專利名稱：一種加氧酶基因caceO及其編碼的蛋白質和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于應用環境微生物和農業領域，涉及一種加氧酶基因caceO及其編碼的蛋白質和應用。
背景技術：
除草劑的使用在減輕農業勞動強度、保證農業正常生產的同時，其殘留也帶來了嚴重的作物藥害問題，據統計我國每年農田受除草劑藥害面積達到3000萬畝，其中嚴重藥害面積達到500萬畝，每年造成幾十億元的損失，而抗除草劑轉基因是解決除草劑藥害的最佳途徑。氯代乙酰胺類除草劑是一類高效、高選擇性的觸殺性除草劑，對禾本科雜草具有非常顯著的殺除效果。氯代酰胺類除草劑是目前國際上大量使用的除草劑之一，至2007年，年產量與使用面積僅次于有機磷除草劑，居世界第二位，其主要代表品種甲草胺、乙草胺和丁草胺，其中以乙草胺的使用量最大。隨著農業勞動力的減少和農業耕種方式的改變，該類除草劑的需求和使用量還將持續增加。氯代乙酰胺類除草劑化學性質較穩定，在土壤殘留期長，并且該類除草劑及其代謝產物會從土壤遷移進入地下水，造成生活水源污染。研究表明該類除草劑有些品種具有致畸變和致突變性，甲草胺、乙草胺和丁草胺被美國環保局定為B-2類致癌物，異丙甲草胺被定為C類致癌物(USEAP，1994)，因此，環境及農產品中氯代乙酰胺類除草劑殘留嚴重危害人類健康。

氯代乙酰胺類除草劑對魚類有很強的毒性，比對哺乳動物的毒性大500-10000倍，因此該類除草劑進入水體將會對漁業資源帶來嚴重的危害。乙草胺和丁草胺對土壤微生物數量及土壤中細菌、放線菌、真菌生長速率均有抑制作用，并顯著降低土壤微生物多樣性。此外，氯代乙酰胺類除草劑如乙草胺和丁草胺對農作物具有較嚴重的藥害，特別是在有機質含量較低的砂型土壤、或用藥量過大、或施藥后遇持續低溫高濕天氣時，會嚴重影響作物的生長，近年來我國因乙草胺和丁草胺因使用不當帶來的作物藥害時有發生，對農業造成嚴重的損失。因此，土壤和水體環境中氯代乙酞胺類除草劑殘留污染嚴重危害人類健康、破壞生態環境及對作物具有嚴重藥害。獲得氯代乙酰胺類除草劑的降解菌株和降解基因在治理除草劑殘留，消除其藥害技術研發中具有以下作用和功能，(一)通過現代生物技術將降解基因導入作物構建相應的能降解氯代乙酰胺類除草劑抗性轉基因作物，(二)用于土壤、水體中除草劑氯代乙酰胺類除草劑殘留中間產物的消除，(三)用于有用化工產品及藥物合成的生物轉化。因此降解基因在消除該類除草劑藥害及生物轉化領域中具有非常重要的理論和應用價值。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一個新的降解甲草胺、乙草胺和丁草胺等多種氯乙酰胺除草劑的加氧酶基因caceO。本發明的另一目的是提供該基因編碼蛋白質。本發明的又一目的是提供該基因及其編碼的蛋白質的應用。本發明的目的通過如下技術方案實現:一個降解氯乙酰胺除草劑的加氧酶基因caceO，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。本專利所用的出發菌株為一株能夠降解氯乙酰胺除草劑的細菌菌株Sphingobiumsp.DC-2 (保藏于中中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2012190)。通過多次傳代獲得了一個該菌株的突變株DC-2MUT(保藏日期2013.4.28，保藏號為:CCTCCN0:M2013164)。菌株DC-2MUT (CCTCCNO:M2013164)失去了降解甲草胺、乙草胺和丁草胺等氯乙酰胺除草劑的能力。菌株DC-2降解乙草胺的第一步反應是在一個加氧酶的催化下生成生成2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺。降解氯乙酰胺除草劑的加氧酶基因caceO的獲得是采用生現代生物信息學手段獲得(技術路線見圖1)。即通過比較野生株DC-2和突變株DC-2MUT的基因組信息，尋找在野生株DC-2基因組存在，但在突變株DC-2MUT中缺失的加氧酶基因。首先提取野生株DC-2和突變株DC-2MUT的總DNA，把總DNA進行基因組測序，組裝，KEGG數據庫比對。測序結果表明，野生株DC-2基因組大小為6，334，837bp，481個scaffold ;突變株DC-2MUT基因組大小為 6，325，634bp，892 個 scaffold。