專利名稱：從宿主細胞純化核酸的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及從細胞來源分離核酸的方法和組合物。更具體地，本發明涉及用有效的一步裂解組合物聯合核酸捕獲基質從粗制細胞裂解物直接分離低分子量核酸，例如，染色體外DNA的方法和組合物。
背景技術：
分離低分子量核酸，尤其從宿主細胞分離染色體外核酸的能力通常是分子生物學中許多方案所必要的，以及生物技術和臨床研究中許多下游用途的基本要求。例如，通常的克隆方案預期從靶細胞的轉化可得到質粒載體DNA。染色體外核酸的質量，例如，純度和完整性水平通常決定克隆方法的成功，并且通常是完整方法的關鍵參數。此外，DNA測序、限制性消化反應，和隨后的連接反應通常依賴于起始DNA材料的質量。同樣，已經需要并且持續需要從宿主細胞純化高質量低分子量核酸的可靠方法。
常規低分子量核酸純化方案通常以或多或少兩個階段進行在第一個階段，將含有靶核酸，即染色體外核酸的宿主細胞輕微裂解并將內含物溶解化；在第二個階段，通過幾種常用的化學或酶學方法之一將靶核酸與污染性蛋白質、RNA、高分子量核酸(即，染色體DNA)，和其他大分子分離。通常常規靶核酸純化方案已經證明是費力和耗時的，然而產生高質量產物，或者相對快和省力的，但是產生相對低質量產物。
更具體地，分離靶核酸更常用的省時方法之一包括堿性裂解技術。堿性裂解方法通常順序摻入NaOH/SDS裂解溶液與乙酸鉀溶液組合，和離心步驟以優先將靶核酸釋放和與其他污染性材料分離。用單獨的離心或過濾步驟產生澄清裂解物。需要乙醇沉淀澄清的裂解物以沉淀核酸。盡管堿性裂解方法相當快，其耗費約30到45分鐘，并且所得核酸的純度比較好，即可用于限制性消化和其他更基本的檢測型方法中，但是該方法不能提供高質量染色體外核酸。
在另一方法中，通過堿性裂解方法制備的澄清裂解物可以與離液序列高的物質，例如胍鹽、脲和碘化鈉組合，在DNA結合固相(例如，珠子或者其他結合基質)存在下純化靶核酸。核酸在一步反應中結合固相，洗滌以除去殘留的污染物并用低鹽緩沖液洗脫核酸。盡管聯合堿性裂解與離液劑結合/洗滌/洗脫步驟的方法可以提供更高質量核酸，但是它們仍然耗時，花費約25分鐘，并且需要更多手工操作。
同樣，本領域中持續需要簡單和時間有效的方法，和相應的溶液，用以從宿主細胞純化低分子量靶核酸，如染色體外DNA，還需要從宿主細胞純化質粒DNA的方法和溶液。在該背景下開發了本發明。
發明概述本發明提供了使用一種溶液和核酸捕獲基質從宿主細胞裂解并分離低分子量核酸的一步方法。在優選實施方案中，將裂解溶液預冷以增強核酸純度。在另一優選實施方案中，核酸捕捉基質含有具有至少1μm孔隙大小的捕獲基質材料。與現有技術方案相比，按照本文中描述的方法可以快速(約8到10分鐘)和容易(需要很少試劑)地以高產率和純度分離低分子量核酸。
優選地，按照本發明的方法和組合物分離的低分子量核酸具有約1.7到1.9的A260/280比率，和具有最小的蛋白質污染，如通過視覺，即光度檢測方法，即，標準凝膠電泳和類似方法所測量的。更優選地，使用本發明的方法和組合物分離的低分子量核酸可以通常經測序為至少600個堿基，即每種樣品具有600質量得分(q)≥20(CodonCode軟件，PHRED Interphace)(600 PHRED q＞20分)。
本發明的一個實施方案提供了用于從宿主細胞純化低分子量核酸的裂解組合物。該裂解組合物優選含有緩沖劑和去污劑。在尤其優選的實施方案中，該去污劑含有非離子去污劑或者兩性離子去污劑，例如，正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基(ammonio)-1-丙烷磺酸鹽。在額外的實施方案中，裂解組合物還含有鹽、聚乙二醇、溶菌酶和/或RNA酶。在進一步優選的實施方案中，裂解溶液在加入宿主細胞前預冷。
