專利名稱：狗腫瘤壞死因子14基因和蛋白質(zhì)制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及腫瘤壞死因子14 (TNFSF14或LIGHT)cDNA的克隆、表達(dá)及蛋白純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
鑒于腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)成員具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化或死亡的功能，在淋巴器官的形成，免疫細(xì)胞的激活及維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)等方面都發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，所以近年來(lái)，越來(lái)越多的TNFSF家族成員被發(fā)現(xiàn)。LIGHT是1997年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族第14號(hào)成員，又名TNFSF-14或HVEM-L，240aa的分子量約為29kD的II型跨膜蛋白，擁有典型的TNF同源結(jié)構(gòu)域。它的受體主要有三個(gè)TR2 / HVEM、LTBR、及TR6，通過(guò)不同的受體來(lái)介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)，參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育、通過(guò)CD28非依賴的途徑刺激T細(xì)胞的活化并促進(jìn)其生長(zhǎng)分化和細(xì)胞因子的分泌以及腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過(guò)程，在腫瘤免疫、 自身免疫病、移植物抗宿主病(GVHD)和抗病毒感染中都發(fā)揮重要的作用。另外，LIGHT還具有活化和誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟的功能。LIGHT作為在人體免疫系統(tǒng)中起重要調(diào)控作用的一種特異的細(xì)胞因子，其與受體的相互作用涉及很多疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸炎、胰島素依賴性糖尿病、脂質(zhì)代謝等等，因此對(duì)LIGHT的研究將有助于對(duì)免疫缺陷疾病進(jìn)行治療，具有重要的理論意義和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。犬，通常指家犬，也稱狗，一種常見(jiàn)的犬科哺乳動(dòng)物。通常被稱為“人類最忠實(shí)的朋友”，保護(hù)國(guó)家、人民的財(cái)產(chǎn)安全，是飼養(yǎng)率最高的寵物，在刑偵方面也具有重要應(yīng)用價(jià)值。隨著人們生活水平的提高，寵物狗也逐漸與人們的生活息息相關(guān)。因此，狗相關(guān)疾病的預(yù)防及控制已成為大家關(guān)心的問(wèn)題。另外，早在1950年,美國(guó)就推薦小獵兔犬(beagle dog)為實(shí)驗(yàn)用犬，適合于生物醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科的研究，并為世界各國(guó)所公認(rèn)，在實(shí)驗(yàn)外科學(xué)研究、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、慢性實(shí)驗(yàn)研究、藥理學(xué)毒理學(xué)及藥物代謝的研究等方面都具有重要作用。因此，對(duì)于狗LIGHT基因的研究不論對(duì)于犬類還是人類都具有重大意義。根據(jù)GenBank、EMBL和DDBJ國(guó)際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果得知，目前人、鼠LIGHT cDNA已被克隆，并分別已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中申請(qǐng)了序列號(hào)，而至今狗LIGHT的cDNA還未被克隆出來(lái)，關(guān)于狗LIGHT基因(dog LIGHT，簡(jiǎn)稱dLIGHT)的研究在整個(gè)國(guó)內(nèi)外還處于完全空白狀態(tài)。因此，我們對(duì)于狗基因的研究有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從狗中獲得腫瘤壞死因子14 (LIGHT)基因和蛋白質(zhì)制備技術(shù)。本發(fā)明所述狗腫瘤壞死因子14 (LIGHT) cDNA，序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明的狗LIGHT cDNA的克隆方法如下
(1)提取狗脾臟細(xì)胞的總RNA，TransgencDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA ;
(2)根據(jù)狗的基因組設(shè)計(jì)嵌套引物
正義寡核苷酸引物dLIGHT-Fl :5’ - ATCTGCTCAGGCATGGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 5)反義寡核苷酸引物dLIGHT-Rl :5，- TCTGTCAGACCCCCATTCAGT-3，(SEQ ID NO. 6) 正義寡核苷酸引物dLIGHT-F2 :5’ - CAGCATCATCGATGGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 7)
