專利名稱：核酸純化方法
核酸純化方法本發明涉及從含核酸的樣品中純化核酸的方法和試劑盒。現有的技術已公開了各種純化和分離核酸的方法。包括使用苯酚氯仿、鹽析法，使用離子交換劑和二氧化硅顆粒。已知的核酸純化方法是“電荷轉換法”。所述方法包括使核酸結合相在第一 PH值下與含核酸樣品接觸，在第一 Ph值下，核酸結合相帶正電荷。這有利于帶負電荷的核酸與所述相結合。根據電荷轉換原理，通過調整第二 PH值來釋放/洗脫核酸，該第二 PH值高于所述核酸結合相的PKa值，以逆轉或中和正電荷。這促使結合的核酸從核酸結合相解離。現有技術已經公開了可溶相(見，例如，EP 0 707 077)和固相(見，例如，WO 99/29703)。各種溶液用以洗脫，例如具有很高pH的溶液或其它生物緩沖液，特別是低鹽緩沖液諸如，如Tris緩沖液，以使純化的核酸立即作進一步處理，例如用于擴增反應或限制性酶消化。即使當已知純化核酸的方法合適，仍有需要改進現有方法，特別是以一種特別溫和的方法來純化核酸。因此，本發明的目標是改進核酸純化的現有方法。根據本發明，該目標通過至少包括以下步驟的從含核酸的樣品中純化核酸的方法來實現a.將含有核酸的樣品與具有核酸結合基團的核酸結合相接觸，所述核酸結合基團具有至少一個PKa在9到12的可質子化基團；b.在比至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的pH值(結合pH)下
使核酸結合核酸結合相；C.在高于結合pH值，但比至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的 PH值(洗脫pH)下洗脫核酸。本發明涉及使用核酸結合相來純化核酸，所述核酸結合相相應具有核酸結合基團。這種核酸結合基團pKa值為9至12的至少一個可質子化基團。核酸在低于這些可質子化基團中至少一個的PKa值的pH值下結合。所述可質子化基團吸收質子并因此帶有正電，導致核酸結合相結合帶負電的核酸。洗脫在較高的PH值下實施，從而減少核酸結合相的正電。然而，根據本發明，洗脫PH值低于可質子化基團的pKa值，特別是低至少一個pH 單位，優選低至少兩個PH單位。這樣可使洗脫在溫和條件下實施，因而具有相當大的優勢。 因此與現有技術相反，本發明允許在低于可質子化基團PKa值的pH下實施洗脫。根據本發明的一個實施方式，核酸在pH值3到8之間結合。這個信息涉及結合過程中及由此樣品中的PH值。根據固相的設計，本發明方法也可在非常溫和的條件下實施， 因此核酸甚至可在PH值為4到7. 5，優選5到7. 5，特別優選5到7，很特別優選6. 5到7的 PH值下，因此在實際上中性的范圍內結合。由于核酸結合相的可質子化基團的pKa值在9 到12，所述基團即使在相對中性pH值下仍帶正電，從而足以使得核酸有效附著。因此結合可以在非常溫和的條件下實施，以防核酸破壞。此外，已證明在低鹽濃度下實施結合是有優勢的。因此，根據一個實施方式，在核酸與核酸結合相結合時所述鹽濃度小于1M。所述鹽濃度優選小于0. 5M，小于0. 25M或甚至小于0. 1M。為優化核酸與固相的結合，優選低鹽濃度。離子濃度過高對核酸和核酸結合相的離子相互作用具有不利影響。我們已發現所述結合緩沖液也可包含一定量的有機物，例如，碳水化合物，醇類，例如乙醇、甲醇或丙酮和乙腈。這些物質不會損害結合。該方法的另一重要步驟是核酸的洗脫。如所示的，核酸在高于結合PH值的pH值下釋放。因此，可質子化基團在洗脫期間帶有較小的正電，這有利于核酸的釋放。此外，洗脫期間PH值比核酸結合相的至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位。因此， 如上所示，洗脫可以在特別溫和的條件下實施。根據所采用的核酸結合基團或核酸結合相，洗脫優選在pH值7. 5到11，7. 5到10， 優選在8到9或8. 2到8. 8的pH值之間實施。因為核酸以特別溫和的方式釋放，這些低pH 值獲得了特別有利的結果。下文描述了使核酸在低PH值下，以特別有效的方式釋放而采用的其它措施。為了使分離的核酸在洗脫緩沖液中立即接受進一步的加工，所述洗脫緩沖液優選具有低鹽濃度。因此，根據一個實施方式，鹽濃度小于1M，優選小于0.5M，小于0.25M，小于 0. 1M，特別優選小于50mM，小于25mM或甚至小于10mM。適用的鹽可以是堿金屬和堿土金屬的氯化物或銨鹽、其它礦物酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽等以及化合物諸如Tris、Bis-Tris和有機緩沖液，例如MES，CHAPS, HEPES等。此外，現有技術已經描述了適用于洗脫的物質。