經過對野生株DC-2 (CCTCCNO:M2012190)和突變株 DC-2MUT (CCTCCNO:M2013164)比對，發現在野生菌株總基因組中一個Rieske (2Fe_2S) domain-containing蛋白類型的加氧酶基因在突變株DC-2MUT中丟失了，該蛋白和Sphingomoans Rffl中的一個加氧酶vanillate monooxy genase同源性43%。將包含該基因的1.2K片段通過PCR從野生菌株中擴增出來酶連在pBBRlMCS-5構建重組載體，通過轉化的方法導入到E.coli DH5 α，獲得了重組菌株Ε.coli DH5 a -CaceO，通過三親結合將包含該加氧酶基因的重組載體互補到突變株DC-2MUT獲得重組菌株DC-2MUT-Cace0 (技術流程見圖2)。檢測了重組菌株E.coliDH5 a -CaceO和DC-2MUT-Cace0對甲草胺、乙草胺和丁草胺的降解情況，結果表明獲得該加氧酶基因的重組菌株E.coli DH5 a -CaceO和DC-2MUT_Cace0均獲得了降解甲草胺、乙草胺和丁草胺的能力，表明該基因確實為降解氯代乙酰胺除草劑的目標基因，將該基因命名為caceO。氣質聯用檢測了 E.coli DH5 a-CaceO對乙草胺的降解代謝產物，結果表明Ε.coli DH5 a -CaceO水解乙草胺生成2_氣-N- (2~乙基_6_甲基苯基)乙酸胺(見圖3)。所述的加氧酶基因caceO編碼的蛋白質CaceO，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。含有所述的加氧酶基因caceO的重組表達載體pBBRlMCS5_cace0。含有所述的重組表達載體pBBRlMCS5-cace0的基因工程菌株Ε.coliDH5a -CaceO。所述的加氧酶基因caceO在降解和轉化氯乙酰胺除草劑中的應用。其中所述的氯乙酰胺除草劑優選甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一種或多種。所述的含有加氧酶基因caceO的重組表達載體在降解和轉化氯乙酰胺除草劑中的應用。其中所述的氯乙酰胺除草劑優選甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一種或多種。所述加氧酶基因caceO在構建抗氯乙酰胺除草劑的轉基因作物中的應用。其中所述的氯乙酰胺除草劑優選甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一種或多種。
所述加氧酶CaceO在降解氯乙酰胺除草劑中的應用。其中所述的氯乙酰胺除草劑優選甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一種或多種。所述加氧酶CaceO在去除土壤、水體中氯乙酰胺除草劑殘留中的應用。其中所述的氯乙酰胺除草劑優選甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一種或多種。本發明的有益效果如下:本發明出發菌株為一株鞘酯菌(Sphingobium.sp.)DC_2 (CCTCCNO:M2012190)，菌株DC-2能夠降解乙草胺生成2-乙基-6-甲基苯胺；降解甲草胺和丁草胺生成2，6 二乙基苯胺。在此基礎上，從菌株DC-2中克隆到降解甲草胺、乙草胺和丁草胺的加氧酶基因caceO。在GenBank比對結果表明該基因為一個新的基因，全長(從起始密碼子到終止密碼子)為1047bp，編碼348個氨基酸。該基因能夠降解氯乙酰胺除草劑，可在構建抗氯乙酰胺除草劑的轉基因作物中應用。該基因的編碼蛋白可在降解氯乙酰胺除草劑或除土壤、水體中氯乙酰胺除草劑殘留中應用。