在本發明的另一實施方案中，提供了用于從宿主細胞純化低分子量核酸的試劑盒。優選地，該試劑盒包括核酸捕獲基質和含有緩沖劑、非離子或者兩性離子去污劑，和任選地鹽、聚乙二醇、溶菌酶和/或RNA酶的裂解組合物。在尤其優選的實施方案中，核酸捕獲基質含有摻入自旋柱的捕獲基質材料，該自旋柱的平均孔隙大小為至少約1μm，更優選地至少約3μm。
本發明的另一實施方案為從宿主細胞純化低分子量核酸的方法。該方法包括向宿主細胞加入裂解組合物的步驟，其中裂解組合物含有0.2％到6％兩性離子或者非離子去污劑并且優選在使用前預冷，將釋放的低分子量核酸與核酸捕捉基質組合，并將捕獲的低分子量核酸洗脫到捕獲管中。在備選實施方案中，室溫下將裂解組合物與宿主細胞孵育至少2分鐘，更優選地至少3分鐘，之后加入核酸捕獲基質。
此外，本發明的方法和組合物可以經修飾，如下文中更詳細描述，以優先分離溶解的蛋白質、RNA、BACs，和高分子量核酸。在這些其他實施方案中，用含有緩沖劑和兩性離子去污劑的裂解溶液與用以高產率和高質量地純化靶標大分子的適宜的成分聯合，所述成分為例如，RNA酶、溶菌酶，或者DNA酶。
閱讀下面的詳細描述和參考所附權利要求書后，表征本發明的這些特征和多種其他特征以及優點將顯而易見。
附圖簡述

圖1A和1B闡明在染色的0.5％瓊脂糖凝膠(1A)顯示和圖示(1B)分離的質粒DNA，其中在室溫下將細胞與裂解溶液孵育不同的時間量。該圖闡明了來自每種條件的濃度和A212吸收讀數。
圖2闡明在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯色的質粒DNA，其中用于裂解緩沖液的去污劑類型對所純化的質粒DNA的產率和質量具有顯著影響。在玻璃纖維(second1-12)板上分離DNA。
圖3闡明在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯色的質粒DNA，其中細胞與室溫裂解溶液、4℃裂解溶液，或者0℃裂解溶液孵育。
圖4闡明NA捕獲基質材料的類型和該基質的孔隙大小對所純化的質粒DNA的產率和質量具有影響。分離的質粒DNA在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯現。
圖5闡明用于從不同類型的宿主細胞分離不同質粒載體的本發明的方法和Lysis裂解溶液。質粒DNA在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯現。
圖6闡明通過本發明的方法和Lysis裂解溶液分離的質粒DNA為PCR提供了足夠模板DNA。PCR產物在染色的瓊脂糖凝膠上顯現。
圖7A和7B闡明通過分光光度分析，裂解方法提供了極好的濃度和產率，它們與QIAgen、Invitrogen、BioRad或者Promega試劑盒相當或者更好。圖7A顯示了與QIAgen制備的DNA相當的裂解方法DNA(在凝膠上標記為FastPlasmid DNA)。圖7B圖示比較了從本發明的裂解方法制備的DNA的濃度與通過QIAgen、Invitrogen、BioRad和Promega制備的DNA的濃度。
圖8闡明使用本發明的方法和Lysis裂解溶液分離的DNA的測序質量(通過測序追蹤)。
圖9闡明通過限制性核酸內切酶反應，與其他常用的DNA分離試劑盒相比使用本發明的方法和Lysis裂解溶液分離的DNA的質量。
圖10A和B闡明PEG、鹽和緩沖液的溶液可以驅使核酸結合二氧化硅顆粒。在A和B中，通過0.5％瓊脂糖凝膠顯現分離的質粒DNA。
圖11闡明Lysis溶液可以直接加到液體細菌培養基和使用本發明的方法和材料分離的高質量質粒DNA。在染色的瓊脂糖凝膠上顯現分離的DNA樣品。
發明詳述定義提供下面的定義用以方便理解本文中所用的某些術語并且這些定義不限制本公開的范圍。
“A260/280”指常用的核酸定量技術，其中測量受試樣品在約260nm和280nm處的吸收。260與280處吸收的比率用以指示核酸純度。蛋白質污染物傾向將該比率降低到約1.6，RNA污染物傾向將該比率升高到1.9-2.0以上。