為了促進純化，優選在核酸結合后和洗脫前至少實施一個洗滌步驟。優選使用低鹽濃度的水性溶液甚至水實施清洗。優選鹽濃度小于400mM的洗滌緩沖液，特別優選小于 200mM、100mM、50mM和/或甚至小于25mM。所述洗滌緩沖液可包含有機組分，例如醇類、多元醇、聚乙二醇、丙酮、乙腈或碳水化合物。然而，所述洗滌緩沖液或許不含干擾量的相應有機組分，以免損害后續應用，例如酶處理、擴增反應等(“下游“應用)。根據本發明，所采用的核酸結合相可以是固體或可溶的。可溶的核酸結合相通常在結合pH值下沉淀核酸，而在洗脫pH值下從該沉淀中釋放所結合的核酸。現有技術中描述了可溶的核酸結合相或聚合物，例如EP 0 707 077。根據優選的實施方式，核酸結合相是固相。為了制備，所述可質子化基團可結合于例如固體支持材料。下文將詳細描述。使用固相促進從樣品中移除結合的核酸。因此，根據一個實施方式，核酸結合后移除固相。根據一個實施方式，所述可質子化基團是或具有離子交換劑，優選陰離子交換劑。 經證明優選的用來結合核酸的可質子化基團是氨基，優選伯氨基和仲氨基。所述氨基優選具有9到12的pKa值，優選10到12。所述核酸結合基團優選具有1到10個，特別優選是 2到8且特別是2到6個氨基。優選的核酸結合基團的實例是伯、仲和叔單胺和多胺。這些可經取代或未取代。實例特別是下式所示胺類R1R2R3N,R1R2N(CH2)nNR3R4R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4R5R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2) 0NR5R6R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2) 0NR5 (CH2) pNR6R7R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2)。NR5 (CH2) pNR6 (CH2) ,NR7R8
R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2) 0NR5 (CH2) pNR6 (CH2) qNR7 (CH2) ,NR8R9R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2)。NR5 (CH2) pNR6 (CH2) qNR7 (CH2) rNR8 (CH2) 8NR9R10其中η、m、ο、ρ、q、r和s值相互獨立為2到8 ；禮、&、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9和Rltl相同或不同，選自由H、烷基(支鏈或非支鏈的)
和芳基組成的組。核酸結合基團特別優選N-丙基-1，3-丙二胺和五亞乙基六胺，尤其優選精胺和亞精胺。此外，也可使用環胺、芳香胺或氨基官能化雜環。所述胺類可具有取代基，例如烷基、烯基、炔基或芳香取代基，此外烴鏈也可封閉成環。烴鏈也可具有雜原子，例如氧、氮、硫或硅或支鏈。其他適用的核酸結合基團是具有一個、兩個或三個氨基的聚氧化烯胺 (polyoxyalkyleneamine)。例如，可用名稱為 “Jeffamine” 的聚氧化烯胺。Jeffamines 包含結合于聚醚骨架末端的伯氨基。所述聚醚骨架可基于環氧丙烷、環氧乙烷或其混合物；也可想到使用其它的骨架區段。如上所述，所述胺類的氨基具有9到12，優選10到12的pKa值。根據本發明，也可以使用相應核酸結合基團的混合物或將其施加于支持物。所述核酸結合基團，例如，胺類可共價地或通過靜電、極性或疏水相互作用結合于支持物。優選以這樣的方法進行連接，以使每個連接的基團經由可質子化基團提供1(例如 N-丙基-1，3-丙二胺)到10個，優選2到8個，特別優選2到6個氨基。所述核酸結合基團的氨基優選不與降低電子密度的基團，例如，羧基、羰基、具有 C-C雙鍵的基團或β-羥乙基結合，結果是，所述氨基的PKa值為9到12。如果一個氨基官能團和相應的電子密度減少基團僅通過三個、兩個或更少的碳原子連接，則認為存在與電子密度降低基團的結合。根據優選的實施方式，所述核酸結合基團結合于固體核酸結合相的支持物以便用于核酸純化。所述核酸結合基團的合適的支持物的實例是有機聚合物，例如聚苯乙烯及它們的衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及它們的衍生物、或聚氨酯、尼龍、聚乙烯、 聚丙烯、聚丁烯、以及這些材料的共聚物。