圖1降解氯代乙酰胺類除草劑的加氧酶caceO基因克隆技術路線圖。圖2加氧酶基因caceO功能驗證技術路線圖。圖3A圖為乙草胺標準品液相檢測圖譜；B圖為重組菌株E.coli DH5 a -CaceO降解乙草胺的液相檢測圖譜；C圖為B圖中產物的質譜圖。D圖為甲草胺 標準品液相檢測圖譜E圖為重組菌株Ε.coli DH5 a -CaceO降解甲草胺的液相檢測圖譜；F圖為E圖中產物的質譜圖。G圖為丁草胺標準品液相檢測圖譜H圖為重組菌株Ε.coli DH5 a -CaceO降解丁草胺的液相檢測圖譜；I圖為H圖中產物的質譜圖。生物材料保藏信息氯代乙酰胺類除草劑降解菌DC-2,分類命名為Sphingobium quisquiIiarumDC-2,保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址為中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M2012190，保藏日期為 2012 年 5 月 30 日。突變株DC-2MUT，分類命名為Sphingobium sp.DC-2MUT，保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址為中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M2013164，保藏日期為2013年4月28日。實施例1.乙草胺降解基因的克隆(策略圖見圖1)1.1突變株DC-2MUT的獲得常溫下乙草胺的水溶性225mg/kg，所以含有400mg/kg乙草胺的LB平板產生渾濁，降野生菌株DC-2 (CCTCC NO:M2012190)劃線在LB平板(含有400mg/kg乙草胺)上30°C培養時會有透明圈的出現，以此肉眼簡單的來判斷乙草胺的降解。然而經過多次傳代，發現一個菌落其周邊沒有產生透明圈。挑選此菌落至100ml LB液體培養基中，待菌株培養至對數后期,6，000離心蒸懼水洗漆2遍,重懸至20ml (含100mg/kg乙草胺)無機鹽驗證效果。結果表明其丟失了降解乙草胺的功能，命名此菌株DC-2MUT (CCTCC NO:M2013164)。1.2細菌基因組總DNA的提取菌株DC-2 (Sphingobium sp.) (CCTCCNO:M2012190)及 DC-2MUT (CCTCC NO:M2013164)大量培養后，采用高鹽結合CTAB法提取高純度、大片段的DC-2的基因組總DNA，溶于TE緩沖液(pH8.0)中，置于_20°C保藏，具體方法參考F.奧斯伯等編的《精編分子生物學實驗指南》。1.3DNA樣品寄送與檢測細菌基因組測序要求樣品OD值在1.8-2.0之間，濃度越高越好，濃度不低于30ng/μ L，達到精細圖至少需要樣品量30微克。將準備好的足量的DNA樣品在干冰保溫下寄送至美吉生物科技。樣品檢測采用:1.濃度檢測，瓊脂糖凝膠電泳定量；2.0D260:280和0D260/230檢測方法:NanoDrop。1.4菌株基因組測序DNA樣品檢測合格后建庫，測序，并對數據進行基本分析(包括堿基識別、過濾接頭序列、去污染)。然后進行后續生物信息分析，主要包括基因組序列組裝、基因組成分分析、基因功能注釋以及比較基因組分析等。1.5測序片段組裝與分析運用SOAPdenovo組裝軟件對reads數據進行組裝,得到scaffold序列并作相關基本數據統計。1.6基因預測與功能注釋采用Glimmerf.0基因預測軟件對組裝結果進行基因de novo預測，并對預測的基因與數據庫比對并進行功能注釋?；蜃⑨屩饕诘鞍仔蛄斜葘?。將基因的序列與各數據庫進行比對，得到對應的功能注釋信息。由于每一條序列可能會有許多比對結果，這里為了保證其生物意義，我們保留一條比對效果最好的結果，作為此條基因的注釋。所有的注釋均使用BLAST軟件結合各個數據庫的特點完成。BLAST的版本為:blastall2.2.21，供注釋的蛋白庫為:KEGG、GO
坐寸ο1.7菌株DC-2基因組和DC-2MUT基因組的比較基因組測序結果，野生株DC-2基因組大小為6，334，837bp，481個scaffold，大于IOOObp的scaffold有388個，通過de novo預測共6612個ORF ;突變株DC-2MUT基因組大小為 6, 325, 634bp, 892 個 scaffold,大于 IOOObp 的 scaffold 有 704 個,通過 de novo 預測共 6779 個 0RF。采用0MIGA3.0將菌株DC-2MUT的892個scaffold與野生菌株DC-2基因組——比較，結果發現，野生菌株DC-2基因組中有50個片段大約20KB序列在DC-2MUT中沒有找到。20KB的序列中有可能含有傳代過程中丟失的功能片段。