“A212”指用于幫助含有核酸的樣品中蛋白質污染物的檢測的單一吸收讀數。例如，具有高A212讀數的樣品可能在該樣品中具有一定水平的蛋白質污染，其當與A260/280比率和凝膠瓊脂糖分析聯合時可以表明該樣品的質量。對本發明來說，認為讀數為10是高的。
“宿主細胞”指含有靶核酸分子，例如，異源核酸分子，如質粒或者其他低分子量核酸的細胞，在該情況中宿主細胞通常適于復制目標核酸分子。用于本發明的適宜的宿主細胞的實例包括細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞。這些細胞的特定實例包括，SF9昆蟲細胞(Summers和Smith，1987，Texas Agriculture Experiment StationBulletin，1555)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(Puck等人，1958，ProcNatl Acad Sci USA 601275-1281)、大腸桿菌(E.Coli)DH5α細胞，以及多種其他細菌細胞來源，例如，大腸桿菌株系DH10b細胞、XL1Blue細胞、XL2Blue細胞、Top10細胞、HB101細胞，和DH12S細胞。
本文中所用“核酸”或者“NA”指脫氧核糖核酸和核糖核酸。本文中所用“核酸序列”指一條鏈上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的順序或者序列。它們可以是天然的或人工序列，尤其基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、轉移RNA(t RNA)、核糖體RNA(rRNA)、雜種序列或者合成的或半合成序列，經修飾的寡核苷酸，或其他。這些核酸可以來源于人、動物、植物、細菌或真菌等等。它們可以通過本領域中公知的任何技術得到，尤其通過文庫篩選，通過化學合成或者通過包括文庫篩選得到的序列的化學或酶促修飾的混合方法得到。它們可以經化學修飾，例如，它們可以是假核酸(PNA)、通過多種化學鍵修飾的寡核苷酸(例如，硫代磷酸酯或者膦酸甲酯)，或者備選地，經功能化，例如用具有不同特征性質的一種或多種分子偶聯的寡核苷酸。
對于脫氧核糖核酸，它們可以是單鏈或雙鏈的，以及短寡核苷酸或者更長序列。具體地，核酸有利地由質粒、載體、附加體、表達盒等組成。這些脫氧核糖核酸可以攜帶目的治療基因、調節轉錄或復制的序列、經修飾的反義序列，或者用于結合其他細胞組分的區域，等等。
本文中所用“低分子量核酸”指核酸的異源染色體外片段，例如，質粒，所述片段的堿基長度為約2kb到20kb，在某些方面為2kb到8kb。在優選實施方案中，本發明的低分子量核酸含有質粒，其中該質粒具有復制原點或者復制子、選擇標記和克隆位點。在某些情況中，低分子量核酸超螺旋化。用于本發明的實例質粒包括pUC19、pUC18、pBS2、pEGFP、pBR322，等等。此外，考慮低分子量核酸包括核酸的其他形式，例如，RNA。
本文中所用“高質量核酸”通常指與足夠低水平的污染物結合的核酸，從而其可以通過適宜的限制性內切核酸酶消化并可以直接用于常規轉化和轉染方法，即，不需要該核酸的實質性處理。優選地，這種高質量核酸的A260/280比為約1.6到2.0，更優選地約1.7到1.9。備選地和/或額外地，使用標準測序方法，可以對這種高質量核酸測序長達至少400個堿基，更優選地長達600個堿基，通常具有PHRED得分q≥20。
對本發明來說，“分離的”和“純化的”可以互換，并且指與細胞碎片，例如，高分子量DNA、RNA和蛋白質分離的多核苷酸，例如，低分子量核酸。這將包括與細胞碎片，包括DNA分離的分離的RNA樣品。
