體內膽管周圍腺體的部分但不是所有細胞的核內(原位數據)及表達在在塑料上和Kubota培養基中培養的所有膽管樹干細胞的核內。在培養物的圖像中，細胞核因DAPI染色而為藍色；一些細胞表達EpCAM(綠);但所有細胞均具有S0X17的細胞核內定位(紅)。當合并圖像時，細胞核顯現粉紅色(藍色和紅色的混合顏色)。圖15，膽管樹干細胞的類型3集落顯示轉錄因子、S0X17 (紅/粉紅)的核和核周定位。在集落周邊處的細胞對EpCAM呈陽性(綠)。細胞核因DAPI染成藍色。圖16，膽囊細胞的原位染色僅顯示S0X17的核周和細胞質染色(紅/橙)。細胞膜對EpCAM呈陽性(綠)，及細胞核因DAPI染成藍色。
圖17，膽管樹干細胞的專能性。激素確定的培養基(HDM)獨自對分化至肝細胞或膽管細胞命運的影響。如果在塑料上和Kubota培養基中培養，干細胞無限期地保留為干/祖細胞。如果培養基改成為成熟命運改變的HDM，它們將朝向成熟命運分化。如果HDM的使用與細胞在細胞外基質上平皿培養或將細胞埋入細胞外基質內結合(圖20-22)，它們將更快且更有效率地分化至成熟命運。在這些研究中，展現了表明特定HDM對膽管樹干/祖細胞朝向肝細胞(HDM-L)對膽管細胞(HDM-C)命運分化的影響的代表性數據。來自在自我復制條件(培養塑料和無血清Kubota培養基或其等價物)下培養的集落的膽管樹干/祖細胞在為肝細胞(HDM-L)改變的HDM中(上排圖像)或為膽管細胞(HDM-C)改變的HDM中(下排圖像)。HDM-L影響7天后免疫熒光(a)。細胞對CK18 (紅)和/或血蛋白(藍-綠)廣泛呈陽性。放大倍率20X。半定量數據(c)比較自我復制條件下(分0)對HDM-L (分2. 2±0.8)的肝細胞數量(CK18+/白蛋白+細胞)，發現>20%的細胞具有至肝細胞命運的譜系限制。HDM-C影響7天后免疫熒光(b)。細胞對CK7、分泌素受體(SR)和CFTR廣泛呈陽性。它們共表達CK7/SR和CK7/CFTR。除c4和c5為40倍以外，初始放大倍率均為20倍。自我復制條件下(O. 2±0. 4;細胞的〈5% WiHDM-C (3±0. 7，這 相當于細胞的30%以上具有至膽管細胞的譜系限制)的SR+/CFTR+細胞的百分比半定量估計量(C)。圖18，膽管樹干細胞的專能性。針對胰腺改變的HDM(HDM-P)獨自對分化至胰腺命運的影響。HDM-P影響在HDM-P中培養7天后對胰腺標記物進行免疫熒光。在集落的周邊處，出現的細胞聚集和凝縮形成包含C肽(a，b), PDX-I (c)和胰島素⑷的小島狀結構(a-d)。在集落中心內發現未分化細胞(EpCAM+細胞)。初始放大倍率為20倍。在自我復制條件下發現的小島狀結構的數量(f)(l±0.7;細胞的〈10%)遠低于HDM-P情形的數量(3.8±1.3 ;細胞的 40% )。在所有RPMI 1640配方(11. ImM)中孵育2小時后在多個葡萄糖濃度下發現的蛋白質的按ng/μ g計的C肽水平(g)，在自我復制條件下為4. 5 ±2. 25ng/y g，而在HDM-P情形為12. 3±1. 9ng/μ g。數據表示為均值土標準誤差，N=4 ；*p〈0. 05。(h)葡萄糖刺激的C肽分泌物在HDM-P控制下進行觀察，即觀察培養基中的C肽水平(μ g/1)，從低葡萄糖水平(5. 5mM)下的I. 10±0. 32 μ g/Ι到高葡萄糖水平(22mM)下的 I. 92±0· 43 μ g/Ι, η=7 ;*ρ〈0· 01。圖19，膽管樹干細胞的專能性。培養基獨自的影響的定量(q)-RT-PCR分析。對維持在自我復制條件下(培養塑料和Kubota培養基)對單為肝細胞、膽管細胞或胰腺細胞改變的無血清HDM (HDM - L、HDM-C或HDM-P)下的膽管樹干細胞培養物進行化驗分析。mRNA相對表達水平通過對以三個最穩定的管家基因的幾何平均為基礎的歸一化ACt值排序而進行計算。數據被標示加或減(±)標準偏差。這些中的每一個的顯著性水平為*p〈0. 05。η=進行的實驗的次數。圖20，膽管樹干細胞的專能性。HDM和細胞外基質成分對膽管樹干細胞分化的影響。膽管樹干細胞在塑料上和Kubota培養基或其等價物中(自我復制條件)培養一個月以上，導致如(a)中的集落。該代表性集落被驅散，細胞轉移到3個分化條件之一，以三維(3-D)形式存在并由為所希望的成熟命運改變的HDM+基質成分組成為膽管細胞(b)、肝細胞(C)、或為胰腺β細胞(d)。它們在培養物中培養長達9天，然后化驗組織特異性命運，其表明這些膽管樹干細胞根據培養條件可譜系限制至多個成熟命運(在此提供膽管細胞、肝細胞或胰腺β細胞的例子)。第3排=雙硫腙(DTZ)染色(胰腺α和β細胞的指示)。D=培養天數；Glu=高血糖素；C-P=C肽，胰島素分泌物的指示。圖21，在自我復制條件下(a-b)對為產生成熟肝細胞的3_D分化條件下(c_d)膽管樹干細胞的透射電子顯微圖。存在大的多角形細胞，及細胞核顯現一個或多個核。(C)相鄰的細胞形成清晰可辨的毛細膽管(箭)。毛細膽管由聯結復合體(箭頭)封閉。很少的微絨毛出現在腔中(d)。因此，這些細胞能夠長成成熟肝細胞和肝內膽管細胞。圖22，由自我復制對3-D分化條件下培養物的定量(q) -RT-PCR分析給出的膽管樹干/祖細胞的專能性的證據。a.膽管樹干/祖細胞在Kubota培養基中和塑料上培養2個月(自我復制條件)。集落或維持在這些條件下從而產生膽管干/祖細胞(BP)，或轉移到針對肝細胞(B-L)、膽管細胞(B-C)或胰島(B-P)的3-D分化條件，全部均另外培養2周。然后，準備培養物進行相應于每一成熟命運的基因qRT-PCR分析。數據準備為柱狀圖，其中在自我復制條件下(BP)的基因表達水平由值I. O給出，在分化至成熟命運之后細胞中每一基因的值定為相對于BP下的該值的倍數變化。一些柱狀圖上的星號表明那些柱狀圖具有統 計顯著性(P〈0.01或P〈0.001)。N=2，每一實驗具有一式三份樣本。BP=膽管干/祖細胞；B-C=譜系限制至膽管的細胞(膽管細胞)；B-L=譜系限制至肝臟的細胞(肝細胞)；B-P=譜系限制至胰腺的細胞(小島)?；灥幕驗镚GTl= Y谷氨酰轉移酶-I M2=陰離子交換蛋白2 ；CFTR=囊性纖維化跨膜轉運調節因子；HNF4a=肝細胞細胞核因子4A ；AFP= α -胎蛋白；ALB=白蛋白；TF=轉鐵蛋白；TAT=酪氨酸轉氨酶；CYP3A4=細胞色素P4503A4 ；pdxl=胰腺和十二指腸同源框I ;ISL-I=ISL LIM同源框I ;NGN3=神經元素3 ；INS=胰島素；GCG=高血糖素。圖23，體內研究表明的膽管樹干細胞的專能性肝命運。膽管樹干細胞在自我復制條件下的培養物中(Kubota培養基或其等價物及培養塑料)培養，然后注入具有靜息肝的免疫減弱的成年鼠的肝內(即不引起肝損傷)。從該鼠制備的肝切片然后通過免疫組織化學針對指示肝細胞的人特異標記物進行分析。在該圖像中，該切片針對Dako的人肝-I抗體染色。這些切片表明可鑒定人肝細胞占用的總面積的6. 52±2. 5%對典型的肝細胞標記物人肝-I呈陽性。圖24，體內移植表明的膽管樹干細胞的專能性膽管樹命運。膽管樹干細胞在自我復制條件下的培養物中(Kubota培養基或其等價物及培養塑料)培養，然后注入具有靜息肝的免疫減弱的成年鼠的肝內(即不引起肝損傷)。