專利名稱：用于水解苯脲、氨基甲酸酯和有機磷酸酯的酶和方法
技術領域：
本發明涉及能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的酶，以及編碼這些酶的多核苷酸。本發明還涉及用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法。
背景技術：
苯脲除草劑敵草隆(N' -3,4- 二氯苯基N- 二甲基脲)是廣泛用于耕作和非耕作區的具有寬靶向范圍的系統性光合作用抑制劑。作用方式是經由抑制光合作用中的Hill 反應(Wessels和Van der Veen，1956)，通過結合于光系統II活性中心并阻斷電子傳遞而防止氧產生(Stein 等，1984 ；Sinning, 1992)。敵草隆是一種環境隱憂，原因在于其非現場(off-site)除草劑效應及其毒性，以及其初級代謝物3，4-二氯苯胺(DCA)的非現場除草劑效應及其毒性。敵草隆和DCA被懷疑具有遺傳毒性(Osano等，2002 ；Canna-MichaeIidou等，1996)。正常噴灑作業(Gooddy等， 2002)可導致敵草隆滲至地面(Spliid和Koppen，1998 ；Field等，2003)、表面(Thurman等， 2000 ；Gerecke等，2001a)，以及最終至海水(Gerecke等，2001b)。由于其緩慢的化學水解和光解速率(Salvestrini等，2002 ;0kamura，2002)，敵草隆是環境持久的。通過依據歐盟委員會水框架指令(2000/60/EC)(建議在2020年前逐步淘汰敵草隆使用)的No 2455/2001/ EC決議審議，敵草隆被列為重點有害物質。隨后歐盟委員會指導性提案(COM(2006) 397)闡明敵草隆為歐洲主要水隱憂的重點物質，應當減少其傳播、排放及損耗。微生物降解被認為是敵草隆降解的主要途徑，其在土壤中的半衰期估計少于一年 (Okamura, 2002 ；Wauchope等，1992)。除了微生物群落和真菌分離株外，顯示許多細菌菌株催化分解代謝一系列苯脲除草劑，包括敵草隆(Sorensen等，2003 ；Giacomazzi和Cochet， 2004)。例如，球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)D47降解若干苯脲，按利谷隆> 敵草隆>單利谷隆> 甲氧隆>異丙隆的速度排序(Cullington和Walker，1999 ；Turnbu 11 等，2001a)。隨后，發現節桿菌(Arthrobacter sp.) N2菌株降解敵草隆、綠麥隆和異丙隆 (Widehem等，2002 ；Tixier等，2002)。兩種節桿菌都不完全礦化敵草隆和積累敵草隆水解造成的DCA。相反，假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株BK8和貪噬菌(Variovorax sp. )SRS16 完全礦化敵草隆(El-Deeb 等，2000 ；Sorensen 等，2008)。第一個純化的苯脲水解酶被發現是球形桿菌(Bacillus sphaericus)的75kDa的酶，已報道其催化許多N-甲氧基-N-甲基苯脲的分解，包括利谷隆、單利谷隆、溴谷隆和氯溴隆(Engelhardt 等，1971 ；Engelhardt 等，1973 ； Wallnofer, 1969)。然而，沒有觀察到 N-二甲基苯脲底物的代謝周轉(turnover)，包括敵草隆。迄今為止，Turnbull等(2001b) 的鑒定是敵草隆水解降解基因的唯一遺傳鑒定，其中他們從球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)D47克隆并測序了叫做puhA的苯脲水解酶。序列分析顯示PuhA具有與酰胺基水解酶超家族成員的低水平相似性(Turnbull等，2001b)。酰胺基水解酶超家族中的酶在(β/α )8-桶結構折疊中含有單或雙核金屬中心， 并在碳或磷中心催化酰胺或酯功能團的水解。金屬中心位于組成桶的八個鏈的C-末端，其突出環影響底物特異性。有幾種酰胺基水解酶亞型，其通過充當直接金屬配體的氨基酸的變異而定義(見Seibert和Raushel, 2005)。需要更多的能用來水解例如敵草隆的苯脲的酶。發明概述本發明的發明人鑒定了能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的細菌菌株。此外，發明人鑒定了能用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的酶。因此，本發明提供了基本上純化的和/或重組的多肽，其包括i)SEQ ID NO 1的氨基酸序列，ii)與i)具有至少83%相同性的氨基酸序列，和/或iii) i)或ii)的生物學活性片段，其中所述多肽能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯。在本發明的一個實施方案中，苯脲是N-二甲基取代的苯脲或N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲。所述N- 二甲基取代的苯脲可以是，例如，敵草隆、綠麥隆、優草隆、甲氧隆、異丙隆或非草隆。所述N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲可以是，例如，利谷隆、氯溴隆、溴谷隆或單利谷隆。在本發明的另一個實施方案中，所述多肽對敵草隆、綠麥隆、優草隆、甲氧隆和/ 或非草隆的Km低于包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽。在本發明的一個實施方案中，所述多肽對敵草隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少2倍、更優選至少4倍。在本發明的一個實施方案中，所述多肽對綠麥隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少4倍、更優選至少8倍、更優選至少10倍。在本發明的一個實施方案中，所述多肽對優草隆的Km低于包括SEQ 酸序列的多肽至少2倍、更優選至少5倍。在本發明的一個實施方案中，所述多肽對甲氧隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少2倍、更優選至少3倍。在本發明的一個實施方案中，所述多肽對非草隆的&低于包括SEQ 酸序列的多肽至少8倍、更優選至少12倍、更優選16倍。在一個實施方案中，所述多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的酰胺鍵。在本發明的一個優選實施方案中，所述多肽包括與SEQ ID NO :1具有至少95%相同性的氨基酸序列。在本發明的另一個優選實施方案中，所述多肽可以從分枝桿菌(Mycobacterium sp.)純化。優選地，所述分枝桿菌是在2008年5月16日以保藏號V08/013277保藏于澳大利亞國家計量石if究院(National Measurement Institute)的Mycobacterium brisbanense JKl。在本發明的一個實施方案中，所述多肽與至少一種其它多肽融合。所述至少一種其它多肽可以是，例如，增強本發明中的多肽的穩定性的多肽，或幫助純化所述融合蛋白的多肽。在另一方面，本發明提供分離和/或外源的多核苷酸，其包括i)SEQ ID NO 2的核苷酸序列，ii)編碼本發明中的多肽的核苷酸序列，
ID NO :3氨基 ID NO :3氨基 ID NO :3氨基 ID NO :3氨基 ID NO :3氨基
iii)與i)具有至少80%相同性的核苷酸序列，iv)在嚴格條件下與i)雜交的核苷酸序列，和/或ν)與i)至iv)中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。優選地，所述多核苷酸編碼水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的多肽。在另一方面，本發明提供載體，其包括本發明的多核苷酸。優選地，所述多核苷酸可操縱地連接于啟動子。在另一方面，本發明提供宿主細胞，其包括至少一種本發明的多核苷酸和/或至少一種本發明的載體。該宿主細胞可以是任何類型的細胞。在本發明的一個實施方案中，宿主細胞是植物細胞。在本發明的另一個實施方案中，宿主細胞是細菌細胞。優選地，本發明中的多肽通過本發明的多核苷酸的表達而由所述細胞產生。在另一方面，本發明提供產生本發明的多肽的方法，所述方法包括在使得編碼所述多肽的多核苷酸表達的條件下培養編碼所述多肽的本發明的宿主細胞或編碼所述多肽的本發明的載體，并回收表達的多肽。還提供使用本發明的方法產生的多肽。在另一方面，本發明提供分離的抗體，其特異地結合本發明的多肽。在另一方面，本發明提供組合物，其包括至少一種本發明的多肽、至少一種本發明的多核苷酸、本發明的載體、本發明的宿主細胞和/或本發明的抗體。在另一方面，本發明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的組合物， 所述組合物包括本發明的多肽和/或本發明的宿主細胞。優選地，本發明的組合物還包括一或多種可接受的承載體(carrier)。優選地，本發明的組合物還包括金屬離子。在本發明的一個優選的實施方案，所述金屬離子是二價金屬離子。更優選地，所述金屬離子選自Mg2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+以及其組合。更優選地，所述金屬離子選自Mg2+、Zn2+、C02+以及其組合。在本發明的一個特別優選的實施方案，所述金屬離子是Zn2+。本發明的多肽可以用作可選擇標記檢測宿主細胞。因此，也提供本發明的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸的用途，其用作檢測和/或選擇宿主細胞的可選擇標記。在另一個方面，本發明提供用于檢測宿主細胞的方法，所述方法包括i)在使得細胞可以攝取編碼本發明的多肽的多核苷酸的條件下使細胞或一群細胞與所述多核苷酸接觸，以及ii)通過將來自步驟i)的細胞或其后代細胞暴露至苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯選擇宿主細胞。優選地，所述多核苷酸包括編碼本發明的多肽的第一開放讀框，以及不編碼本發明的多肽的第二開放讀框。在一個實施方案中，所述第二開放讀框編碼多肽。在第二個實施方案中，所述第二開放讀框編碼不翻譯的多核苷酸。在兩個實例中，都優選第二開放讀框可操縱地連接于合適的啟動子。所述不翻譯的多核苷酸可以編碼，例如，催化核酸、dsRNA分子或反義分子。合適的細胞的實例包括但不限于植物細胞、細菌細胞、真菌細胞或動物細胞。優選