“核酸捕獲基質”指用于捕獲本發明的低分子量核酸的介質或者材料，包括通常由二氧化硅、尼龍、羧基等等以及基于二氧化硅的珠子，包括二氧化硅包被的磁珠組成的捕獲基質材料。通常，本發明的捕獲基質材料含有孔隙大小大于1μm，更通常大于或等于3μm的纖維濾器。本發明的核酸捕獲基質或者“NA捕獲基質”可以還含有用于捕獲低分子量核酸的一個或多個不同的捕獲基質材料層。應該注意當使用多層基質材料時，在材料的每層內或者之間材料不必相同。在尤其優選的實施方案中，NA捕獲基質由玻璃料(frit)支持并且摻入常規自旋柱或者類似裝置中。
“PHRED”或者“PHRED得分”指用于測量DNA序列質量的軟件程序。該軟件從CodonCode Corporation公司購買，版本0.020425.c。對本發明來說，600的PHRED q20得分相當于約730個堿基處于＞98.5％準確度。
用于本發明的“聚乙二醇”或者“PEGs”為通過商業途徑可獲得的二元醇，其分子量為2,000到10,000道爾頓，更優選地約8,000道爾頓。具有其他分子量約束，例如高于10,000道爾頓的PEG也預期用于本發明的組合物和方法中，盡管可能在提供高產率/質量產物方面不那么有效。
本文中所用“去污劑”指具有插入生物膜和穩定它們的性質的任何兩親性分子。該性質來自于去污劑分子能夠通過插入磷脂雙層和通過溶解脂質和蛋白質使膜破裂(La Cellule，Ed.Vigot和Dearie，1988，581-583頁)。
“兩性離子”去污劑指顯示出兩性離子特征的去污劑，包括，例如以商標名Zwittergen tTM和Anzergen tTM出售的磺基三甲銨乙內酯。尤其適宜的去污劑如下N-十二基-N，N-二甲基銨基-3-丙烷磺酸鹽或者相應的N-十四基或者N-十六基化合物(“Zwittergent”型Zwittergent 3-14，3-16)、N-十二基-N，N-二甲基-甘氨酸(Empigen BB.RTM.)、氨基氧化物、CHAPS、CHAPSO和α-卵磷脂(α-磷脂酰膽堿)或者α-溶血卵磷脂(α-溶血磷脂酰膽堿)。
本發明提供了用于裂解和溶解宿主細胞的方法和組合物。具體地，本發明提供了簡單的3到5分鐘方法，其利用單一溶液裂解和釋放細胞的內容物和同時溶解大部分該細胞的蛋白質。本發明的實施方案包括用于從宿主細胞優先分離低分子量核酸，例如，染色體外DNA、RNA或者其他區域DNA，以及優先將蛋白質與宿主細胞的核酸分離的方法和溶液。
在一個優選實施方案中，提供了用于從靶標宿主細胞純化低分子量核酸，例如，質粒DNA的方法和組合物。具體地，從宿主細菌細胞以高產率和高質量純化可用于克隆方法、限制性消化反應，和測序反應中的質粒DNA。本發明的方法利用一種溶液裂解細菌細胞和結合核酸。低分子量核酸從宿主細胞釋放并直接從粗制裂解物被捕獲到核酸捕獲基質上。將該基質用適宜的洗滌緩沖液洗滌并在最終用途條件下洗脫。整個過程可以在10分鐘以內實施并且在優選實施方案中可以在約8分鐘或更短時間內實施。
裂解溶液本發明基于含有緩沖成分和去污劑的裂解溶液。在優選實施方案中，去污劑為兩性離子去污劑，尤其選自包括但不限于，正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、等等的去污劑。注意兩性離子去污劑，特別與上面列舉的兩性離子去污劑具有類似性質的那些兩性離子去污劑在本發明的范圍內。該溶液的實施方案能夠裂解靶標宿主細胞并溶解大部分細胞蛋白。在更優選的實施方案中，本發明的裂解溶液可與其他核酸分離方法，例如，高濃度離液劑鹽聯合以驅使核酸結合到固態支持體基質。該溶液的優選的緩沖劑/去污劑實施方案包括溶菌酶和DNA酶或RNA酶。
在另外的實施方案中，還預期上述裂解溶液可以還含有螯合劑、鹽、聚乙二醇、溶菌酶和RNA酶或DNA酶。如本領域中技術人員將理解的，用于除去DNA純化步驟中RNA的RNA酶，或者用于除去RNA純化步驟中DNA的DNA酶在使用本發明的方法純化靶核酸的技術上不需要，但是通過包括這些成分顯著提高了核酸產率和純度。此外，包括溶菌酶對所得產率具有顯著影響，并且尤其優選作為本發明裂解溶液的額外的成分。考慮包括這些組分用于根據本發明的核酸分離方法中。