從該鼠制備的肝切片然后通過免疫組織化學針對指示膽管細胞的人特異標記物進行分析。Dako的人CK7抗體，膽管細胞標記物，被發現所有膽管細胞平均12. 7±5. 5%對其呈陽性。比較小膽管和大膽管中的人膽管細胞的證據，發現大膽管中 14. 92±5. 9%的細胞對人CK7呈陽性及小膽管中 5. 02±1. 95%的細胞對人CK7呈陽性。圖25，由體內移植表明的膽管樹干細胞的專能性胰腺命運。膽管樹干細胞在自我復制條件下的培養物中(Kubota培養基或其等價物及培養塑料)培養，然后注入雄性Balb/C Rag2^I12rg^鼠的附睪脂墊(EFP)內。每一只鼠被注入200-400個新島，在HDM-P+包含透明質酸、IV型膠原蛋白和層粘連蛋白的水凝膠的3-D分化條件下膽管樹干細胞的細胞集合體朝向胰島命運譜系限制7-14天。每一新島由1000個以上的細胞組成。控制鼠被移植沒有細胞的Matrigel。每日監測鼠的葡萄糖水平且其血糖過多(600_750mg/dl)約3個月。到3個月結束時，移植過的老鼠中的葡萄糖水平下降到低于控制情形的一半的水平。在術后第68天和第91天進行葡萄糖耐量試驗，表明在實驗鼠中具有可觀的血液人C肽水平，及這些水平可通過葡萄糖調節。
具體實施例方式本發明源自此前意想不到的、專能干細胞或祖細胞及包括前述專能干細胞或祖細胞的細胞群的發現，其在膽管樹內發現并具有分化至多個內胚層譜系包括肝、胰腺和膽管樹譜系的能力(圖I)。為使本申請清晰，術語“膽管樹干細胞”在此將用于指創新的哺乳動物專能干細胞或祖細胞、包括前述創新細胞的細胞群、及富集前述創新細胞的細胞群。新的專能膽管樹干細胞可從膽管樹組織的任何部分分離，但尤其在膽管周圍腺體中及膽管樹的分支點處發現高數量的專能膽管樹干細胞，其在圖2的示意圖像上以星號指示。在肝內的最小分支末端上發現的星號指肝閏管，肝內肝干細胞的干細胞龕。膽管樹干細胞為肝內肝干細胞的前體?！ぜ氹詠碓?昍管樹膽管樹或肝外膽管樹系統由將十二指腸連接到肝、胰腺及包括膽囊的一系列管組成(參見圖2中的示意圖)。膽管周圍腺體(圖3-11)遍及膽管樹的管壁內，尤其可在分支部位如門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管和膽囊處發現高數量的膽管周圍腺體。來自肝或腹胰的液體經乏特壺腹清空到十二指腸內。這整組結構，包括膽囊，在此稱為膽管樹。膽管樹的所有組成部分(如門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管和膽囊)均具有由密集的纖維結締組織和腔組成的壁，腔襯以一層由常規基膜支撐的高度柱狀的膽管上皮。平滑肌細胞沿管尤其在乏特壺腹附近分散。偶爾在管壁中發現血管、神經纖維和一些淋巴樣細胞。沿膽管樹的整個長度發現膽管周圍腺體，尤其在肝胰總管和門、肝總管、膽囊管、總管及膽囊中發現高數量的膽管周圍腺體。圖3-7。膽囊具有不同的特征(圖9、10)。腔襯以柱狀上皮、適當的肌肉層和漿膜下結締組織。在膽囊中不存在膽管周圍腺體(圖3、9)。然而，膽囊具有與膽管周圍腺體內發現的膽管樹干細胞群的那些短暫擴充細胞和/或定向祖細胞具有重疊顯型的細胞。本發明的細胞可從任何發育階段的膽管樹組織分離。因而，本發明可用胎兒、新生兒、小兒或成人組織實施，包括來自最近死亡的個體的組織(優選地，在10小時內，但本發明創新的細胞在死亡后長達72小時均保持可進行分離)。實際上，膽管樹組織很獨特，因為其易從胎兒、小兒及成年供體獲得。此外，本發明可用來自肝和胰腺器官的組織實施，其為移植而取得但之后被排斥，或來自活檢組織、來自切除組織。同樣，在此給出的教導并不限于任一哺乳動物種類。實際上，應當理解，在此提供的例子僅為示例性的，不應視為限制。這樣，本發明不受膽管樹組織的哺乳動物源限制。可從其取得膽管樹干細胞的哺乳動物包括但不限于人、嚙齒目動物(如大老鼠、小老鼠、倉鼠)、兔子、牛、馬、豬、羊、狗和貓。優選地，膽管樹干細胞采自人以用于人類。如已提及的，本發明的新類的膽管樹干細胞可分化至多個內胚層命運。實際上，本發明的膽管樹干細胞可被誘導分化至成熟細胞類型的幾個內胚層譜系，包括肝、膽管樹和胰腺。圖17-25。膽管樹組織的樣本可因移植而從肝或胰腺通過外科手術解剖取得，之后由于脂肪變性、解剖異常或主血管病而被排斥；或它們可從切除材料取得。它們可來自因不同原因切除的膽囊。膽管樹組織可與腹部的結締組織分開。之后，該組織分成多段并進行進一步處理。其中膽管樹干細胞尤其豐富的段包括門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管和膽囊。每一部分可沿縱向直徑切割而進一步解剖為多片。膽管樹干細胞已展現導致包括肝、膽管樹和胰腺細胞的多個內胚層命運(圖17-25)。膽管樹干細胞表達端粒酶蛋白；中低水平的多能基因(Nanog、S0X2、KLF4和0CT4—圖8);典型的內胚層轉錄因子(如SOX 17、S0X9、F0XA2、HNF6、PROXU HNF3B(肝細胞核因子_3B(a. k. a. F0XA2)、SALL4(Sal類蛋白4)、PDX I和NGN3);內胚層表面標記物(⑶326/上皮細胞黏附分子或EpCAM KD56/神經元細胞黏附分子或NCAM) ；CXCR4 ;及幾個干/祖細胞基因(如CD44H—透明質酸受體，及CD133，也稱為prominin)。圖7、8、9、13。此外，表面上由于它們的專能性，膽管樹干細胞表達低且可變水平的肝早期譜系標記物(如HNF6、HES1、F0XA2和可變白蛋白)、膽管早期譜系標記物(如細胞角蛋白19)和內分泌胰腺早期譜系標記物(如^ 1、如吧、5八1^4、胰島素)。圖7、22。應注意，膽管樹干細胞表達轉錄因子roXl和NGN3(圖3、4、7、11)，已知分別對胰腺·和內分泌胰腺的發育必不可少。然而，膽管樹干細胞不表達或僅弱表達膽管細胞(如分泌素受體、水通道蛋白)、肝細胞(如白蛋白、酪氨酸轉氨酶或TAT、轉鐵蛋白、“晚期”P450如P450-3A4)或胰島細胞(如高血糖素、生長抑制激素、淀粉酶或高水平的胰島素)的成熟標記物(圖3、7、13)。它們根本不表達間質細胞(如⑶146、結蛋白)、內皮細胞(如VEGF受體、⑶31、Van Willebrand因子)或造血細胞(如⑶45)。只要它們維持在由Kubota培養基或其等價物組成并具有培養塑料或透明質酸底層的自我復制條件下，抗原的表達模式在培養物的壽命期間穩定。這些表達模式可使用新分離的細胞或培養的細胞的端點和定量(q)-RT-PCR化驗分析及通過體內組織的免疫組織化學進行確定。內胚層干/祖細胞的多個標記物(如S0X9、S0X17、roxi、NGN3、F0XA2)在同一膽管周圍腺體內的細胞中的共表達是獨一無二且令人驚訝的特征，其不同于關于經歷譜系限制至胰腺的胚胎干(ES)細胞的結果，其中這些轉錄因子依次進行觀察，而非所有轉錄因子同時觀察。此外，在膽管的腔表面處的成熟膽管細胞中不存在這些轉錄因子的表達。如上所述，本發明的膽管樹干細胞為將長成內胚層組織的祖細胞并與它們可引起的多個組織的細胞共享標記物，前述多個組織包括肝、膽管樹和胰腺。除了它們的相對表達水平之外，膽管樹干細胞內表達的端粒酶和轉錄因子(如SOX