此外，這些核酸結合基團也可連接于多聚糖， 特別是水凝膠，例如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、交聯葡聚糖Gephadex)、聚丙烯酰胺葡聚糖 (Sephacryl)、殼聚糖。此外，所述核酸結合基團也可連接于無機支持物，例如，硅膠、玻璃或其他金屬氧化物及半金屬氧化物、二氧化硅、硼氧化物或金屬表面，例如金。就操作而言，磁性顆粒特別具有優勢。所述核酸結合基團可直接地或通過“間隔臂”結合于所述支持物。它們也可以是較大分子的一部分。間隔臂的實例為烴鏈、聚乙二醇或聚丙二醇及官能化硅烷。 所述間隔臂可是支鏈或非支鏈的。可用于連接核酸結合基團的化學官能團為酰胺或酸酐、環氧化物、三氟代乙烷磺酰基(tresyl)、甲酰基、磺酰氯、馬來酰亞胺或碳二亞胺化學活化羧酸酯基。在本發明范圍內，也可以非共價鍵地通過例如離子相互作用或通過吸附過程來連接核酸結合基團，例如胺類。例如，所述核酸結合基團也可通過硫醇連接到金表面。優選將核酸結合基團連接到羧化表面。
所述支持材料的其它實施方式包括非磁性和磁性顆粒、柱形材料、膜和表面涂層。還有官能化的支持物，諸如管、膜、無紡布、紙張、反應容器諸如PCR容器、“埃氏 (Eppendorf)管”、多盤片、芯片和微陣列。如上所述，本發明另一實施方式涉及可溶性聚合物，根據本發明，所述聚合物包含可質子化基團，根據本發明的原理，所述聚合物能可逆地結合核酸。還可以根據本發明改性的合適的可溶相的實例在例如EP O 707 077中進行了描述。優選的溶劑是水，但是也可以使用聚合物，所述聚合物已經根據本發明被官能化，并且所述聚合物在，例如乙醇的有機溶劑中可溶。令人驚訝的是，我們發現結合緩沖液和洗脫緩沖液中可應用的pH值和鹽濃度與每個核酸結合基團中存在的可質子化基團，特別是氨基的數目相關。因此，在大約50mM的鹽濃度下，核酸甚至可在PH 6下與精胺包被的表面結合，而N-丙基-1，3-丙二胺包被表面的應用優選更低的PH 5. 5，甚至優選pH 5。在50mM的鹽濃度下，從N-丙基-1，3-丙二胺表面洗脫甚至在PH 7. 5下也是成功的，而精胺包被的表面需要約為8.5的pH值。然而，為了通過改變所述支持物以洗脫還需要降低PH值(見下文)。有效的洗脫和因此結合的核酸從核酸結合相的解離對于核酸的純化效率特別重要。在此，令人吃驚地發現不僅核酸結合基團的可質子化基團的PKa值至關重要。核酸結合相的結構和其它官能基團的存在也有助于促進和改善在中性或弱堿性PH值范圍下洗脫。根據一個實施方式，所述核酸結合相額外帶有一些官能基團，所述官能基團可通過例如施加排斥效應來促進在洗脫PH下核酸的洗脫。因此，這些官能基團優選在洗脫期間帶負電。這些基團的PKa值可以是，例如，在0到7的范圍，優選1到5。適用的是，例如，離子交換劑，特別是陽離子交換劑，優選酸性基團諸如，例如羧基。其它適用的基團是甜菜堿、 磺酸鹽或酯、膦酸鹽或酯和磷酸鹽或酯。例如，所述固體支持物可用羧基官能化，以便連接核酸結合基團。用于連接的核酸結合基團的濃度的選擇應使一些羧基是游離的，因此沒用核酸結合基團官能化。這些基團在低PH值下不損害核酸的結合。然而，在較高的pH值下， 它們易帶負電，因此促進核酸從核酸結合基團解離。可以通過選擇核酸結合基團的可質子化基團和可負電離基團，例如羧基之間的長度或距離來促進這種相互作用。這有利地促進低PH值下的洗脫，從而增加產量。在洗脫pH值下對核酸施加排斥效應的所述官能基團的選擇、強度和長度根據所選核酸結合基團，因此特別根據每一核酸結合基團的可質子化基團數量以及它們與洗脫促進官能基團的距離而有所不同。我們還證明，如果核酸結合/可質子化基團彼此以一定距離排列在支持材料上或是被稀釋，也可以增加洗脫效率。根據一個實施方式，可以通過僅用少量核酸結合基團包被支持物來實現核酸結合基團的這種排列。因此優選用亞化學計量的核酸結合基團實施官能化。結果是，核酸結合基團在支持物上基本上被稀釋并且，因此僅有更少的核酸結合基團可用。這樣可促進洗脫因為核酸結合的不太緊密并且因此更易于從核酸結合相再次解離。例如，可以用核酸結合基團官能化支持材料上僅< 50%、< 25%,^ 15%,^ 10%或僅< 5% 的官能基團。如果所述支持材料沒有任何適用的官能基團用于連接核酸結合基團，那么可以先官能化支持材料來為其提供適用的官能基團(見上文)。為了這個目的，也可以通過給支持材料提供相應的較少的官能基團以便連接所述核酸結合基團也可實現用亞化學計量核酸結合基團包被支持材料的合適屬性。