反義寡核苷酸引物dLIGHT-R2 :5’ - TCACACCATGAAAGCCCCAAAG-3’ (SEQ ID NO. 8)
(3)應(yīng)用RT-PCR方法，以上述dLIGHT-Fl及dLIGHT-Rl為引物，進(jìn)行第一輪PCR。然后以第一輪擴(kuò)增出的產(chǎn)物為模板，再以上述dLIGHT-F2及dLIGHT-R2為引物，擴(kuò)增出一段序列；
(4)將上述所得到序列克隆入PMD19-T載體，并進(jìn)行堿基序列測(cè)定，得到編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列。本發(fā)明還公開(kāi)了狗腫瘤壞死因子14，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。狗腫瘤壞死因子LIGHT的cDNA可通過(guò)現(xiàn)有基因工程的方法，將該基因的胞外功能 區(qū)克隆連到PET43. Ia質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21(DE3)中原核表達(dá)，本發(fā)明通過(guò)多次預(yù)表達(dá)摸索出了合適的表達(dá)條件(主要通過(guò)控制IPTG的濃度、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速等)，超聲破碎后收集上清，通過(guò)Ni+親和純化，梯度洗脫之后我們得到狗pET43. la-dsLIGHT融合蛋白，并進(jìn)行 Western-blot 鑒定。


圖I dLIGHT的全長(zhǎng)cDNA堿基序列及對(duì)應(yīng)編碼氨基酸序列。圖2狗與不同物種的LIGHT全長(zhǎng)氨基酸序列同源性比較圖。其中框起來(lái)的代表保守的兩個(gè)半胱氨酸殘基，陰影部分代表的是金屬酶切位點(diǎn)，下劃線的部分為跨膜區(qū)。圖3 pET43. la-dsLIGHT表達(dá)載體的構(gòu)建。圖4 SDS-PAGE分析pET43. la-dsLIGHT在大腸桿菌中的表達(dá)
I Marker; 2重組蛋白非誘導(dǎo)；3重組蛋白誘導(dǎo)20h ;4純化后蛋白pET43. la-dsLIGHT ；5 western blotting 鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例I
狗腫瘤壞死因子14 (LIGHT) cDNA的獲得，實(shí)驗(yàn)材料購(gòu)自江蘇紅太陽(yáng)農(nóng)場(chǎng)。(I)提取總RNA :應(yīng)用RNA抽提試劑(TIANGEN)按照其操作手冊(cè)提取狗脾臟細(xì)胞的總RNA，并通過(guò)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。Transgen cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。(2)RT-PCR:以上述dLIGHT-Fl和dLIGHT-Rl為第一輪引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后以第一次PCR的產(chǎn)物作為第二次PCR的模板，以dLIGHT-F2和dLIGHT_R2為第二輪引物得到723bp的全長(zhǎng)cDNA序列。
①逆轉(zhuǎn)錄
在DEPC處理的I. 5ml Eppendorf管中依次加入總RNA抽提物3 μ 1，Oligo d(T) 18(O. 5 μ g/ μ I) I μ 1, 2 X TS Reaction Mix 10 μ 1，DEPC 水 5 μ 1，TransScript RT/RIEnzyme Mix I μ I ；42。C 孵育 30min，85。C 加熱 5min 失活 TransScript RT。將得到的cDNA分裝后-20° C保存。② PCR
利用逆轉(zhuǎn)錄所得模板進(jìn)行PCR,體系為25μ Ι,ΙΟμπιοΙ/L上、下游引物各1μ 1，2. 5mmol/L dNTP 4 μ I, 2XGC buffer II 12. 5 μ 1，cDNA 模板 I. 5 μ 1，酶 0· 3 μ 1，加ddH20 4. 7 μ I0 兩次 PCR 的反應(yīng)程序均為95。C 5min，(95。C 30s, 56° C 30s, 72° Clmin), 30個(gè)循環(huán)，最后72 ° C延伸lOmin。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用膠回收試劑盒回收得到約723bp的DNA條帶，克隆入pMD19-T載體(TaKaRa，Japan)，經(jīng)含Amp抗生素(50mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉(zhuǎn)化子，挑出陽(yáng)性克隆送往上海英駿測(cè)序公司進(jìn)行喊基序列測(cè)定，其全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID NO. I所不,編碼的蛋白的氣基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。(3)同源檢索將所得序列向http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/提交克隆得到的cDNA序列在GenBank、EMBL和DDBJ國(guó)際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性搜索及同源性分析。經(jīng)ClustalW軟件做同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)它具有一般物種LIGHT基因所具有的兩個(gè)保守半胱氨酸(cys)以及TNF家族同源結(jié)構(gòu)域，所以可以確定該序列是狗LIGHT的全長(zhǎng)cDNA。同源比對(duì)結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例2