17、PDX1)的細胞定位在成熟期間從核定位變為核周/細胞質定位(參見圖7及圖14-16)。在單一膽管周圍腺體內，觀察到具有核的一些細胞及具有核周定位或不表達特定標記物的一些細胞(圖4、6、7、14)。不受限于理論，核內定位相較轉錄因子核周定位情形與更多的原胞相關聯。后者的細胞假定轉變到隨后的譜系階段。作為備選，核周定位可表明該因子處于不活動的儲存形式，其在適當的再生需求下可轉移到細胞核。本發明提供分離和增殖膽管樹干細胞的技術。來自人膽管樹組織的干細胞群通過培養選擇技術進行鑒定，但也可通過免疫選擇技術(如流式細胞計、篩選、磁珠分離)進行分離。作為備選，或除了免疫選擇之外，本發明的膽管樹干細胞可借助于組織培養條件分離。例如，從膽管樹組織制得的細胞懸液可放在塑料或透明質酸上而制成顯微片。在其它實施例中，塑料非必須地涂覆膠原蛋白IV、膠原蛋白III、層粘連蛋白、透明質酸、胚胎/胎兒組織中發現的其它基質成分、或其組合。用于培養選擇的培養基，無血清Kubota培養基或其等價物，對于膽管樹干細胞及其同伴間質細胞、成血管細胞和星狀細胞前體強烈選擇該培養基，但對于膽管樹的成熟細胞不選擇給培養基。該培養基的實質在于其為不包含銅、低鈣(〈O. 5mM)、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、與純化血蛋白結合的游離脂肪酸、及(非必須地)高密度脂蛋白的任何基礎培養基。Kubota培養基或其等價物無血清且僅包含純化和規定的激素類、生長因子和營養物的混合。更具體地，該培養基由無血清基礎培養基(如RPMI 1640)組成，其不包含銅、低隹丐(〈O. 5mM)、補充有胰島素(5 μ g/ml)、轉鐵蛋白/Fe (5 μ g/ml)、高密度脂蛋白(10 μ g/ml)、硒(ΙΟ,Μ)、鋅(10_12Μ)、煙酰胺(5 μ g/ml)、及游離脂肪酸與純化血蛋白結合的混合物。制備該培養基的詳細方法已在別處公開，例如Kubota H, Reid LM, Proceedings of theNational Academy of Sciences (USA) 2000; 97:12132-12137，其公開內容通過引用全部組合于此。 這些條件產生快速生長幾周(8周以上)的膽管樹干細胞集落，增殖率估計為每36-40小時分裂一次。圖11-13。培養物能夠穩定地保留干/祖細胞經歷自我復制的證據8周以上(圖13)。該自我復制證據還得到多能基因的中弱水平的表達結果的支持。圖8。獲得的集落數量在來自具有大量膽管周圍腺體的膽管樹部分的培養物中最高，在來自膽管樹分支點之外的部位或來自沒有膽管周圍腺體的膽囊的培養物中中等。譜系限制和分化至成熟命運與膽管樹干細胞的專能性一致，如果集落在自我復制條件下培養幾周(如在培養物中培養一個月以上)然后培養基改為針對特定成熟細胞類型改變的無血清、激素限定的培養基(HDM)，細胞將部分朝向指定的成熟細胞類型分化(圖17-19)。在用于肝的HDM中(HDM-L)，20-30%的細胞獲得細胞角蛋白8和18及白蛋白的表達；而在用于膽管細胞的HDM (HDM-C)中，一半以上長成表達分泌素受體和CFTR的細胞。圖17。從使用定量RT-PCR的化驗分析可以看出(圖19)，在HDM-L培養物中人白蛋白的表達水平及HDM-C培養物中分泌素受體的表達均明顯高于Kubota培養基或其等價物(自我復制條件)中的表達。如果膽管樹干細胞在用于胰腺的HDM (HDM-P)中進行培養，則出現細胞朝向胰島命運的部分譜系限制。圖18。分化主要出現在集落邊緣處，在其處形成細胞集合體及在其內發現人C肽、PDXl和胰島素的部位。一半以上的細胞集落獲得產生人C肽的能力(圖18h和18g)，這指示人胰島素合成，及該C肽合成可通過葡萄糖水平調節(圖18h)。所產生的人胰島素水平在HDM-P培養物中明顯高于保持為干細胞自我復制條件的培養物中的水平(圖19)。 如果細胞放到由特定HDM (HDM-L, HDM-C, HDM-P)組成的獨特3-D分化條件下并結合將細胞埋入包含針對感興趣的成熟細胞類型改變的特定細胞外基質成分的水凝膠中，專能程度得以更引人注目地證明(圖20)。細胞快速(如7-10天)分化至特定成熟細胞類型，在與包含IV型膠原蛋白和層粘連蛋白的透明質酸水凝膠結合的HDM-L中產生肝細胞索；在與包含I型膠原蛋白的透明質酸水凝膠結合的HDM-C中產生分支膽管即膽管樹；或如果在HDM-P中及在包含IV型膠原蛋白和層粘連蛋白的水凝膠中產生胰島(內分泌胰腺)。在3-D培養條件下分化的另一證據通過自我復制條件下的膽管樹干細胞(圖21，a和b)與為肝細胞改變的條件(圖21，c和d)的對比發現，并通過透射電子顯微鏡術表征。自我復制條件下的膽管樹干細胞(a-b)對肝細胞(c-d)的透射電子顯微鏡檢查。在分化條件下，存在大的多角形細胞，及細胞核展現一個或多個核。相鄰細胞形成清晰可辨的膽小管(箭)。膽小管由聯絡復合體(箭頭)封閉。少量微絨毛存在于腔中。圖中的條等于2μπι。分化條件導致功能性成熟細胞的證據在圖22中提供，其包含來自產生膽管干/祖細胞(BP)的自我復制條件下的培養物對針對肝(B-L)、膽管樹/膽管細胞(B-C)或胰腺(B-P)的3-D條件下的培養物的定量RT-PCR數據。第一排表明，在針對肝的條件下而非針對干/祖細胞或膽管樹或胰腺的條件下的培養物中，典型肝基因的HNF4、AFP、白蛋白、酪氨酸轉氨酶(TAT)、轉鐵蛋白(TF)或P450-3A4的表達戲劇性增加。相反，針對胰腺的條件下的數據(第二排)表明，在針對胰腺的條件下(B-P)而非針對干/祖細胞或肝或膽管樹的條件下，PDX-1、ISL-1、NGN3、胰島素、高血糖素(GCG)的基因表達極為顯著的增加。針對膽管樹的條件下的數據證明GGT1、AE2、CFTR的表達增加。膽管樹干細胞的培養物在自我復制條件下再次轉變，維持EpCAM的高水平和所有成熟特異性基因的低水平。該專能性也在細胞體內移植時得以證明(圖23-25)。人膽管樹干細胞移植到免疫 減弱的老鼠內，然后評估組織中移植的成熟人細胞的存在。即使在具有休眠狀態肝臟的老鼠中，其未遭受肝傷害，細胞能夠移植并長成為大量肝細胞(圖23)和膽管細胞(圖24)。此夕卜，移植了驅動至胰腺命運的細胞的老鼠接受使它們患糖尿病的藥物，移植的細胞能夠使它們從糖尿病條件復原，這些細胞被證明在產生人C肽方面受葡萄糖水平控制(圖25)。盡管多個前體已鑒定和表明分化至成熟肝細胞，但本申請中鑒定的、存在于胎兒、嬰兒、小兒和成人組織中的膽管樹干細胞為迄今鑒定的、可從成人組織分離并證明能分化至成熟胰腺細胞類型的第一干細胞和細胞群。這些細胞也是首次鑒定的、可立即用在糖尿病臨床程序中的細胞，這歸因于其已得以證明的能分化至胰島細胞的能力、其沒有致瘤可能性(像ES細胞或用對分化至胰腺至關重要的基因轉染的細胞存在的那樣)、及沒有免疫原性。膽管樹干細胞為胰腺的天然前體及通過使用特定微環境條件即可容易和快速地(在培養物中幾天內)分化至胰腺命運。此外，由于所需要的微環境條件可以GMP形式獲得且現在為現存臨床治療的一部分，這也有助于過渡到臨床。因此，至少一臨床應用為在此所述的膽管樹干細胞用于完全或部分再增、搶救、支持、修復、替代或引入胰腺β類細胞以治療糖尿病(圖25)，或用于肝功能衰竭、不足或退化的形式(圖23和24)。對于本領域一般技術人員而言，在此公開的膽管樹干細胞在臨床治療時具有多個應用顯而易見。膽管樹干細胞的獲得可為相對非侵害的程序及對患者相對無害。體外增殖這些膽管干細胞的能力有助于為臨床程序獲得足夠細胞的能力(如IO6-IO9個細胞)。細胞療法所需要的干細胞數量易于在在細胞按圖13中所示取得、處理和培養后的幾周內產生。用于治療的膽管樹干細胞可從特定供體取得然后回到同一人內，由于細胞和接受者遺傳學上相同，構成在細胞排斥方面沒有免疫學問題的自體治療。作為備選，用于治療的膽管樹干細胞或細胞群也可從特定供體取得然后給予另一人，由于膽管樹干細胞不產生免疫性或產生最低限度的免疫性，構成同種異體治療。最后，根據本發明的膽管樹干細胞在動物實驗中及在培養物中在致瘤可能性方面相對無風險。在迄今的所有體內研究中，尚未有致瘤可能性的證據。