根據另一個實施方式，支持材料用核酸結合基團與“稀釋基團”的混合物包被。本文使用術語“稀釋基團”是為了說明其相對于核酸結合基團的功能。其功能包括調整支持物上的核酸結合基團量，從而也影響了核酸的結合強度。所述稀釋基團的比例越高，應用于支持物的核酸結合基團就越少，且核酸結合的強度越低。所述稀釋基團可帶負電、正電或是中性或具有可電離基團。因此，稀釋基團也可同時具有可促進洗脫的官能基團(見上文)。 相對于稀釋基團，核酸結合基團的比例可以是，例如，彡50K 25K 15%、彡10%或僅 <5%。適用的稀釋基團的實例是胺、二甲胺、二乙胺和氨。根據一個優選的實施方式，一種常見的單胺和多胺的混合物(現有技術已知的)根據本發明應用于支持物。在這個組合中，多胺用于連接核酸，而單胺主要作為稀釋基團起作用。一個適用的稀釋基團的實例可以是乙醇胺。就洗脫條件而言，核酸結合相的pH值可通過選擇/組合所述參數，特別是促進洗脫的官能基團、稀釋基團、和稀釋度以及含核酸結合基團的混合物。因此，可控制或調節核酸結合相的洗脫屬性，特別是洗脫PH值。本發明系統可純化的核酸可以存在于體液，例如血液、尿液、糞便、唾液、痰、或其它體液，可存在于生物來源，例如組織、細胞特別是動物細胞、人體細胞、植物細胞、細菌細胞等，器官，例如肝臟、腎或肺等。此外，核酸也可以從支持材料獲取，例如，棉簽、巴氏涂片， 可從穩定的媒介獲取，例如I^reServCyt或Sur印ath，或從其它液體獲取，例如果汁、水性樣品或通常的食物。此外，核酸也可從植物材料、細菌裂解物、石蠟包埋組織、水性溶液或凝膠中獲取。此外，本發明涉及上述核酸相結合相對于純化核酸的應用。本發明所采用的核酸結合相特別具有核酸結合基團，該基團具有PKa值為9到12的至少一個可質子化基團。優選實施方式已在上文詳細描述(見以上內容)，其特征尤其在于以下一種或是多種特征a)所述核酸結合相為固體或是可溶的；和/或b)所述核酸結合相具有結合于固體支持物的核酸結合基團；和/或C)所述核酸結合相還具有可在洗脫pH值下促進核酸的釋放/洗脫的官能基團，所述官能基團優選陽離子交換劑，特別是羧基；和/或d)特征b)或C)的核酸結合相具有選自下組的支持物有機多聚物諸如聚苯乙烯及它們的衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及它們的衍生物、聚氨酯、尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和這些材料的共聚物，多糖和水凝膠，例如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、交聯葡聚糖、聚丙烯酰胺葡聚糖、殼聚糖，無機支持物，特別是硅膠、二氧化硅顆粒、玻璃或其他金屬和半金屬氧化物、氧化硼、具有金屬表面的支持物，例如金和磁性顆粒；和/或e)所述核酸結合相的核酸結合基團是胺類，特別是伯胺和仲胺；和/或f)特征e)的核酸結合基團特別是精胺和/或亞精胺。本發明進一步提供了用于純化核酸的試劑盒，所述試劑盒的特征在于其具有a)本發明的核酸結合相，所述核酸結合相具有核酸結合基團，而所述核酸結合基團具有PKa值為9到12的至少一個可質子化基團；和b)其pH值比核酸結合相的至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的結合緩沖液，和/或可調節樣品中的PH值至此類pH值的結合緩沖液；c)其pH值比核酸結合相的至少一個可質子化基團的PKa值低至少一個pH單位，但是高于結合緩沖液的PH值的洗脫緩沖液，和/或可調節樣品中的pH值至此類pH值的洗脫緩沖液。核酸結合相和洗脫條件的細節上文已描述，也適用于本發明試劑盒，且表征了其中所用的組分/緩沖液。參考以上公開內容。此外，該試劑盒可包含其他慣用組分，例如裂解液，洗滌和/或中和試劑和/或緩沖液。所述結合緩沖液優選具有至少一項以下特征i.pH值為3到8 ；和/或ii. pH 值為 4 到 7. 5 ；和 / 或iii.pH 值為 4. 5 到 7 ；和 / 或iv. pH 值為 5. 5 到 7 ；和 / 或v. pH 值為 6. 5 到 7 ；和 / 或vi.鹽濃度小于1M、小于0. 5M、小于0. 25M或小于0. IM0所述相應特征的優勢已經在上文與方法相結合進行了說明，參考以上公開內容。根據本發明，洗脫緩沖液可具有至少一項以下特征i.pH 值為 7. 5 到 10 ；和 / 或ii.pH值為8到9 ；和/或土土土.？!1值為8.2到8.8;禾口/或iv.鹽濃度小于1M、小于0. 5M、小于0. 25M、小于0. 1M、小于25mM、小于15mM或 IOmM ；禾口 / 或v.選自下組水、生物緩沖液、有機緩沖液，特別是1^8、1^8^8、1^5、(擬 5和 HEPES0所述相應有關的相應細節和優勢已經在上文與根據本發明的方法相結合進行了說明。參考以上公開內容。相應試劑盒特別適用于本發明方法的范圍內。本發明方法、試劑盒和核酸結合固相尤其可用在分子生物學領域、分子診斷領域、法醫領域、食品分析領域和應用檢測領域。