然后對20KB的序列進行ORF預測，蛋白的翻譯，重點尋找Rieske (2Fe_2S) domain-containing蛋白類型的加氧酶,把這些加氧酶放在NCBI網上Blast,比對結果發現其中一個Rieske (2Fe_2S) domain-containing蛋白類型的加氧酶和Sphingomoans R fflvanillate monooxygenase同源性43%,命名此蛋白為CaceO，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，相應的基因為caceO，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。1.8設計引物對含caceO片段PCR擴增驗證根據含caceO片段設計引物對野生菌株DC-2菌落及突變菌株DC-2MUT菌落進行PCR擴增，結果只有野生菌株DC-2中能擴增到相應的片段。1.9野生菌株DC-2PCR產物測序將1.7中的PCR產物TA克隆到pMD_18T simple載體上送至南京金絲瑞生物科技公司測序。結果與預測的片段100%同源。實施例2加氧酶基因caceO功能驗證技術路線圖(策略圖見圖2)2.1菌株DC-2基因組DNA提取同 1.12.2包含caceO基因的1.2K核酸片段PCR擴增以 if 向引物:5-CGGGATCCCGGCCAGTTCCGCCGCCCCAAAATCCA (SEQ ID N0.3)下劃線為 EcoR I 酶切位點和反向引物:A2:5-CGGAATTCCGCTACCCCGCCGACACAGCGACGACC (SEQ IDN0.4)下劃線 BamH I 酶切位點為引物，用 PCR 從 Sphingobium DC-2 (CCTCCNO:M2012190)基因組DNA中擴增1.2K_cace0。擴增體系:
Prime STAR TacM (5U/u I)0.5 μ I
^XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Pius)25 μ I
dNTP Mixture (各2.5mM)5 μ I
模板DNA10 ng 正向引物(20μΜ) Inl 反向引物(20μ Μ) I P I
滅菌蒸餾水至50 μ IPCR擴增程序: a.98 O 變性 Imin ；b.98°C變性 15s，53°C退火 15s，72°C延伸 70s，進行 30 個循環；c.72°C延伸lOmin，冷卻到室溫。2.3PCR 產物用 BamH I 和 EcoRI 雙酶切。酶切體系:Nde II μ IEcoRII μ IDNA^ I μ g滅菌的蒸餾水加至 20 μ I在37°C水浴中，反應IOh以上。酶切產物進行0.75%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。2.4pBBRlMCS-5 (購自上海北諾生物科技有限公司)用BamH I和EcoRI雙酶切(參考 2.3)。
2.5 轉化2.3中的回收片段和2.4中酶切好的pBBRlMCS-5進行酶連。酶連好pBBRlMCS5-cace0重組質粒轉化到E.coli DH5 α (購自 TransGen Biotech)獲得重組Ε.coliDH5a-CaceO，挑取陽性克隆子。E.coli DH5 a-CaceO 在輔助菌 E.coli HB101 (pRK600)(購自Novegen公司)的輔助下，將pBBRlMCS5_cace0互補到突變株DC_2MUT(降解乙草胺性狀丟失)中，結合子涂布在含有100mg/kg Str和50mg/kg Gm的LB平板上,長出的單菌經過提取質粒驗證，獲得陽性克隆子DC-2MUT-Cace0。2.6基因工程菌株降解效果的驗證及產物的鑒定將E.coli DH5 a -CaceO 和 DC-2MUT_Cace0 接種到含有 50mg/kg Gm 的 100LB 液體中生長至對數中后期，離心收集菌體，用滅過菌的蒸餾水離心洗滌菌體2遍。然后菌體分別添加在含IOOmg.Γ1甲草胺、乙草胺和丁草胺的基礎鹽培養基中，使基礎鹽培養基0D_=2，37°C,180r.mirT1搖床培養48h?；A鹽培養基配方為:5.0g.L—1葡萄糖，1.0g -T1NH4NO3,