狗LIGHT重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
根據(jù)實(shí)施例I中獲得的狗LIGHT的全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物dsLIGHTl和dsLIGHT2。其中dsLIGHTl的5’端具有酶切位點(diǎn)，dsLIGHT2的5’端具有Viz7i////酶切位點(diǎn)。以狗脾臟組織提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄到得的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以dsLIGHTl和dsLIGHT2為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增該基因可溶區(qū)，如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ IDN0.4 所示。反應(yīng)體系為2 X GC Buffer II 12. 5 μ I, dNTP (2. 5 mM)4 μ I, dsLIGHTl (10μ mol/L) I μ l，dsLIGHT2(10 μ mol/L) I μ 1,Η20 4. 7 μ l,cDNA I. 5 μ l,pfu Taq O. 3μ I。反應(yīng)條件如下95 ° C 5 min, (95 ° C 30 S，56 ° C 30 S，72 ° Cl min)，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ° C延伸7 min，之后將PCR產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物用切，pET43. Ia載體(Novagen，USA)也進(jìn)行相同雙酶切，T4 DNA Ligase連接，得到圖3所示的重組質(zhì)粒PET43. la-dsLIGHT (d代表dog ；s代表該基因胞外可溶功能區(qū)soluble)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化疋coli DH5a中，獲得含pET43. la-dsLIGHT重組菌株。挑選陽(yáng)性重組菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)提取PET43. la-dsLIGHT重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，挑選陽(yáng)性菌株誘導(dǎo)表達(dá)。引物序列如下
dsLIGHTl: CGCGGATCC CTGACTCAAGAGCGGAGGTC (SEQ ID NO. 9)dsLIGHT2: CCCAAGCTT TCACACCATGAAAGCCCCAAA (SEQ ID NO. 10)
經(jīng)過(guò)多次預(yù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌培養(yǎng)到0D_ O. 6時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，IPTG終濃度為O. 2 mM,誘導(dǎo)溫度16°C,轉(zhuǎn)速120 rpm誘導(dǎo)20 h,目的蛋白多以可溶形式表達(dá)。4 °C,8000 rpm離心收菌，冰上超聲破碎(160 W，工作4 S，暫停8 S，共120次)表達(dá)菌體，4 °C，12，500 X g，20min離心超聲破碎液后，棄沉淀，收集上清過(guò)Ni+-NTA柱。簡(jiǎn)要過(guò)程是Binding Buffer(20 mmol/L Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8. 0)平衡 Ni+-NTA 柱后，將含有可溶性重組蛋白的上清緩慢上樣，上樣結(jié)束后先用Washing buffer (20 mmol/LImidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8. 0)洗去雜蛋白，再用不同濃度的咪唑Tis HCl洗脫，目的蛋白主要在洗脫濃度為250 mmol/L Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris HCl, pH 8. O洗脫下來(lái)。分管收集洗脫目的蛋白，20 mmol/L Tris HCl透析過(guò)夜除鹽。SDS-PAGE檢測(cè)各收集管蛋白純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。如圖4(條帶4)所示，表達(dá)得到的目的蛋白經(jīng)Ni+-NTA柱純化得到純度達(dá)95%的目的蛋白。Western 印記分析