8地，所述細胞是植物細胞。在另一個方面，本發明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法， 所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與本發明的多肽接觸。在本發明的一個實施方案，所述多肽由本發明的宿主細胞產生。本文提供的多肽可以在植物中產生，增強宿主植物暴露于苯脲、氨基甲酸酯和/ 或有機磷酸酯時的生長能力。因此，在另一個方面，本發明提供轉基因植物，其包括編碼至少一種本發明的多肽的外源多核苷酸。優選地，所述多核苷酸穩定地整合進植物的基因組。在另一個方面，本發明提供本發明的轉基因植物的部分。優選地，所述轉基因植物的部分是種子。在另一個方面，本發明提供用于水解樣品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將樣品與本發明的轉基因植物接觸。 優選地，所述樣品是土壤。這樣的土壤可以在田里。在另一個方面，本發明提供轉基因非人動物，其包括編碼至少一種本發明的多肽的外源多核苷酸。在另一個方面，本發明提供在2008年5月16日以保藏號V08/013277保藏于澳大利亞國家計量研究院的分枝桿菌(Mycobacterium)分離菌株。所述菌株可以是活的或死的(被殺死)。在另一個方面，本發明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的組合物，所述組合物包括本發明的菌株以及任選地，一或多種可接受的承載體。在另一個方面，本發明提供本發明的宿主細胞、本發明的轉基因植物、本發明的轉基因非人動物、本發明的菌株的提取物，其中所述提取物包括本發明的多肽。在另一個方面，本發明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的組合物，所述組合物包括本發明的提取物，以及任選地，一或多種可接受的承載體。在另一個方面，本發明提供水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與本發明的菌株、本發明的組合物和/或本發明的提取物接觸。在另一個方面，本發明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的聚合海綿或泡沫，所述泡沫或海綿包括固定在聚合多孔支持物上的本發明的多肽。優選地，所述多孔支持物包括聚氨酯。在一個優選的實施方案中，所述海綿或泡沫還包括包埋或摻入多孔支持物之上或里面的碳。在另一個方面，本發明提供用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法， 所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與本發明的海綿或泡沫接觸。可以突變本發明的多肽，并針對所獲得的突變體的改變的活性，例如增強的酶活性，進行篩選。這樣的突變體可以通過本領域公知的技術獲得，包括但不限于體外誘變和 DNA 改組(DNA shuffling)。因此，在另一個方面，本發明提供產生具有增強的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的能力，或對不同類型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯具有改變的底物特異性的多肽的方法，所述方法包括i)改變本發明的最初的多肽的一或多個氨基酸，ii)測定獲得自步驟i)的改變的多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的能力，以及iii)選擇改變的多肽，其與步驟i)中使用的多肽相比，具有增強的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的能力，或對不同類型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯具有改變的底物特異性。步驟i)可以通過本領域公知的合適的技術進行，包括但不限于在編碼核苷酸上的定點誘變、化學誘變和DNA改組(DNA shuffling)。還提供通過本發明的方法產生的多肽。在另一個方面，本發明提供用于篩選能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的微生物的方法，所述方法包括i)在苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯作為單一氮源存在時培養候選微生物， 以及ii)測定微生物是否能夠生長和/或分裂。