在本發明的另一實施例中，膽管樹干細胞或細胞群用于體外產生目標內胚層細胞和目標內胚層組織(如胰腺、肝、膽管)。因而，本發明提供和包括從膽管樹干細胞或細胞群產生“目標”細胞和組織的方法，該方法包括分離膽管樹干細胞、在驅動它們分化至目標組織或該組織的細胞的條件下繁殖、及將這些細胞引入需要其的患者中。因此，通過根據本發明的膽管樹干細胞的分化獲得的、分化的組織細胞也是本發明的主題。如上所述及如圖14-16中所示，根據本發明，對于膽管樹干細胞朝向特定成熟命運的部分分化，可使用包含營養物、激素類和生長因子的特定混合的限定培養基(也稱為激素限定的培養基或HDM)，理想地，無血清且為驅動細胞至感興趣的成熟命運而改變。用于肝細胞、膽管細胞對胰島的代表性HDM在下面給出。HDM獨自引出朝向所希望成熟命運的一些譜系限制但不引出全部分化。全部分化出現在體內移植之后，或者，如果細胞在體外，還需要使用特定的HDM與細胞外基質成分的混合物結合，混合物的精確組成對所希望的成熟細胞類型獨一無二，及這些細胞必須以在此所述的三維格式建立。圖17-19。
根據本發明的膽管樹干細胞或細胞群的體內分化的特別優選的形式為通過膽管樹干細胞或細胞群的移植方法注入、輸入或移植到身體的一區域內，以使膽管樹干細胞能在那里分化，通過與目標譜系的細胞直接接觸或膽管樹干細胞或細胞群的輸注，使膽管樹干細胞或細胞群能到達目標組織。對于注入或輸入，膽管樹干細胞可在與其相容的培養基如Kubota培養基(或其等價物)或HDM之一中進行輸注，或在由與其相容的基質成分組成的條件下的移植物中。治療應用根據本發明，對于可從膽管樹干細胞或細胞群獲得的目標細胞的治療用途，多個概念可用(參見Science 287; 1442-1446，2000)，這些概念包括在本發明中。關于這一點，相應指示的例子為先天性代謝缺陷、肝功能衰竭、肝硬化、胰功能不全及糖尿病。膽管樹干細胞或細胞群可直接引入將要再造、復原或修復的器官之內或之上。引入可按細胞懸液、按由膽管樹干細胞或細胞群連同HDM組合到細胞外基質成分的混合物中組成的移植物、或按其他類型的支架(如微載體、聚交酯)、或按輸入進行。支架優選可生物分解，使得它們從身體“消失”，同時新引入的細胞或細胞群連同現有細胞一起生長。優選通過自體移植以這種方式再造、搶救、支持、修復、替代或引入細胞，包括胰島細胞或其他胰腺細胞、肝細胞、和膽管細胞或其他膽管樹細胞。再造、搶救、修復、支持、替代或引入可在損傷后修復或支持用器官的部分外科手術切除之后，例如在器官功能缺乏或不全的情形下。根據本發明的膽管樹干細胞或細胞群及從它們獲得的目標細胞可進一步與可植入材料結合，以增加生物相容性。因此，當被覆有膽管樹干細胞時，可植入材料也是本發明的主題?？芍踩氩牧弦部梢允侨嗽旌?或生物載體或支承材料，其包含膽管樹干細胞或細胞群和/或源自其的目標細胞。載體材料或支承材料可以是用于插入或植入人體內的微載體、支撐物、容器或室。在本發明的一前述實施例中，具有源自膽管樹干細胞或細胞群的胰島細胞的容器用于產生制藥結構，用作人造胰島細胞入口室以在體內提供胰島素。在本發明的另一實施例中，膽管樹干細胞或細胞群的輸入或移植用于在體內再造、搶救、修復、支持、替代或引入胰島或胰島細胞。對源自本發明膽管樹干細胞的肝細胞或膽管細胞，可制造類似的結構。此外，從根據本發明的膽管樹干細胞獲得的目標細胞或細胞群可用作生物反應器(如身體外部)中的細胞培養物，例如以完成解毒反應或產生通常由目標細胞或組織在體內產生的物質。在急性情形下，例如在急性肝功能衰竭而使用生物人工肝或嚴重糖尿病而使用生物人工內分泌胰腺的情形，上述形式的使用特別適宜。最后，根據本發明的專能膽管樹干細胞或細胞群可廣泛應用于轉基因修飾和治療。根據本發明的一實施例，膽管樹干細胞或從其分化的細胞或組織用一個或多個基因轉染。這樣，維持某些器官如肝臟或胰腺的新陳代謝所需要的一個或多個基因被再生和/或供養或再引入。例如，干細胞或肝細胞可用FAH (延胡索酰乙酰乙酸水解酶)基因轉染。在缺乏FAH的老鼠中，脾內注入1000個FAH陽性供體肝細胞足以完全還原肝臟并完全補償導致肝硬變的新陳代謝缺陷。Overturf, K.，M. Al-Dhalimy, C. -N. 0u, M. Finegold, andΜ· Grompe. American Journal of Pathology 151:1273-1280(1997)。作為備選，膽管樹干細胞或細胞群可從特定供體取得并供給另一人，構成異基因治療，以在受體中還原、供養或引入維持某些器官如肝臟或胰腺的新陳代謝所需要的一個或多個基因。下面的例子用于說明本發明，但本發明絕不限于這些具體的例子。本領域技術人員將在這些例子中發現實施本發明的其它手段。此外，在這些例子為實驗方便而在非人類 背景中呈現的同時，本領域技術人員從下面公開的教導很容易將在此所述的方法和試劑轉移到人類應用。例子例I-細朐制各酶離解可在存在蛋白酶如膠原蛋白酶和/或核酸酶如脫氧核糖核酸酶時完成。肝細胞的酶離解方法已在本領域描述和實施。作為例子，肝祖細胞的分離和鑒定方法已在USP6，069，005和USP 09/487，318、10/135，700及10/387，547中描述，其公開內容通過引用全部組合于此。實際上，用于制備細胞懸液的多個程序存在。因此，應當理解，本發明的范圍不限于取得整個組織或制備其細胞懸液的具體方法。例II-3D培養條件3維(3-D)凝膠可通過將基質成分、激素類、細胞活素類、生長因子、營養物及基礎培養基混合為透明質酸而形成，其在未交聯時為液體及在交聯時變成凝膠。這些的制備細節在別處公開，如W. S. Turner,E. Schmelzer,R. McClelland et al. , J Biomed Mater Res BAppl Biomater 82B (I), 156 (2006);及 W. S. Turner, C. Seagle, J. A. Galanko et al. , StemCells 26(6) ,1547(2008)，其公開內容通過引用全部組合于此。培養物通常維持2_4周或更長時間，之后通過組織學、基因表達化驗如端點和定量RT-PCR、免疫熒光、和蛋白質表達化驗如蛋白印跡法及代謝足跡法進行分析。凝膠復合物的主要成分為化學改性透明質酸的形式。