1.0g.L-1NaCl, 1.5g.L-1K2HPO4, 0.5g.L-1KH2PO4, 0.02g.L-1MgSO4.7Η20, IOOmg.L-1 維生素Β12，調節pH到7.0。采用高效液相色譜測定降解效果，方法如下:首先往上述基礎鹽培養基中分別加入等體積的二氯甲烷進行全量提取，劇烈振蕩后靜置分層，然后取Iml下層二氯甲烷揮發完全后，加入ImL甲醇溶解(色譜純)，用濾膜(孔徑0.22 μ m)過濾。液相色譜條件:流動相為甲醇:水(80:20, V/V), Zorbax C2180DS Spherex 反相柱(5 μ m, 4.6mmX 250mm, Agilent,USA)，柱溫為室溫，紫外檢測器，測定波長230nm，進樣量20 μ L，流速為0.8mL.min-1。結果見圖3。余下的濾液取IOyL采用氣質聯用檢測的提取液中的成分，檢測方法:柱型:BD-5MS石英毛細管柱(15mX0.25_Χ0.25μπι);樣品進樣量:2yL;分流比:30 ;載氣:氦氣；載氣流速lml/min ;進 樣口溫度為230°C，柱溫為200°C。一級質譜條件:離子檢測方式為多反應離子檢測；離子極性為負離子；離子化方式為電噴霧離子化；毛細管電壓為4000伏；干燥氣溫度:330°C ;干燥氣流速:10.0L/min，霧化氣壓力:35psi，碰撞電壓:135伏；質量掃描范圍(m/z):300-500。二級子離子質譜條件:碰撞電壓:90伏；質量掃描范圍(m/z):30-400。結果顯示，基因工程菌株催化乙草胺水解生成2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺，水解甲草胺和丁草胺生成2-氯-N- (2,6- 二乙基苯基)乙酰胺。
權利要求
1.一個降解氯乙酰胺除草劑的加氧酶基因caceo，其特征在于核苷酸序列為SEQ IDNO. I。
2.權利要求I所述的加氧酶基因caceO及編碼的蛋白質CaceO，其特征在于氨基酸序列為 SEQ ID NO. 2。
3.含有權利要求I所述的加氧酶基因caceO的重組載體pBBRlMCS5-caceO，其特征在于將包含權利要求I所述的加氧酶基因caceO的核酸片段插入pBBRlMCS_5的BamH I和EcoR I位點之間所得。
4.含有權利要求I所述的加氧酶基因caceO的基因工程菌。
5.根據權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌是將權利要求3所述的重組載體pBBRlMCS5_caceO導入大腸桿菌E. coll DH5 α獲得。
6.權利要求I所述加氧酶基因caceO在降解和轉化氯乙酰胺除草劑中的應用，所述的氯乙酰胺除草劑優選自甲草胺、乙草胺、丁草胺中的一種或多種。
7.權利要求I所述加氧酶基因caceO在構建抗氯乙酰胺除草劑轉基因作物中的應用。
8.權利要求2所述的加氧酶CaceO在降解氯乙酰胺除草劑中的應用。
9.權利要求2所述的加氧酶CaceO在去除土壤、水體環境中氯乙酰胺除草劑殘留中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述的氯乙酰胺除草劑選自甲草胺、乙草胺、丁草胺中的一種或多種。
全文摘要
本發明公開了一種加氧酶基因caceO及其編碼的蛋白質和應用。本發明克隆的加氧酶基因caceO序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼產物CaceO序列為SEQ ID NO.2。CaceO能催化乙草胺水解生成2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺，水解甲草胺和丁草胺生成2-氯-N-(2，6-二乙基苯基)乙酰胺。CaceO可用于構建通過降解甲草胺、乙草胺和丁草胺而獲得抗這些除草劑的轉基因作物，也可用于土壤、水體中甲草胺、乙草胺和丁草胺殘留的消除和化工產品的生物轉化，具有非常重要的理論和應用價值。
文檔編號A62D101/28GK103255154SQ201310182539
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月16日 優先權日2013年5月16日
發明者何健, 陳青, 李怡, 閆新, 蔣建東, 洪青, 黃星, 李順鵬, 朱建春 申請人:南京農業大學