專利名稱：鮑魚hint基因、蛋白質(zhì)及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及鮑魚體內(nèi)的鮑魚HINT基因、蛋白質(zhì)及其在制備抗癌藥 物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白質(zhì)(Histidine triad nucleotide binding protein, HINT) 是組氨酸三聚體蛋白超家族的成員，是一個(gè)具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性的家族，晶體結(jié) 構(gòu)研究結(jié)果表明，HINT是其它四種組氨酸三聚體蛋白質(zhì)超家族成員的祖先。自從HINT在牛 中被分離出來并被證明具有生物學(xué)功能后，許多HINT的同源物也依次從兔、人、甚至植物 中被克隆出來。研究表明該蛋白質(zhì)在低等動(dòng)物和高等動(dòng)物中具有很高的結(jié)構(gòu)和功能相似性， 而結(jié)構(gòu)和功能的保守性，預(yù)示了HINT發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。研究報(bào)道表明，HINT蛋白 質(zhì)參與了重要的生物學(xué)功能，包括物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等。目前，有 研究報(bào)道哺乳動(dòng)物HINT在腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，而在無脊椎 動(dòng)物中，HINT的研究只是停留在序列分析上，尚沒有報(bào)道證實(shí)無脊椎動(dòng)物HINT的存在，功 能研究也有待于進(jìn)一步探討。
鮑魚是一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，素稱"海味之冠"，自古以來就是海產(chǎn)"八珍"之一。其 味道鮮美，營養(yǎng)豐富，含有較多的鈣、鐵、碘和維生素A等營養(yǎng)元素。除了具有較高的營養(yǎng) 價(jià)值外，鮑魚還具有較高的醫(yī)藥價(jià)值鮑魚能養(yǎng)陰、平肝、固腎，可調(diào)整腎上腺分泌，具有 雙向性調(diào)節(jié)血壓的作用。另外，鮑魚體內(nèi)還存在一些能抑制癌細(xì)胞細(xì)胞代謝的物質(zhì)。但是， 由于對(duì)其相應(yīng)的功能因子的研究并不深入，尤其是對(duì)一些人類腫瘤治療有益的基因研究較 少，從而限制了其進(jìn)一步的發(fā)展利用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供了鮑魚HINT基因、蛋白質(zhì)及其在制備抗 癌藥物中的應(yīng)用。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的提供一種鮑魚HINT基因編碼 的蛋白質(zhì)，具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種編碼前述蛋白質(zhì)的基因，該基因具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了前述蛋白質(zhì)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明獲得了鮑魚HINT的基因核苷酸全序列，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)了可溶 性的HINT蛋白質(zhì)產(chǎn)品。該蛋白質(zhì)具有促肝癌細(xì)胞凋亡作用，可以作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的組份 而在制備抗癌藥物中應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的下述實(shí)施例所使用分子生物學(xué)的方法均為已知的技術(shù)。 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)步驟包括-
1、 以鮑魚血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，構(gòu)建鮑魚cDNA文庫，獲得HINT的基因核苷酸全 序列。
2、 利用DNA重組技術(shù)將HINT基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD18-T載體(購自 Takara公司，日本)中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-28(a)原核表達(dá)載 體(購自Novagen公司，美國)連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28 (a) -HINT。
3、 將陽性重組質(zhì)粒PET-28(a)-HINT轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21 (購自Tiangen公司，德 國)，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(購自Sangon公司，加拿大)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-聚丙烯酰胺凝 膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢測。
4、 將陽性表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒分離純化重組蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步
利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定純化蛋白質(zhì)。
5、 培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株Bel — 7402(人肝癌細(xì)胞系Be17402購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研
究所)，并用純化的蛋白質(zhì)HINT進(jìn)行溫浴反應(yīng)、處理。
6、 選擇不同的時(shí)間點(diǎn)收集處理過的細(xì)胞，分別用掃描電鏡、流式細(xì)胞儀及免疫印跡檢 測腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。
具體的操作步驟如下
1、 鮑魚血淋巴細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建及篩選
提取鮑魚血淋巴細(xì)胞總RNA，根據(jù)SMARTTMcDNA library construction kit(BD Clotech 公司)構(gòu)建cDNA文庫。利用引物PTriplEx2-F， 5' -CTCCGAGATCTGGACGAGC-3，和 PTriplEx2-R, 5， -TAATACGACTCACTATAGGGC-3，對(duì)文庫陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。
2、 鮑魚HINT核苷酸全長序列的獲得
通過對(duì)文庫篩選，我們得到一個(gè)和哺乳動(dòng)物HINT有較高同源性的基因，我們將其命名
4為ab-HINT(ab代表鮑魚)。該基因的核苷酸全長序列為SEQ ID NO: 1。
3、 PET-28(a)-HINT表達(dá)載體的構(gòu)建