Carbylan-S (或CMHA-S)為羧甲基化透明質酸衍生物，為了交聯其已用多個硫醇改性。所有材料均至少可從GlycosanBiosciences (猶他州,鹽湖城)購得。簡要地，在一實施例中，通過將作為干試劑的透明質酸溶解在Kubota培養基中以得到2. 0%溶液(重量/體積)而制備透明質酸基質。之后，可添加I. 5mg/ml濃度的層粘連蛋白(Sigma, St. Louis,Mo)和 6mg/ml 濃度的 IV 型膠原蛋白(Becton Dickenson,Bedford,Ma)。在暴露給空氣中的氧時交聯在室溫下在數小時內出現，或者如果暴露給交聯試劑如PEGDA (聚乙二醇二丙烯酸酯)，交聯在數分鐘內出現。這樣，如果不希望交聯，溶液應保持在4°C冷藏并避免與氧和/或PEGDA接觸。在完成實驗后，細胞可通過提煉水凝膠進行恢復，其首先用在Kubota培養基中制備的透明質酸酶(lmg/ml)、脫氧核糖核酸酶(O. 5mg/ml)和二硫蘇糖醇(40mgs/ml)的混合(沒有轉鐵蛋白)，之后用在Kubota培養基中制備的釋放酶(O. 5mg/ml)但沒有胰島素和轉鐵蛋白。以這種方式獲得的細胞適合通過流式細胞計、RT-PCR或免疫組織化學表征。例III-專能件證據在自我復制條件下(Kubota培養基或其等價物，與培養塑料或透明質酸結合)培養膽管樹干細胞或細胞群7-30天或更長時間之后，留下的細胞(即膽管樹干細胞)的單層培養物轉移到分化培養基，其中干細胞在48小時內經歷快速的形狀變化和基因表達變化。所有分化培養基由用于自我復制的培養基(如Kubota培養基或其等價物)的變體組成，使得激素確定的培養基將包含自我復制培養基中的成分并補充有鈣O O. 5mM)、銅、bFGF，其稱為“改性培養基”。為實現特定的成熟細胞類型，需要滿足下述要求
近譜系限制至肝命運(如肝細胞)可通過將膽管樹干細胞埋入透明質酸的水凝膠內而實現，其IV型膠原蛋白和層粘連蛋白與“改性培養基”的混合，改性培養基還補充有高血糖素、半乳糖、三碘甲狀腺原氨酸、表皮生長因子(EGF)和肝細胞生長因子(HGF)。在一實施例中，成分的量如下MKM補充有7μ g/L高血糖素、2g/L半乳糖、IO-9M三碘甲狀腺原氨酸
3、10ng/ml EGF 和 20ng/ml HGF。胰腺組織譜系限制至胰腺命運(如胰島)可通過將膽管樹干細胞埋入透明質酸的水凝膠內而實現，其包含IV型膠原蛋白和層粘連蛋白并具有“改性培養基”，改性培養基改變為去除氫化可的松但包含B27、抗壞血酸、環巴胺、視黃酸和艾塞那肽-4 (exendin 4)。在一實施例中，成分的量如下=MKM改為去除氫化可的松及包含2% B27、0. ImM抗壞血酸、O. 25 μ M環巴胺、O. 5 μ M視黃酸和50ng/ml艾塞那肽。膽管樹/膽管細胞:類似地，膽管樹干細胞可通過將干細胞埋入與I型膠原蛋白混合的透明質酸內及“改性培養基”中而譜系限制至膽管命運(如膽管細胞)，改性培養基還補充有血管內皮細胞生長因子(VEGF) 165和HGF。在一實施例中，成分的量如下MKM還補充有20ng/ml血管內皮細胞生長因子(VEGF) 165和10ng/ml HGF。例IV-移棺經移植法移植來自可靠器官的細胞對于許多應用優選經注入或輸注進行，盡管任一遞送模式均可行。已發現上面描述的水凝膠培養物為移植提供好的條件。細胞可懸浮在未交聯的透明質酸中、與培養基中的其他基質成分混合，培養基包括基礎培養基加針對擴增和/或分化調整的激素、生長因子和其他可溶信號。用于移植的細胞群優選包括膽管樹干細胞或細胞群，其取自用于移植的目標組織(或其他源)、以與體內所發現相當的比例、連同(或沒有)其天然間質細胞同伴(如成血管細胞、星狀細胞)一起移植。不受限于理論，干細胞和同伴間質細胞的這種組合為血管化并能夠生理運行的組織的完全成熟提供適當的微環境。在一實施例中,對于胰腺移植、植入或注入,移植物的細胞成分可包括與從人胎兒或新生兒組織取得的成血管細胞(VEGFR+、⑶117+細胞)和星狀細胞(⑶146+細胞)、以組織中體內發現的這些細胞群的估計比例共種入移植物的膽管樹干細胞或細胞群。干細胞群可從在此所述的培養物中的擴增細胞獲得。成血管細胞和星狀細胞可用磁激活細胞分選(MACS)系統或流式血細胞計數分選而從新鮮制取的人胎兒或新生兒胰腺組織的細胞懸液進行免疫選擇。所有膽管樹干細胞群可免疫選擇對常用的干/祖細胞表面標記物(如CD133、⑶44H、EpCAM、NCAM)呈陽性的細胞。在一實施例中，這些細胞在包含O. 5%牛血清白蛋白和具有FITC結合一抗的2mM EDTA的500 μ I磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中、以50 μ I 50x IO6總細胞的濃度、在4°C下孵育20分鐘。這些標記的細胞與使用FITC抗體抗原的磁珠反應，然后通過MidiMACS或MiniMACS塔和分離裝置選擇。所有孵育和選擇步驟應在冰上進行并添加 10% ACCUTASE(Innovative Cell Technologies, San Diego , CA)以防止細胞聚集。作為備選，細胞可用fluoroprobe標記的抗體進行標記，及細胞使用流式血細胞計數器進行免疫選擇。例V-培養某所有培養基均進行無菌過濾(0.22 μ m濾器)并在使用前保持在4°C的黑暗中。Kubota培養基(KM)由任何基礎培養基(如RPMI 1640)組成，其沒有銅、低鈣(〈0. 5mM)、10_9M硒、4. 5mM煙堿、0. InM硫酸鋅、1(Γ8Μ氫化可的松、5 μ g/ml轉鐵蛋白/Fe、5 μ g/ml胰島素、添加的游離脂肪酸與血清蛋白(0. 1% )及(非必須地)10 μ g/ml高密度脂蛋白的混合物。例VI-分化備件三維培養物用包含透明質酸、其它基質分子、激素、生長因子、細胞活素建立，所有這些制成培養基。所有水凝膠使用改性KubOta培養基(或其等價物)制取，其補充有鈣以達到0. 6mM的濃度、10_12M銅、10 μ m基本成纖維細胞生長因子(bFGF)(稱為改性KM或MKM)。肝細胞=MKM-L,具有7 μ g/L高血糖素、2g/L半乳糖、1(Γ9Μ三碘甲狀腺原氨酸3、10ng/ml表皮生長因子(EGF)和20ng/ml肝細胞生長因子(HGF)。基質骨架包括60% IV型膠原蛋白和層粘連蛋白及40%透明質酸。膽管樹/膽管細胞MKM-C,補充20ng/ml血管內皮細胞牛長因子(VEGF) 165和10ng/ml HGF?；|骨架包括60% I型膠原蛋白和40%透明質酸。胰腺、胰島MKM-P (沒有氡化可的松)，還補充2 % B27、0. ImM抗壞血酸、0. 25 μ M環巴胺、0. 5μΜ RA和50ng/ml艾塞那肽-4。基質骨架包括60% IV型膠原蛋白和層粘連蛋白及40%透明質酸。例VII-細胞分離和表型為移植到患者內取得和排斥的人膽管組織從肝和胰腺獲得。人膽管組織的細胞懸液使用補充有0. 1%牛血清白蛋白、InM硒和抗生素的RPMI 1640處理。酶處理緩沖包含300U/ml IV型膠原蛋白酶和0. 3mg/ml脫氧核糖核酸酶，在32 °C下頻繁攪動15-20分鐘。富集的懸液通過75規格的網擠壓并在再懸浮之前以1200RPM旋轉5分鐘。