優選可使核酸洗脫后能夠立即接受進一步處理，因此可用于，例如PCR、RT_PCR、限制性酶消化或轉錄。只要洗脫緩沖液是按照上述設計的并優選具有低鹽濃度，不需要進一步的純化。適用于純化的核酸是DNA和RNA，特別是基因組DNA、質粒DNA、還有PCR片段、 cDNA、miRNA、siRNA、以及寡核苷酸和修飾的核酸，例如PMA或LMA。也可以純化病毒或細菌 RNA和DNA或人、動物或植物來源的核酸。DNA/RNA雜鏈也適合本發明純化方法。下面將基于一些實施例對本發明進行說明。這些例子并不是限制性的，而是本發明的優選實施方式。此外，本文引述的所有參考文獻通過引用納入本文。
實施例本實驗所用的核酸模型系統是未切開的pUC21質粒DNA、RNA和基因組DNA。此夕卜， 通過使用被限制性酶切成片段的質粒DNA來表示不同大小的核酸片段的純化。步驟(實驗部分)在以下A)到I)的制備方法之后A)磁性聚合物與胺類反應
材料磁性聚合物=Sera-Mag倍速磁性改性羧酸鹽微粒(kra-Mag Double Speed Magnetic Carboxylate-Modified Microparticles, dsMGCM)目錄號 65152105050250，5% 強度水性懸液，或磁性改性羧酸鹽(MG-CM)，目錄編號對15-2105，5%強度水性懸液，SD公司(Seradyn Inc).印第安納波利斯，美國。胺類精胺(弗氏公司(Fluka)，85590)，亞精胺(弗氏公司，85561)，丙基_1，3丙二胺(阿爾德里奇公司(Aldrich)，目錄號308153)，五亞乙基六胺(阿爾德里奇公司，目錄號四2753)聚(烯丙胺鹽酸鹽)，分子量15 000(阿爾德里奇公司，目錄號觀3215)將500mg的磁性顆粒重懸于IOml 50mM、pH 6. 1的MES緩沖液中，然后與11. 5ml 50mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺溶液混合。使用微型振蕩器混合后，加入10ml、52 μ mol/1 的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)溶液，接著再次渦旋混合。接著將該溶液置于翻滾式振蕩器上反應30分鐘，然后移除上清。重懸于50ml 50mM、pH6. 1的MES緩沖液之后，將懸液分成每IOml的等份。磁性分離該懸液并棄去上清。在懸浮于Iml 50mM、 pH 6. 1的MES緩沖液后，每一例中加入2ml胺使得在50mM MES中濃度為100mg/ml、且pH 為8. 5，接著充分渦旋混合，超聲10分鐘，然后將該懸液置于翻滾式振蕩器上反應1個小時。 接著洗滌2次每一例使用IOml 50mM、pH 6. 1的MES緩沖液，磁性分離并棄去上清。然后將每例顆粒重懸于2ml pH值4. 5到7. 0的MES緩沖液中。B)使用N-丙基-1，3-丙二胺官能化的磁性聚合物(AX 027)純化pUC21質粒使用pH5. 0或是5. 5的50mM MES緩沖液中的^ig磁性顆粒，每一例與50 μ 1 50mM、 pH 5. 0或5. 5的MES緩沖液混合。接著加入10 μ 1的“ΕΒ”緩沖液(恰根公司(QIAGEN)， 目錄號19068)中的10ygpUC21質粒，并簡單震蕩混合。然后該反應混合物在翻滾式振蕩器或是埃氏振蕩器上孵育5分鐘。磁性分離該樣品混合物并移除上清，并用光度法測定其中DNA含量。然后每一例中的殘余用100 μ 1的Millipore水洗滌2次，磁性分離，并棄去上清。接著洗脫2次向每一例中加入50 μ 1 50mM, pH 8. 5，NaCl濃度為50mM、100mM、200mM 和400mM的Tris緩沖液，用磁性分離方法移除，并用光度法檢測洗脫液中DNA的含量。

圖1描述了 50mM濃度NaCl洗脫的結果，同時也對比了 AX 0 和AX 027的結果。C)使用亞精胺官能化的磁性聚合物(AX 026)純化pUC21質粒使用pH 6. 2的50mM MES緩沖液中的2mg磁性顆粒，并與50 μ 1 50mM、pH 6. 2的 MES緩沖液混合。接著加入10μ Γ Β”緩沖液(恰根公司，目錄號19068)中的10 μ g pUC21 質粒，并簡單震蕩混合。然后該反應混合物在翻滾式振蕩器或是埃氏振蕩器上孵育5分鐘。 磁性分離該樣品混合物并移除上清，用光度法測定其中DNA含量。然后每一例中的殘余用 100μ 1的Millipore水洗滌2次，磁性分離，并棄去上清。接著洗脫2次向每一例中加入 50 μ 1 50mM, pH 7. 5,8. 0 和 8. 