以鮑魚cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增ab-HINT的反應(yīng)條件為95°C 2分鐘；94°C l分鐘，52°C l分鐘，72°C l分鐘，35個(gè)循環(huán)；72°C 5分鐘。PCR產(chǎn)物分別連入PMD-18T載體， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI (購自Invitrogen公司，美國)，涂布LBA篩選平板，挑若干個(gè)克隆進(jìn)行PCR 鑒定及進(jìn)一步的測序鑒定，將PCR陽性克隆產(chǎn)物用EcoRI, Xhol限制性內(nèi)切酶(購自Takara公 司，日本)雙酶切，連入經(jīng)過同樣雙酶切的PET-28a載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI。 PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的表達(dá)載體PET-28(a)-HINT。
4、 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)
將陽性重組質(zhì)粒PET-28 (a) -HINT轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)，涂布LBA平板，37'C培 養(yǎng)過夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37'C振搖培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按1:100 擴(kuò)大培養(yǎng)至0De。。為0.4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其終濃度 在0-1.0mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后(300W,20分鐘， 超聲3秒鐘，間隔2秒鐘)離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
5、 重組蛋白質(zhì)的純化及鑒定
將陽性表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱(購自Novagen公司，美國)對(duì)表 達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳并進(jìn)一步利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定純化的蛋白質(zhì) 產(chǎn)物。包括以下步驟
(1) 用干凈的刀片將SDS-PAGE分離后的純化蛋白質(zhì)樣品切下，制成膠粒，并用含50% 的乙腈的NH4HC03脫色完全，微加熱使之干燥。
(2) 將干燥的膠粒進(jìn)行酶切前的處理(洗滌，再干燥)，然后加入胰蛋白酶和NH4HC03 3 7°C 進(jìn)行酶解反應(yīng)。
(3) 充分酶解后稍微離心收集上清液，進(jìn)一步處理后采用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用的 方法(HPLC-MS/MS)鑒定分析。
(4) 將質(zhì)譜所得的肽段的質(zhì)量數(shù)及其MS/MS圖譜(碎片離子質(zhì)量數(shù))同時(shí)送入NCBInr 數(shù)據(jù)庫，使用質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能(MS/MS long search)與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)肽段的理論質(zhì)量數(shù) 及其MS/MS裂解圖譜進(jìn)行相關(guān)性比較檢索鑒定。
蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
6、 蛋白質(zhì)定量
將純化鑒定過的蛋白質(zhì)按Brad-ford法進(jìn)行定量(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976, 72: 248-254)。7、 肝癌細(xì)胞株Bel — 7402的培養(yǎng)和處理
人肝癌細(xì)胞株BEL-740來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。 將Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)在含IO免小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國
Life Technology公司)中，加入青霉素IOO U/mL 、鏈霉素IOO mg/L ,置37 。C飽和濕度5 %
的C02細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。將5 X105對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶。24小時(shí)換液l
次。最后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、重組蛋白質(zhì)HINT處理組(處理時(shí)間分別為6、 12、 18、
24小時(shí))。
8、 重組蛋白質(zhì)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。 用掃描電鏡檢測重組蛋白質(zhì)HINT處理后肝癌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，用Annexin V/PI凋亡檢測試
劑盒(MultiSciences Biotech公司)檢測肝癌細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，用免疫印跡(western
blot)的方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)P53 (P53抗體購自英國Abeam公司)的表達(dá)變化。
具體的實(shí)施例子
1、 鮑魚血淋巴細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建和篩選
提取鮑魚血淋巴細(xì)胞總RNA，根據(jù)SMARTTMcDNA library construction kit(BD Clotech 公司)構(gòu)建cDNA文庫。利用引物PTriplEx2-F, 5， -CTCCGAGATCTGGACGAGC-3 ，和 PTriplEx2-R， 5' -TAATACGACTCACTATAGGGC-3'對(duì)文庫陽性質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序。篩選 出鮑魚組氨酸核苷結(jié)合蛋白質(zhì)HINT。
2、 HINT的原核表達(dá)、純化和鑒定