通過錐蟲藍排除估計的細胞生產能力通常高于95%。約3xl05個細胞放在IOcm組織培養皿上及無血清Kubota培養基中，其每3天更換一次。集落在5-7天內形成并觀察高達3個月。使用倒置顯微鏡在變化的時間用手拾取集落。專能膽管樹干細胞也通過免疫選擇從新制取的細胞懸液分離，其基于常用的一個或多個干/祖細胞表面標記物(⑶133、⑶44H、NCAM、EpCAM、⑶326)的陽性表達，其按照制造商的指令使用具有 Miltenyi Biotech MACS 系統(Bergisch Gladbach, Germany)的磁珠免疫選擇技術。簡要地，分離的細胞用與磁微珠結合的EpCAM抗體在4°C下孵育30分鐘，及按照制造商推薦的程序使用來自Miltenyi的磁柱分離系統進行分離。培養基每天更換，及收集的培養基在_20°C保存用于進一步分析。對于熒光染色，細胞用4%多聚甲醛(PFA)在室溫下固定20分鐘，用HBSS沖洗，用10%羊血清在HBSS中封固2小時，及沖洗。固定細胞用一抗在4°C下孵育一整夜、清洗、用標記的同型特異性二抗孵育I小時、清洗、4’，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染以能看見細胞核。對于免疫組織化學，組織在4%多聚甲醛(PFA)中固定一整夜，保存在70%乙醇中，隨后包埋在石蠟中并切割為5μπι段。去除這些段的石蠟，及抗原被恢復。內生過氧化物酶通過在O. 3% H2O2溶液中孵育30分鐘進行封固。在用10%馬血清封固之后，在4°C下施加一抗一整夜；二抗和 ABC 染色使用 RTUVectastain Kit (Vector Laboratories,Burlingame, CA)進行。Vector Nova RED用作底物。對這些段進行脫水、固定并包埋在Eukitt Mounting Media (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)中，及使用倒置 顯微鏡進行分析。對于定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析，培養的膽管樹組織或細胞進行細胞溶解并使用RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen GmbH, Valencia CA)按制造商的指令進行全部 RNA 提取。反轉錄用針對 RT-PCR 的 Superscript First-Strand SynthesisSystem(Invitrogen, Carlsbad, CA)進行。HotStarTaq Master Mix Kit (Qiagen)用于 PCR。細胞通過裝備有雙相干1-90激光器的FACStar Plus細胞分類器(BDBiosciences)進行分析和分類。突光結合的抗體在488nm下進行刺激,它們的突光發射通過標準濾光片檢測。在本發明已結合具體實施例進行描述的同時，應當理解，其能夠進一步修改，且本申請意于覆蓋本發明的任何變化、使用或修改，如為從細胞引出精確的響應而對基質成分或生長因子或激素的精確濃度進行的變化?？偟膩碚f，本發明的原理，包括那些在本發明所屬領域的已知或常規實踐內的內容，均可應用于此前提出的實質特征并在所附權利要求的范圍內?？s寫詞AE2,陰離子交換劑2 ；AFP, α -胎蛋白；ALB,白蛋白；ASMA, α -平滑肌肌動蛋白；ASBT，頂端鈉依賴性膽汁酸轉運體；bFGF，基本成纖維細胞生長因子；CD，共同決定簇；CD133，prominin ;CD146，黑色素瘤細胞粘附分子(Mel-CAM) ;CD31，PECAM ;CD44H，透明質酸受體；CD45，共同白細胞抗原；CFTR，囊性纖維化跨膜轉運調節因子；CK，細胞角蛋白；CXCR4，CXC-趨化因子受體4 ；CYP450,細胞色素P450 ；EGF,表皮生長因子；EpCAM，上皮細胞黏附分子；F0Xa2，叉頭框轉錄因子a2 ；GGT, Y谷氨酰轉移酶；HDM，激素確定的培養基，針對特定細胞類型調整；HDM-L，用于肝的激素確定的培養基；HDM-C，用于膽管細胞(膽管樹)的激素確定的培養基；HDM-P，用于胰腺的激素確定的培養基；HGF，肝細胞生長因子；HNF，肝細胞核因子；KM，Kubota培養基，為干/祖細胞設計的無血清培養基；NCAM，神經細胞黏附分子；NGN3，神經元素3 ;PDX1，胰腺和十二指腸同源框I ；PROXI, Prospero同源框蛋白I ；SALL4，Sal類蛋白4 ；S0X, Sry有關的HMG框；SR，分泌素受體；VEGF，血管內皮細胞生長因子。
權利要求
1.一種組成，包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞，其中所述細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲得。
2.根據權利要求I的組成，其中所述專能干/祖細胞為專能干細胞。
3.根據權利要求I的組成，其中所述內胚層譜系為肝譜系、膽管譜系、胰腺譜系或其組口 ο
4.根據權利要求I的組成，其中所述膽管樹組織為膽管樹的任何部分，包括門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管和膽囊。
5.根據權利要求I的組成，其中所述哺乳動物為人。
6.根據權利要求5的組成，其中人哺乳動物為胎兒、嬰兒、兒童(小兒科)、成人、或死后長達72小時的死人。
7.根據權利要求6的組成，其中所述哺乳動物為死后10小時內的死人。
8.根據權利要求I的組成，其中所述膽管樹組織包含膽管周圍腺體或源自膽管周圍腺體的祖細胞或干細胞。
9.根據權利要求I的組成，其中所述膽管樹組織包括膽管樹在其處分支的位置。
10.根據權利要求I的組成，其中專能細胞表達 (i)指示早期肝細胞譜系的至少一標記物； (ii)指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物；及選自(a)-(c)類別的至少一標記物 Ca)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物； (b)指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子'及 (c)多能基因的中弱表達。
11.根據權利要求10的組成，其中指示早期肝細胞譜系的至少一標記物為HNF6、HES1、CK19、白蛋白或AFP。
12.根據權利要求 ο的組成，其中指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物為roxi、PROXU NGN3或胰島素。
13.根據權利要求10的組成，其中在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物為CD133 (prominin)、透明質酸受體 CD44H、N-CAM、CXCR4 或 EpCAM。
14.根據權利要求10的組成，其中指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子為S0X9、S0X17 或 F0XA2。