5 的 Tris 緩沖液，每一例中 NaCl 濃度為 50mM、100mM、200mM 和400mM，用磁性分離方法移除，并用光度法檢測洗脫液中DNA的含量。圖2描述了該結果。D)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 025)純化pUC21質粒使用pH 6. 1的50mM MES緩沖液中的2mg磁性顆粒，并與50 μ 1 50mM、pH 7. 0的 MES緩沖液混合。接著加入10 μ 1的‘ Β”緩沖液(恰根公司，目錄號19068)中的IOyg PUC21質粒，并簡單震蕩混合。然后該反應混合物在翻滾式振蕩器或是埃氏振蕩器上孵育5分鐘。磁性分離該樣品混合物并移除上清，并用光度法測定其中DNA含量。然后每一例中的殘余用100 μ 1的Millipore水洗滌2次，磁性分離，并棄去上清。接著洗脫2次向每一例中加入50 μ 1 50mM,pH7. 5、8· 0和8. 5的Tris緩沖液，每一例中NaCl濃度為50mM、100mM、 200mM和400mM，用磁性分離方法移除，并用光度法檢測洗脫液中DNA的含量。圖3描述了該結果。E)使用五亞乙基六胺官能化的磁性聚合物(AX 028)純化pUC21質粒使用pH 6. 1的50mM MES緩沖液中的2mg磁性顆粒，并與50 μ 1 50mM、pH 7. 0的 MES緩沖液混合。接著加入10μ Γ Β”緩沖液(恰根公司，目錄號19068)中的10 μ g pUC21 質粒，并簡單震蕩混合。然后該反應混合物在翻滾式振蕩器或是埃氏振蕩器上孵育5分鐘。 磁性分離該樣品混合物并移除上清，并用光度法測定其中DNA含量。然后每一例中的殘余用100μ 1的Millipore水洗滌2次，磁性分離，并棄去上清。接著洗脫2次向每一例中加入 50 μ 1 50mM, pH 7. 5、8· 0 和 8. 5 的 Tris 緩沖液，每一例中 NaCl 濃度為 50mM、100mM、 200mM和400mM，用磁性分離方法移除，并用光度法檢測洗脫液中DNA的含量。圖4描述了該結果。F)使用聚烯丙胺官能化的磁性聚合物(AX 029)純化pUC21質粒-對比實施例使用pH 6. 1的50mM MES緩沖液中的2mg磁性顆粒，并與50 μ 1 50mM、pH 7. 0的 MES緩沖液混合。接著加入10μ Γ Β”緩沖液(恰根公司，目錄號19068)中的10 μ g pUC21 質粒，并簡單震蕩混合。然后該反應混合物在翻滾式振蕩器或是埃氏振蕩器上孵育5分鐘。 磁性分離該樣品混合物并移除上清，并用光度法測定其中DNA含量。然后每一例中的殘余用100μ 1的Millipore水洗滌2次，磁性分離，并棄去上清。接著洗脫2次向每一例中加入 50 μ 1 50mM, pH 7. 5、8· 0 和 8. 5 的 Tris 緩沖液，每一例中 NaCl 濃度為 50mM、100mM、 200mM和400mM，用磁性分離方法移除，并用光度法檢測洗脫液中DNA的含量。圖5描述了該結果。G)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 030)純化基因組DNA對于每次純化，將ang的顆粒懸于pH 6. 2的25mMMES、25mM Tris中。接著加入緩沖液“EB”配制的IOyg小牛胸腺基因組DNA(目錄號19068，弗氏公司，德國)，并簡單震蕩混合。接著磁性分離該樣品并作光度法檢測。殘余用100μ 1的Millipore水洗滌，磁性分離以移去上清，接著洗脫2次，每例使用50 μ 1分別含50mM和IOOmM NaCl的50mM、pH 8. 5 的Tris緩沖液。然后用光度法檢測每個洗脫液中DNA的含量。圖6和圖7描述了該結果。H)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 030)純化RNA.對于每次純化，將ang的顆粒懸于50mM、pH 5. 5的Tris中。接著將10 μ g/制備 (pr印)· RNA(核醣體的 16S-& 23S、Fermentas41-lg/l_ll)加入到 50mMpH 5. 5 的 Tris 緩沖液中。接著通過簡單震蕩的方法混合，磁性分離并接著用光度法檢測上清的RNA。接著每一例用100μ 1無RNA酶的水洗滌兩次，通過磁性分離去除上清。接著洗脫兩次，每例使用 50 μ 1分別含50mM和IOOmM NaCl的50mM、pH 8. 5的iTris (無RNA酶)。然后用光度法分別檢測洗脫液。圖8和圖9描述了該結果。I)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 030)純化核酸片段.