Western-blot中所用一抗為鼠抗His6單抗，二抗為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。其簡(jiǎn)要步驟是將樣品先進(jìn)行SGS-PAGE，然后以浸入式法將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上,用記號(hào)筆標(biāo)記蛋白marker各條帶，然而依次經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉Ih,與一抗孵育lh，與HRP標(biāo)記的二抗IgG孵育lh，每步完成后均嚴(yán)格洗膜，最后加TMB避光顯色。 結(jié)果如圖3 (條帶5)所示在目的蛋白位置出現(xiàn)了特異性條帶。實(shí)施例3
將實(shí)施例I獲得的狗LIGHT cDNA通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組狗LIGHT蛋白，作為犬類免疫增強(qiáng)劑，從而提高這些物種抗微生物和病毒感染的能力。實(shí)施例4
將實(shí)施例I獲得的狗LIGHT cDNA通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法，轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，增加其免疫力，在飼養(yǎng)中應(yīng)用。按照本發(fā)明的方法可以通過(guò)現(xiàn)有基因工程技術(shù)，修飾狗腫瘤壞死因子14基因并用于所述研究和生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.狗腫瘤壞死因子14CDNA，其特征在于它的序列如SEQID NO. I所示。
2.—種權(quán)利要求I所述的狗腫瘤壞死因子14cDNA的克隆方法如下 (1)TRIzol法提取狗脾臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一條鏈； (2)根據(jù)狗的基因組設(shè)計(jì)嵌套引物 正義寡核苷酸引物dLIGHT-Fl :5’ - ATCTGCTCAGGCATGGAGGA-3’ 反義寡核苷酸引物dLIGHT-Rl :5’ - TCTGTCAGACCCCCATTCAGT-3’ 正義寡核苷酸引物dLIGHT-F2 :5’ - CAGCATCATCGATGGAGGA-3’ 反義寡核苷酸引物dLIGHT-R2 :5’ - TCACACCATGAAAGCCCCAAAG-3’ (3)通過(guò)RT-PCR方法，以上述引物兩對(duì)引物，擴(kuò)增出723bp的片段； (4)將上述引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆入PMD19-T載體，并進(jìn)行測(cè)序堿基序列測(cè)定；得到了狗LIGHT基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
3.狗腫瘤壞死因子14，其特征在于它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.一種重組表達(dá)載體pET43. la-dsLIGHT的構(gòu)建方法，其特征在于是根據(jù)權(quán)利要求I所述狗腫瘤壞死因子HcDNA序列設(shè)計(jì)引物dsLIGHTl和dsLIGHT2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如SEQ ID NO. 3所示的狗LIGHT基因胞外可溶區(qū)，將PCR產(chǎn)物割膠回收，回收產(chǎn)物和pET43. Ia豫體覓BamHI琳HindIII雙酶切，T4 DNA Ligase連接酶切后的載體和PCR產(chǎn)物，得到pET43. la-dsLIGHT ;所述引物 dsLIGHTl 和 dsLIGHT2 序列分別如 SEQ ID NO. 9 和 SEQ IDNO. 10所示。
5.一種權(quán)利要求I所述的狗腫瘤壞死因子14cDNA的重組應(yīng)用，是通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組狗腫瘤壞死因子14蛋白，作為犬類免疫增強(qiáng)劑。
全文摘要
狗腫瘤壞死因子14(TNFSF14/LIGHT)基因和蛋白質(zhì)制備及應(yīng)用,涉及生物基因工程領(lǐng)域。狗腫瘤壞死因子14具有SEQIDNO.1所示的序列。其克隆方法如下TRIzol法提取狗脾臟總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；根據(jù)狗基因組序列設(shè)計(jì)嵌套引物進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，獲得723bp的擴(kuò)增片段，經(jīng)測(cè)序?yàn)楣纺[瘤壞死因子LIGHT的全長(zhǎng)序列。將胞外可溶段連接到pET43.1a原核質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，Ni+-NTA柱純化后得到的重組蛋白His6-dsLIGHT。所述的狗腫瘤壞死因子14(LIGHT)的cDNA可通過(guò)現(xiàn)有基因工程的方法，生產(chǎn)重組dLIGHT，用于進(jìn)一步的研究。
文檔編號(hào)C07K14/525GK102864155SQ20121035876
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者張雙全, 劉霞 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)