15.根據權利要求10的組成，其中所述多能基因為S0X2、NAN0G、KLF4、0CT4A或0CT4。
16.根據權利要求I的組成，其中專能細胞表達 (i)指示早期肝細胞譜系的至少一標記物； (ii)指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物； (iii)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物； (iv)指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子'及 (ν)多能基因的中弱表達。
17.根據權利要求I的組成，其中專能細胞至少表達下述之一 (i )端粒酶蛋白的核表達； (ii)多能基因的中低水平表達； (iii)典型內胚層轉錄因子的核或核周表達；(iv)內胚層干/祖細胞表面標記物的表達； (ν)成熟肝臟、成熟膽管或成熟內分泌胰腺的譜系標記物的缺乏表達或低及可變水平的表達； (vi)間質細胞、內皮細胞或造血細胞的標記物的缺乏表達。
18.根據權利要求10的組成，其中內胚層干/祖細胞表面標記物包括⑶326/上皮細胞黏附分子EpCAM、⑶56/神經細胞黏附分子NCAM、⑶133 (prominin)、透明質酸受體⑶44H、CXCR4或其組合。
19.根據權利要求10的組成，其中典型內胚層轉錄因子包括S0X17、S0X9、F0XA2、HES1、HNF6、PROXl、HNF3B (肝細胞核因子 _3B)、F0XA2、SALL4 (Sal 類蛋白 4)、PDXU NGN3 或其組八口 ο
20.根據權利要求10的組成，其中成熟肝臟的譜系標記物包括P450-3A4、轉鐵蛋白、酪氨酸轉氨酶TAT、及白蛋白高水平；成熟膽管的譜系標記物包括AE2、CFTR、分泌素受體、水通道蛋白或其組合；及成熟胰腺的譜系標記物包括胰島素、高血糖素、生長抑制激素、淀粉酶或其組合的高水平。
21.根據權利要求10的組成，其中間質細胞的標記物包括⑶146、結蛋白、α-平滑肌肌動蛋白ASMA或其組合；內皮細胞的標記物包括VEGF受體、⑶31、血管假性血友病因子或其組合；及造血細胞的屬標記物為⑶45。
22.根據權利要求10的組成，其中所述表達通過體內組織、新分離的細胞或培養的細胞的端點和定量RT-PCR化驗分析和/或免疫組織化學進行確定。
23.根據權利要求10的組成，其中所述膽管樹組織包括膽囊管、門、肝總管、肝胰總管、膽囊、連接它們的膽管樹的任何部分或其組合。
24.根據權利要求10的組成，其中所述膽管樹組織包括膽管樹分子的位置。
25.一種組成，包括具有根據權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞群。
26.一種組成，包括富集根據權利要求I的專能干/祖細胞的哺乳動物細胞群。
27.獲取能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的方法，其中所述細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲得，所述方法包括獲取膽管樹組織，然后依次、以任何順序或實質上同時獲取對下述標記物呈陽性的細胞 (i)指示早期肝細胞譜系的至少一標記物； (ii)指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物；及非必須地， 選自(a)-(c)的至少一標記物 (a)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物； (b)指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子'及 (C)多能基因的中弱表達。
28.根據權利要求27的方法，其中分離經免疫選擇技術和/或選擇性培養條件進行。
29.根據權利要求28的方法，其中所述免疫選擇技術包括篩選法、磁珠選擇法、流式細胞計數法或其組合。
30.根據權利要求29的方法，其中所述免疫選擇技術為流式細胞計數法。
31.根據權利要求28的方法，其中所述選擇性培養條件包括將所述細胞放在塑料上、透明質酸上、或非必須地用膠原蛋白IV、膠原蛋白III、層粘連蛋白、透明質酸、來自胚胎、胎兒、新生兒組織或其組合的其它基質成分包覆的塑料上。
32.根據權利要求28的方法，還包括在無血清培養基中孵育所述細胞，所述無血清培養基包括具有低鈣的基礎培養基、無銅、及補充有胰島素、轉鐵蛋白/Fe、硒、鋅、與血清白蛋白結合的游離脂肪酸、及非必須地補充高密度脂蛋白。
33.根據權利要求32的方法，其中所述基礎培養基包括RPMI1640。
34.根據權利要求32的方法，其中所述基礎培養基包括少于O.5mM的鈣。
35.根據權利要求28的方法，其中所述細胞被培養7-21天或更長時間。
36.根據權利要求27的方法，其中所述膽管樹組織包括門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管和膽囊或其組合。
37.根據權利要求27的方法，其中所述膽管樹組織源自膽管樹分子或包含高量的膽管周圍腺體的部位。
38.鑒定和分離包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的哺乳動物專能細胞群的方法，其中所述細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲得，所述方法包括獲取膽管樹組織，然后依次、以任何順序或實質上同時獲取對下述標記物呈陽性的細胞 (i)指示早期肝細胞譜系的至少一標記物； (ii)指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物； 及選自(a)-(c)類別的一個或多個的至少一標記物 (a)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物； (b)指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子'及 (c)多能基因的中弱表達。
39.鑒定和分離富集根據權利要求的哺乳動物專能干/祖細胞的哺乳動物專能細胞群的方法，包括獲取膽管樹組織，然后依次、以任何順序或實質上同時獲取對下述標記物呈陽性的細胞 (i)指示早期肝細胞譜系的至少一標記物； (ii)指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物； 及選自(a)-(c)類別的一個或多個的至少一標記物 Ca)在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物； (b)指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子'及 (c)多能基因的中弱表達。
40.根據權利要求38或39的方法，其中指示早期肝細胞譜系的至少一標記物為HNF6、HES1、CK19、白蛋白或 AFP。