準備精胺官能化的磁性聚合物顆粒以50mg/ml的懸浮密度懸于含25mM MES、25mM Tris、pH 6. 2的結合緩沖液。然后用該緩沖液再洗滌所述珠粒2次，用磁性分離方法去除上清。需要的是PTZ19R型質粒DNA，將25 μ g的該DNA用于100 μ 1的緩沖溶液。首先，計算出所有用于反應混合物的量，接著引入缺失的水量以補齊100μ 1，加入DNA，然后加入酶溶液的匹配酶緩沖液(每10 μ 1總溶液加1 μ 1)，最后每yg DNA加入3U限制性內切酶 (HinfI，新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)，目錄號R0155S)(通常75U對應于 7.54 1酶溶液)。該混合物置于37°C水浴或加熱器孵育90分鐘。接著用Quick-Run簡單離心至6000U/min，然后樣品凍于_20°C。這種限制酶消化的DNA是試驗PB緩沖液的一種簡單和快速的PCR替代品。過程對于每一樣品，8μ1的PCR溶液(相當于2yg DNA)同92 μ 1 ρΗ 6· 2的25mM MES、25mM Tris混合，然后混入25 μ 1磁性硅膠懸液，然后渦旋震蕩10秒鐘，混入500 μ 1 ρΗ 6. 2的25mM MES、25mM Tris，并混合。混合物在振蕩器中孵育2分鐘。接著磁性分離，棄去上清，每例用750 μ 1 Millipore水洗滌2次。然后，先用50 μ 1，再用30 μ 1 ρΗ 8. 5、50mM Tris/HCl,50mM NaCl洗脫。合并洗脫液，用分光法，也可通過凝膠法檢測DNA含量。圖10、圖11、圖12描述了該結果。J)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 040)從血中純化基因組DNA.Iml 裂解緩沖液(IOmM Tris, Triton X_100，pH 9.0)和 10 μ 1 蛋白酶 K 混合。將 Img珠粒和3. 4 μ 1水懸于200 μ 1結合緩沖液(1. 5Μ乙酸鉀、ρΗ 4. 0)，懸液密度26. 6mg/ml。 將100 μ 1解凍的全血(檸檬酸鹽穩定的)和裂解緩沖液/蛋白酶混合物混于埃氏杯，充分混合。接著室溫孵育10分鐘。將珠粒小心重懸于結合緩沖液中。其中的240μ1加入裂解的血中，接著用移液管小心上下吹吸混勻。接著室溫孵育1分鐘。磁性分離珠粒。小心移去上清。為洗滌，加入Iml洗滌緩沖液(水)，然后小心地上下吹吸混勻。再一次磁性分離后，棄去上清。加入Iml裂解緩沖液和50 μ 1結合緩沖液，小心混合并室溫孵育1分鐘。然后通過以下再次磁性分離用Iml洗滌緩沖液洗滌并磁性分離。通過加入150 μ 1洗脫緩沖液(IOmM TRIS*HC1、ρΗ 8. 5)至珠粒洗脫純化的DNA。 通過上下吹吸數次重懸珠粒。磁性分離珠粒，移去上清，并用光度法定量DNA。圖13描述了該結果。將5 μ 1以上所獲的洗脫液用于RT-PCR。為此，使用了 TaqMan β -肌動蛋白對照試劑(應用生物系統公司(Applied Biosystems)，編號401846)和QuantiTect探針PCR 主混合物(恰根公司，編號1019337)，應用了 12.5μ 1主混合物、2. 5 μ 1 β -肌動蛋白探針 (FAM)、2. 5μ 1 β-肌動蛋白正向引物和2. 5μ 1 β-肌動蛋白反向引物。圖14描述了該結果。
權利要求
1.從含核酸樣品中純化核酸的方法，所述方法至少具有以下步驟a.將含有核酸的樣品與具有核酸結合基團的核酸結合相接觸，所述核酸結合基團具有 PKa值在9到12的至少一個可質子化基團；b.在比至少一個所述可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的pH值(結合pH)下使所述核酸結合所述核酸結合相；c.在高于所述結合pH值，但是比至少一個所述可質子化基團的pKa值低至少一個pH 單位的PH值下洗脫所述核酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸結合基團結合于支持物。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述支持物和/或核酸結合基團具有官能基團，所述官能基團在洗脫PH值下促進核酸釋放。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述官能基團是陽離子交換劑，特別是酸性基團，優選例如羧基。
5.如權利要求2至4中的任一項所述的方法，其特征在于，所述支持用核酸結合基團和稀釋基團的混合物包被。
6.如權利要求1至5中一個或多個所述的方法，其特征在于，在具有至少一個以下特征的條件下實施結合a.在3到8的pH下實施結合；和/或b.在4到7.5的pH下實施結合；和/或c.在4.5到7的pH下實施結合；和/或d.在5.5到7的pH下實施結合；和/或e.在6.5到7的pH下實施結合；和/或f.在小于1M、小于0.5M、小于0. 25M或小于0. IM的鹽濃度下實施結合。