在另一個方面，本發明提供試劑盒，其包括至少一種本發明的多肽、至少一種本發明的多核苷酸、本發明的載體、本發明的宿主細胞、本發明的抗體、本發明的組合物、至少本發明的植物一個部分、至少一種本發明的菌株、至少一種本發明的提取物和/或至少一種本發明的聚合海綿或泡沫。在另一個方面，本發明提供用于水解氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與基本純化的和/或重組的多肽接觸，該多肽包括i)SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO 3 的氨基酸序列，ii)與i)具有至少40%相同性的氨基酸序列，和/或iii) i)或ii)的生物學活性片段，其中所述多肽水解氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯。本領域技術人員應該清楚所述方法可以通過使氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯接觸以下各項而實施編碼所述多肽的多核苷酸、包含編碼所述多肽的多核苷酸的載體和 /或宿主細胞、包含所述載體的宿主細胞、包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉基因植物或其部分、包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉基因非人動物、在2008年5月16日以保藏號 V08/013277保藏于澳大利亞國家計量研究院的分枝桿菌分離菌株、包括所述多肽的提取物 (其中所述提取物是宿主細胞、轉基因植物、轉基因非人動物或菌株的提取物)和/或包括所述多肽的聚合海綿或泡沫。在本說明書全文中，詞語“包括”及其變形意指包含所述的元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組，而不排除任何其它元素、整體或步驟，或者元素、整體或步驟的組。在本說明書全文中，除非另外具體規定或上下文另外要求，提到單個步驟、事物組合物、步驟的組或事物組合物的組應當包括包括一個以及多個這些步驟、事物組合物、步驟的組或事物組合物的組。
除非另外具體規定，本文描述的每個實施方案加以必要修訂適用于每個其它實施方案。在下文中通過下面非限制性實施例以及參照附圖描述本發明。附圖簡述

圖1.分枝桿菌Mycobacterium brisbanense菌株JKl所造成的敵草隆水解和DCA 積累。3個平行測定的瓶中的敵草隆濃度標為(厶、口、〇)，用閉合標志(▲、圓、·)表示在相同的3個瓶中的DCA濃度。在僅為對照的培養基(X)中沒有觀察到敵草隆的消耗。圖2. puhA和puhB間的同線性以及假定的調控基因tetR。puhA和puhB基因用箭頭表示，指示相對于保守的假定tetR家族轉錄調控子的轉錄方向。顯示了 puhA和puhB基因上游的預測的啟動子區域(-10，-35)以及核糖體結合位點(RBS)。puhA上游的14bp回文序列(用反向箭頭指示)與puhB上游的不完全回文序列類似。圖3.金屬依賴水解酶組A(⑶01299)分歧最大的32個成員當中的PuhA和B的鄰接法系統發育樹。節點的數字是來自1000次重復的自展再抽樣頻率。圖4.用于同源建模的2QS8和PuhB的序列比對。金屬配體以黑體顯示，第二層 (shell)催化殘基以黑體和下劃線顯示。圖5.基于2QS8的PuhB的同源模型。PuhB模型(左)與2G0K活性位點并排顯示。該模型基于圖4中顯示的比對。圖6.在分枝桿菌M. smegmatis中表達的PuhA和PuhB的純化。用含有大致等量的來自每一純化步驟的靶蛋白樣品上樣的10% SDS-PAGE凝膠；無細胞提取物(CFE)、疏水作用層析(HIC)、陰離子交換層析(AEX)和尺寸排阻層析(SEC)。圖7.反應溫度對PuhA(_)和B(A)的活性的影響。測定在指定溫度進行1小時。誤差棒是三個平行測定的標準差。圖8. PuhA( ■)和B( ▲)的穩定性。暴露于㈧各種溫度下10分鐘以及⑶溶劑乙腈[PuhA( ■)和B(A)]和甲醇[PuhA( □)和Β(Δ)](在25°C下1小時的測定) 的殘余活性。誤差棒是三個平行測定的標準差。圖9.苯脲水解酶的動力學數據圖10. PuhA ( ■)和PuhB ( ▲)的pH依賴性。pH依賴性用恒定離子強度緩沖液中的底物敵草隆測量并通過LCMS分析。pH對log(kcat) (A)、pH對log(kcat/Km) (B)和pH對 Kffl(C)作圖證明這些酶具有寬最優pH范圍。圖11.建議的苯脲水解酶催化機制。在活性位點第二層的H273結合苯脲底物。活性位點金屬激活的氫氧化物對底物脲部分中心碳的攻擊和K206對苯胺離去基團的穩定協同發生。圖12. PuhA( □)和PuhB(Δ)的Bmnsted圖。kcat和圖7中N- 二甲基苯脲離去基團的PKaI示出相關性。序列列表關鍵字SEQ ID NO Ι-PuhB 的氨基酸序列SEQ ID NO :2_編碼PuhB的核苷酸序列SEQ ID NO :3_PuhA 的氨基酸序列SEQ ID NO :4_編碼PuhA的核苷酸序列