41.根據權利要求38或39的方法，其中指示早期胰腺細胞譜系的至少一標記物為PDXUPROXU NGN3 或胰島素。
42.根據權利要求38或39的方法，其中在干/祖細胞上發現的至少一表面標記物為CD133 (prominin)、透明質酸受體 CD44H、N-CAM、CXCR4 或 EpCAM。
43.根據權利要求38或39的方法，其中指示內胚層干/祖細胞的至少一轉錄因子為SOX 9、S0X17 或 F0XA2。
44.根據權利要求38或39的方法，其中所述多能基因為S0X2、NANOG,KLF4、0CT4A或0CT4。
45.增殖和/或擴增根據權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群的方法，包括在塑料或透明質酸上培養所述細胞，或非必須地，在包覆III或IV型膠原蛋白或透明質酸或來自胎兒、新生兒或胚胎組織的其它基質成分的塑料上，及在基礎培養基中培養，基礎培養基不含銅、低鈣(〈O. 5mM)、包含胰島素、轉鐵蛋白/Fe、游離脂肪酸與血清血蛋白結合的混合物，及非必須地，包含高密度脂蛋白。
46.增殖和/或擴增根據權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞的同伴細胞的方法，包括在塑料或透明質酸上培養所述細胞，或非必須地，在包覆III或IV型膠原蛋白或透明質酸或來自胎兒、新生兒或胚胎組織的其它基質成分的塑料上，及在基礎培養基中培養，基礎培養基不含銅、低鈣(〈O. 5mM)、包含胰島素、轉鐵蛋白/Fe、游離脂肪酸與血清血蛋白結合的混合物，及非必須地，包含高密度脂蛋白，其中所述同伴細胞包括間質細胞、成血管細胞和星狀細胞或前體。
47.能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞和/或包括或富集前述哺乳動物專能干/祖細胞的專能細胞群至肝細胞的譜系限制方法，所述方法包括 (a)獲取包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞懸液，其中所述細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲??； (b)將細胞懸液埋入包括透明質酸或包括與其它基質成分組合的透明質酸的水凝膠內；及 (c)在補充銅、I丐(彡O.5mM)、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、bFGF、氫化可的松、高血糖素、半乳糖、三碘甲狀腺原氨酸T3、表皮生長因子EGF、肝細胞生長因子HGF、高密度脂蛋白、及游離脂肪酸與血蛋白結合的混合物的基礎培養基中培養所述細胞懸液足夠的時間以使它們能分化至肝細胞。
48.根據權利要求47的方法，其中其它基質成分包括IV型膠原蛋白、層粘連蛋白或二者。
49.根據權利要求47的方法，其中所述培養為培養7-14天。
50.能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞和/或包括或富集前述哺乳動物專能干/祖細胞的專能細胞群至胰腺細胞的譜系限制方法，所述方法包括 (a)獲取包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞懸液，其中所述細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲??； (b)將所述細胞懸液埋入包括透明質酸或包括與其它基質成分組合的透明質酸的水凝膠內 '及 (c)在補充銅、鈣(彡O.5mM)、B27、抗環血酸、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、bFGF、環巴胺、視黃酸、艾塞那肽-4、高密度脂蛋白、及游離脂肪酸與血蛋白結合的混合物且缺少氫化可的松的基礎培養基中培養細胞懸液足夠的時間以使它們能分化至胰腺細胞。
51.根據權利要求50的方法，其中其它基質成分包括IV型膠原蛋白、層粘連蛋白或二者。
52.能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞和/或包括或富集前述哺乳動物專能干/祖細胞的專能細胞群至膽管樹細胞的譜系限制方法，所述方法包括 (a)獲取包括能夠分化至多個內胚層譜系的哺乳動物專能干/祖細胞的細胞懸液，其中所述細胞從哺乳動物的膽管樹組織獲取；(b)將細胞懸液埋入包括透明質酸或包括與其它基質成分組合的透明質酸的水凝膠內 '及 (c)在補充銅、鈣OO. 5mM)、胰島素、轉鐵蛋白/Fe、氫化可的松、bFGF、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、高密度脂蛋白、及游離脂肪酸與血蛋白結合的混合物的基礎培養基中培養細胞懸液足夠的時間以使它們能分化至膽管細胞。
53.根據權利要求52的方法，其中膽管樹細胞包括膽管細胞。
54.根據權利要求52的方法，其中所述其它基質成分包括I型膠原蛋白。
55.體內分化細胞的方法,包括將權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群按細胞懸液或移植物或移植片體內移植到肝臟內，具有或沒有先前的、適當培養條件下的譜系限制，在肝臟內所述細胞分化至肝組織。
56.體內分化細胞的方法，包括將權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群按細胞懸液或移植物或移植片體內移植到膽管內，具有或沒有先前的、適當培養條件下的譜系限制，在膽管內所述細胞分化至膽管樹組織。
57.體內分化細胞的方法,包括將權利要求I的哺乳動物專能干/祖細胞或包括前述細胞或富集前述細胞的群按細胞懸液或移植物或移植片體內移植到胰腺內、腎囊下方或附睪脂墊內，所述細胞在其中分化至功能性胰腺組織，具有或沒有先前的、適當培養條件下的譜系限制。
全文摘要
本發明涉及專能干細胞、專能細胞群及富集專能細胞的群，每一個在胎兒、新生兒、兒童和成人膽管樹組織及死后長達72小時的死人(盡管優選死后10小時內)中發現并能夠成熟至包括肝、膽管或胰腺組織的多個內胚層組織。專能干/祖細胞及細胞群在膽管周圍腺體中發現，從它們派生的祖細胞遍及包括膽囊的膽管樹存在。高量的膽管周圍腺體在膽管樹的分支位置如門、肝總管、膽囊管、總管、肝胰總管和膽囊中發現。有關的專能細胞、專能細胞群及它們派生的祖細胞在遍及包括膽囊的膽管樹中發現，其沒有膽管周圍腺體。本發明還提供包括這些細胞的組成、鑒定和分離這些細胞的方法、在培養物中培養這些細胞的方法、在培養物中擴增這些細胞的方法、及體外或體內分化或譜系限制這些細胞至肝、膽管或胰腺命運(如肝細胞、膽管細胞和/或胰島細胞)的方法。還提供使用專能細胞和/或專能細胞群的方法。
文檔編號C12N5/071GK102918145SQ201080058598
公開日2013年2月6日 申請日期2010年10月28日 優先權日2009年10月30日
發明者L·M·雷德, Y·王, V·卡迪拉爾, E·戈迪奧, G·卡佩羅, D·艾爾瓦羅, C·崔 申請人:北卡羅來納大學教堂山分校, 羅馬大學