將陽性重組質(zhì)粒PET-28 (a)-HINT轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)，涂布LBA平板，37°C 培養(yǎng)過夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37'C振搖培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按 I:IOO擴(kuò)大培養(yǎng)至OD卿為0.4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其 終濃度在0-1. 0 mraol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后(300W，20 分鐘，超聲3秒鐘，間隔2秒鐘)離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。 將陽性表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，進(jìn)行12%的 SDS-PAGE電泳并進(jìn)一步利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定純化的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
3、 HITN重組蛋白質(zhì)促肝癌細(xì)胞凋亡作用
將Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)在含10 y。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入青霉素100 U/raL 、鏈霉 素100mg/L，置37卩飽和濕度5%的二氧化碳(C02)細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。將5 X105對(duì) 數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶。24小時(shí)換液l次。最后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、重組蛋白 質(zhì)HINT處理組(處理時(shí)間分別為6、 12、 18、 24小時(shí))。用掃描電鏡檢測重組蛋白質(zhì)HINT處 理后肝癌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，用AnnexinV/PI方法檢測肝癌細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，用免疫印跡的 方法檢測了凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)P53的表達(dá)變化。結(jié)果表明重組的鮑魚HINT蛋白質(zhì)能夠有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡(處理24小時(shí)后，凋亡率達(dá)到34%)，在制備腫瘤治療藥物中具有很好的應(yīng)用 前景。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干具體實(shí)施例框架。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有 變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
SEQIDNO: 1
actacaagcg tgtgtattga accggggagg gcgcatgcga gtcgaggctg catgtgaatc 60 gtaatgtcgg aaacagataa agcccagacc gcgacaccag gtggtgacac catctttggc 120 aagatcatac gagaggagat tccgaccaag tttctataca aggatgaagt gtgtgttgtg 180 tttaatgaca tcaatgcaca ggcaccagtg cacttccttg ttgtgccagt gaagcccatc 240 gtgcgacttg ccgatgctga agatgcagac aaagagattc ttggacactt gctgctggtg 300 gccaagaaga tggctgcaga gttaggttta tctgaagggt atcgggtggt catcaatgac 360 ggtccagatg gagggcagtc tgtgtaccac ctgcatgtgc acgtgttggg aaaacgccag 420 ttggagtggc cacctggcta aatggctgca ctgacacaga ccagggttgt atctgtagac 480 accaccttat cttcataccg ttgtgttcct tttgtctctg tgagtttgac agttcccaga 540 tgatgtaatt gcattacaga ctccttggct aaataaaatg tgagcaacaa aaaaaaaaaa 600
aaaaaaaaaa aaaaaa 616 SEQIDNO: 2
15 Met Ser Glu Thr Asp Lys Ala Gin Thr Ala Thr Pro Gly Gly Asp 30 Thr He Phe Gly Lys lie He Arg Glu Glu lie Pro Thr Lys Phe 45 Leu Tyr Lys Asp Glu Val Cys Val Val Phe Asn Asp lie Asn Ala 60 Gin Ala Pro Val His Phe Leu Val Val Pro Val Lys Pro lie Val 75 Arg Leu Ala Asp Ala Glu Asp Ala Asp Lys Glu lie Leu Gly His 90 Leu Leu Leu Val Ala Lys Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Leu Ser 105 Glu Gly Tyr Arg Val Val lie Asn Asp Gly Pro Asp Gly Gly Gin 120 Ser Val Tyr His Leu His Val His Val Leu Gly Lys Arg Gin Leu 125 GluTrpPro Pro Gly
權(quán)利要求
1、一種鮑魚HINT基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求l所述蛋白質(zhì)的基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID N0: l所示的 核苷酸序列。
3、 如權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供鮑魚體內(nèi)的鮑魚HINT基因、蛋白質(zhì)及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。該鮑魚HINT基因編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。編碼前述蛋白質(zhì)的基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了前述蛋白質(zhì)在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明獲得了鮑魚HINT的基因核苷酸全序列，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)了可溶性的HINT蛋白質(zhì)產(chǎn)品。該蛋白質(zhì)具有促肝癌細(xì)胞凋亡作用，可以作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的組份而在制備抗癌藥物中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/22GK101519655SQ20091009743
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者吳信忠, 吳劉記 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)