7.如權利要求1到6中一個或多個所述的方法，其特征在于，在具有至少一個以下特征的條件下實施洗脫a.在7.5到10的pH下實施洗脫；和/或b.在8到9的pH下實施洗脫；和/或c.在8.2到8. 8的pH下實施洗脫；和/或d.在小于1M、小于0.5M、小于0. 25M、小于0. 1M、小于25mM、小于15mM或小于IOmM的鹽濃度下實施洗脫；和/或e.使用選自下組的溶液實施洗脫水、生物緩沖液和有機緩沖液。
8.如權利要求1到7中一個或多個所述的方法，其特征在于，在結合后、洗脫前實施洗滌步驟。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所用的洗滌溶液具有以下一個或多個特征a.使用水或低鹽濃度水性溶液實施洗滌步驟；和/或b.使用低鹽濃度水性溶液，所述鹽濃度低于400mM、低于200mM、低于100mM、低于50mM 和/低于25mM0
10.如權利要求1到9中一個或多個所述的方法，其特征在于，所述核酸結合相是固相的或可溶于于水性溶液。
11.如權利要求1到10中一個或多個所述的方法，其特征在于，所述可質子化基團具有以下一個或多個特征a.所述可質子化基團是或具有離子交換劑；和/或b.所述可質子化基團是氨基；和/或c.所述可質子化基團是PKa為10到12的氨基；和/或d.所述核酸結合基團中每個基團具有1到10個、優選2到8個、特別優選2到6個氨基；和/或e.所述核酸結合基團選自精胺和/或亞精胺；和/或f.所述可質子化基團為氨基且不與減少電子密度的基團結合。
12.具有核酸結合基團的核酸結合相在純化核酸中的應用，所述核酸結合基團具有至少一個可質子化基團，所述可質子化基團的pKa為9到12，且洗脫pH被調整到高于結合pH， 但是比至少一個可質子化基團地至少一個PH單位。
13.如權利要求12所述的應用，其特征在于，所述核酸結合相具有至少一個以下特征a)所述核酸結合相為固相或是可溶的；和/或b)所述核酸結合相具有結合于固體支持物的核酸結合基團；和/或c)所述核酸結合相還具有在洗脫pH值下促進核酸的釋放/洗脫的官能基團，優選陽離子交換劑，特別是羧基；和/或d)特征b)或c)的核酸結合相具有選自下組的支持物有機多聚物，例如聚苯乙烯及它們的衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及它們的衍生物、聚氨酯、尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和這些材料的共聚物，多糖和水凝膠，例如瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、交聯葡聚糖、 聚丙烯酰胺葡聚糖、殼聚糖，無機支持物，特別是硅膠、二氧化硅顆粒、玻璃或其他金屬和半金屬氧化物、氧化硼，具有金屬表面的支持物，例如金和磁性顆粒；和/或e)所述核酸結合相的核酸結合基團是胺類，特別是伯胺和仲胺；和/或f)特征e)的核酸結合基團是精胺和/或亞精胺。
14.用于純化核酸的試劑盒，特征在于其具有a.如權利要求12或13所限定的核酸結合相；b.pH值比核酸結合相的至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的結合緩沖液，和/或可調節樣品中的PH值至此類pH值的結合緩沖液；和c.pH值比核酸結合相的至少一個可質子化基團的PKa值低至少一個pH單位的洗脫緩沖液，和/或可調節樣品中的PH值至此類pH值的洗脫緩沖液。
15.如權利要求14所述的試劑盒，其特征為a.所述結合緩沖液至少具有以下特征之一i.PH為3到8 ；和/或ii.pH為4到7.5 ；禾口 /或iii pH為4. 5到7 ；禾口 /或iv.pH為5. 5到7 ；禾口 /或v.pH為6. 5到7 ；和/或vi鹽濃度小于1M、小于0. 5M、小于0. 25M或小于0. IM ；和/或b.所述洗脫緩沖液至少具有以下特征之一i. pH為7. 5到10 ；和/或ii.pH為8到9 ；禾口 /或 iii pH 為 8. 2 到 8. 8 ；和 / 或iv鹽濃度低于1M、低于0. 5M、低于0. 25M、低于0. 1M、低于25mM、低于15mM或低于 IOmM ；禾口 / 或v.其選自水、生物和有機緩沖液。
全文摘要
本發明涉及從含核酸的樣品中純化核酸的方法，所述方法至少包括以下步驟a.將含有核酸的樣品與包含可質子化基團的核酸結合相接觸，其中所述可質子化基團具有9到12的pKa值；b.在比至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的pH值(結合pH)下使核酸結合核酸結合相；c.在高于結合pH值，但比至少一個可質子化基團的pKa值低至少一個pH單位的pH值(洗脫pH)下洗脫核酸。還公開了可用于純化核酸的相應試劑盒和核酸結合相。
文檔編號C12N15/10GK102264901SQ200980152956
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者J·佩策耳, R·法比斯, S·簡里奇 申請人:恰根有限公司