SEQ ID NO 5-引物(PuhA_petl4b 正向)SEQ ID NO :6_ 引物(PuhA_petl4b 反向)SEQ ID NO -J-引物(PuhB_pET14b 正向)SEQ ID NO :8_ 引物(PuhB_pET14b 反向)SEQ ID NO :9_ 引物(His AB pMV 正向)SEQ ID NO :10_ 引物(PuhA_pMV261 正向)SEQ ID NO 11-引物(PuhB_pMV261 正向)SEQ ID NO 12-引物(PuhA pMV261 反向)SEQ ID NO 13-引物(PuhB pMV261 反向)SEQ ID NO :14_2QS8 的氨基酸序列優選實施方案詳述通用技術除非另外具體定義，本文所用的所有技術和科學術語應當具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的意義(例如，在細胞培養、分子遺傳學、植物生物學和/或植物化學、重組細胞生物學包括轉基因植物、生物除污、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學以及生物化學)。除非另外指明，本發明中使用的重組蛋白、細胞培養和免疫學技術是本領域技術人員眾所周知的標準程序。這樣的技術在文獻中到處被描述和解釋，例如J.Perbal， A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons (1984) ；J. Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) ；T· A· Brown (編輯)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach, Volumes 1 and 2，IRL Press (1991) ；D. M. Glover 禾口 B. D. Hames (編輯)，DNA Cloning A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press (1995 and 1996) ；F. Μ. Ausubel 等 (編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至今的所有更新)；Ed Harlow 和 David Lane(編輯)Antibodies :A Laboratory Manual， Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)； J· Ε· Coligan 等(編輯)，Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括
至今的所有更新)。如本文所用，術語“水解酶”指的是本發明的多肽，其催化苯脲、氨基甲酸酯和/ 或有機磷酸酯的水解。如本文所用，術語“水解(hydrolysis水解作用)”指的是分解的化學過程，包括鍵的裂開并添加來自水的氫陽離子和氫氧根陰離子。對于本文所用“水解 (hydrolyse) ”，是使遭受或遭受水解作用。^M苯脲除草劑一般具有通式結構 其中，R1可以是，例如，CH3 ;R2可以是，例如，CH3或OCH3 ;R3可以是，例如，H、Cl或
12CF3 ；以及 R4 可以是，例如，H、CH3、0CH3、CH(CH3)2、C1 或 Br。大多當前可獲得的苯脲除草劑或者是N-二甲基_取代的化合物(例如，敵草隆、 綠麥隆、伏草隆、甲氧隆、異丙隆和非草隆)或者是N-甲氧基-N-甲基-化合物(例如，利谷隆、氯溴隆、溴谷隆和單利谷隆)。苯脲除草劑一般具有相對高的水中溶解性和低的對土壤的吸附傾向，致使它們在土壤中可移動。在一個優選的實施方案中，本發明的多肽和方法可用于水解N-二甲基脲和/或 N-甲氧基-N-甲基脲。在本發明一個特別優選的實施方案中，本發明的多肽和方法可用于水解敵草隆(N' -3，4-二氯苯基N-二甲基脲)。通常，本發明的多肽通過脲羰基的水解作用將苯脲轉換成苯胺和氨基甲酸，或對于取代苯脲，轉換成相應的取代苯胺(例如，敵草隆水解為3，4-二氯苯胺(DCA)而異丙隆水解為4-異丙苯胺)和N-二甲基或N-甲氧基、N-甲基氨基甲酸(其可以進一步降解為 CO2和二甲基或甲氧甲基胺(Engelhardt，1971))。氨基甲酸酯氨基甲酸酯具有酰胺鍵，其羰基基團也形成羧基酯鍵。氨基甲酸酯農藥衍生自氨基甲酸(HOOC-NH2)并具有通式結構
權利要求
1.基本上純化的和/或重組的多肽，其包括 i)SEQ ID NO 1的氨基酸序列， )與i)具有至少83%相同性的氨基酸序列，和/或 iii)i)或ii)的生物學活性片段，其中所述多肽能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯。
2.權利要求1的多肽，其中所述苯脲是N-二甲基取代的苯脲或者N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲。
3.權利要求2的多肽，其中所述N-二甲基取代的苯脲是敵草隆、綠麥隆、優草隆、甲氧隆、異丙隆或非草隆。
4.權利要求3的多肽，其中所述N-二甲基取代的苯脲是敵草隆。
5.權利要求3或權利要求4的多肽，其對敵草隆、綠麥隆、優草隆、甲氧隆和/或非草隆的Km低于包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽。
6.權利要求2的多肽，其中所述N-甲氧基-N-甲基取代的苯脲是利谷隆、氯溴隆、溴谷隆或單利谷隆。
7.權利要求1的多肽，其中所述氨基甲酸酯是利谷隆酯或DMNPC。
8.權利要求1的多肽，其中所述有機磷酸酯是對氧磷。
9.權利要求1至8中任一項的多肽，其包括與SEQID NO :1具有至少95%相同性的氨基酸序列。
10.權利要求1至9中任一項的多肽，其中所述多肽可以從分枝桿菌純化。
11.權利要求10的多肽，其中所述分枝桿菌是在2008年5月16日以保藏號 V08/013277保藏于澳大利亞國家計量研究院的Mycobacterium brisbanense JK1。
12.權利要求1至11中任一項的多肽，其與至少一種其它多肽融合。
13.分離的和/或外源多核苷酸，其包括 i)SEQ ID NO 2的核苷酸序列， )編碼根據權利要求1至12中任一項的多肽的核苷酸序列，iii)與i)具有至少80%相同性的核苷酸序列，iv)在嚴格條件下與i)雜交的核苷酸序列，和/或v)與i)至iv)中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。
14.權利要求13的多核苷酸，其編碼水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的多肽。
15.載體，其包括權利要求13或權利要求14的多核苷酸。
16.權利要求15的載體，其中所述多核苷酸可操縱地連接于啟動子。
17.宿主細胞，其包括權利要求13或權利要求14的至少一種多核苷酸和/或包括權利要求15或權利要求16的至少一種載體。
18.權利要求17的宿主細胞，其中所述宿主細胞是植物細胞或細菌細胞。
19.產生權利要求1至12中任一項的多肽的方法，所述方法包括在允許編碼所述多肽的多核苷酸表達的條件下培養權利要求17或權利要求18的編碼所述多肽的宿主細胞、或權利要求15或權利要求16的編碼所述多肽的載體，并回收表達的多肽。
20.使用權利要求19的方法產生的多肽。
21.分離的抗體，其特異地結合權利要求1至12中任一項的多肽。
22.組合物，其包括權利要求1至12中任一項或權利要求20的至少一種多肽、權利要求13或權利要求14的至少一種多核苷酸、權利要求15或權利要求16的載體、權利要求17 和權利要求18的宿主細胞、和/或權利要求21的抗體。
23.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的組合物，所述組合物包括權利要求 1至12中任一項或權利要求20的多肽和/或權利要求17和權利要求18的宿主細胞。
24.權利要求22或權利要求23的組合物，其包括一或多種可接受的承載體。
25.權利要求22至M中任一項的組合物，其包括金屬離子。
26.權利要求25的組合物，其中所述金屬離子是Co2+、Si2+和/或Mg2+。
27.權利要求1至12中任一項的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸的用途，其用作檢測和/或選擇宿主細胞的可選擇標記。
28.檢測宿主細胞方法，所述方法包括i)在使得細胞可以攝取編碼權利要求1至12中任一項的多肽的多核苷酸的條件下將細胞或一群細胞與所述多核苷酸接觸，以及ii)通過將來自步驟i)的細胞、或其后代細胞暴露于苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯選擇宿主細胞。
29.權利要求觀的方法，其中所述多核苷酸包括編碼權利要求1至12中任一項的多肽的第一開放讀框，以及不編碼權利要求1至12中任一項的多肽的第二開放讀框。
30.權利要求四的方法，其中所述第二開放讀框編碼多肽。
31.權利要求四的方法，其中所述第二開放讀框編碼不翻譯的多核苷酸。
32.權利要求31的方法，其中所述不翻譯的多核苷酸編碼催化核酸、dsRNA分子或反義分子。
33.權利要求觀至32中任一項的方法，其中所述細胞是植物細胞、細菌細胞、真菌細胞或動物細胞。
34.權利要求33的方法，其中所述細胞是植物細胞。
35.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與權利要求1至12中任一項的多肽接觸。
36.權利要求35的方法，其中所述多肽由權利要求17或權利要求18的宿主細胞產生。
37.轉基因植物，其包括編碼權利要求1至12中任一項的至少一種多肽的外源多核苷酸。
38.權利要求37的轉基因植物，其中所述多核苷酸穩定整合入植物基因組。
39.權利要求37或權利要求38的植物的部分。
40.權利要求39的植物的部分，其是種子。
41.用于水解樣品中苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將樣品與權利要求37或權利要求38的轉基因植物接觸。
42.權利要求41的方法，其中所述樣品是土壤。
43.轉基因非人動物，其包括編碼權利要求1至12中任一項的至少一種多肽的外源多核苷酸。
44.分枝桿菌的分離菌株，其在2008年5月16日以保藏號V08/013277保藏于澳大利亞國家計量研究院。
45.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的組合物，所述組合物包括權利要求 44的菌株。
46.權利要求17或權利要求18的宿主細胞、權利要求37或權利要求38的轉基因植物、權利要求43的轉基因非人動物或權利要求44的菌株的提取物，其中所述提取物包括權利要求1至12中任一項的多肽。
47.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的組合物，所述組合物包括權利要求 46的提取物。
48.水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與權利要求44的菌株、權利要求45或權利要求47的組合物和/或權利要求46的提取物接觸。
49.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的聚合的海綿或泡沫，所述泡沫或海綿包括固定于聚合多孔支持物上的權利要求1至12中任一項的多肽。
50.用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與權利要求49的海綿或泡沫接觸。
51.產生多肽的方法，所述多肽具有增強的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的能力，或對不同類型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯具有改變的底物特異性，所述方法包括i)改變權利要求1至12中任一項的最初多肽的一或多個氨基酸， )測定獲得自步驟i)的改變的多肽水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的能力，以及iii)選擇改變的多肽，其與步驟i)中使用的多肽相比，具有增強的水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的能力，或對不同類型的苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯具有改變的底物特異性。
52.多肽，其通過權利要求51的方法產生。
53.用于篩選能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的微生物的方法，所述方法包括i)在苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯作為單一氮源存在時培養候選微生物，以及 )測定微生物是否能夠生長和/或分裂。
54.試劑盒，其包括權利要求1至12中任一項、權利要求20或權利要求52的至少一種多肽，權利要求13或權利要求14的至少一種多核苷酸，權利要求15或權利要求16的載體，權利要求17或權利要求18的宿主細胞，權利要求21的抗體，權利要求22至沈中任一項、權利要求45或權利要求47的組合物，至少權利要求39或權利要求40的植物的至少一部分，權利要求44的至少一種菌株，權利要求46的至少一種提取物，和/或權利要求49的至少一種聚合海綿或泡沫。
55.用于水解氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法，所述方法包括將氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯與基本上純化的和/或重組的多肽接觸，所述多肽包括i)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的氨基酸序列， )與i)具有至少40%相同性的氨基酸序列，和/或 iii)i)或ii)的生物學活性片段，其中所述多肽能夠水解氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯。
全文摘要
本發明涉及能夠水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的酶，以及編碼這些酶的多核苷酸。本發明還涉及用于水解苯脲、氨基甲酸酯和/或有機磷酸酯的方法。
文檔編號C12N15/06GK102164951SQ200980135008
公開日2011年8月24日 申請日期2009年7月8日 優先權日2008年7月9日
發明者C·J·杰克遜, C·斯科特, G·潘迪, J·G·奧克肖特, J·L·庫拉納, R·J·魯賽爾 申請人:聯邦科學技術研究組織