在優選實施方案中，裂解溶液的緩沖組分為pH約8的Tris-Cl，盡管考慮其他緩沖化合物。通常，裂解溶液中Tris-Cl的終濃度為約0到約200mM，優選約15到75mM。注意到可以調整本發明的緩沖組分從而很少需要或者不需要改變最終溶液的pH。例如，緩沖組分可以是Tris-氨基和Tris-氨基鹽酸鹽的組合以提供pH約7.9到8.4的最終裂解溶液。一種闡明性組合是最終裂解溶液中包括約17mM Tris氨基與28mM Tris-氨基鹽酸鹽。可以用其他緩沖組合得到適宜的裂解溶液pH，其如上面提到的最適為7.9到8.4。
用于裂解溶液的優選的鹽為用于核酸沉淀中的任何常用鹽，例如，NaCl、NH4Cl、NH4SO4、MgCl2、等等。在優選實施方案中，鹽為NaCl，部分是由于其可利用性和相對低成本。裂解溶液中鹽的終濃度優選為200到800mM，更優選約400mM。
用于裂解溶液的優選螯合劑為EDTA，但是預期也可以使用EGTA。本發明的實施方案中可以使用的EDTA的終濃度為0到20mM，優選約9mM。
用于本發明的聚乙二醇(PEG)的優選分子量為約2,000到10,000道爾頓，更優選約8,000道爾頓。通常，裂解溶液中的最終PEG濃度為2到20％，優選2到8％。注意到使用本領域中公知的技術，例如，通過將加熱到適宜的溫度并過濾以除去微粒制備PEG。令人驚奇地，具有較高分子量的PEG對本發明的純化的低分子量核酸的質量具有有害影響。
通常，裂解溶液的實施方案包括溶菌酶，例如，蛋清溶菌酶或者重組溶菌酶，終濃度為約300到2,000μg/ml，優選800到1,200μg/ml。此外，RNA酶(或者當純化靶標為RNA時，DNA酶)，例如，RNA酶A、RNA酶1、RNA酶T1優選以約200到400μg/ml的濃度包括在裂解溶液中。在兩種情況中，溶菌酶或者RNA酶以凍干粉末或者以溶液保存。例如，RNA酶通常保存在100mMNaCl、10mM Tris、和1mM EDTA溶液中。注意到溶菌酶和RNA酶分別是最優化產率，即，完全釋放核酸和除去RNA污染物所需的，并且可以以高于上面所公開的濃度包含，但是該更高濃度對于增強產率和質量有限。溶菌酶、RNA酶和DNA酶可以通過商業途徑得到。
裂解溶液還包括終濃度為約0.2％到6％，優選約2到4％的去污劑。注意到本發明的溶液中可以使用較低量的去污劑，尤其當被裂解和溶解的細胞的濃度很低時。此外，盡管考慮本發明中使用較高水平的去污劑，但是它們可能不增加額外的功能價值從而不優選。
通常，去污劑為離子去污劑、非離子去污劑，或者兩性離子去污劑。用于本發明的典型的離子去污劑包括，但不限于脫氧膽酸。用于本發明的典型的非離子去污劑包括，但不限于，Triton X-100、Apo10、Apo12和NP40。典型的兩性離子去污劑包括，但不限于，CHAPS和磺基三甲銨乙內酯，磺基三甲銨乙內酯去污劑分別以例如商標名ZwittergentTM和AnzergentTM出售。還注意到在某些情況中，還可以使用，但不優選非去污劑兩性離子材料。
在本發明的優選實施方案中，去污劑為兩性離子去污劑，例如，以商標名ZwittergentTM和AnzergentTM出售的兩性離子去污劑，所述去污劑具有化學名正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽。用于本發明的一種優選的去污劑為正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。注意到本發明的去污劑可以以如下商標名購買，例如Anzergent 3-14，分析級；Anzergent3-8，分析級；Anzergent 3-10，分析級；Anzergent 3-12，分析級，或者zwittergent 3-8、zwittergent 3-10、zwittergent 3-12和zwittergent 3-14、CHAPS、CHAPSO、Apo10和Apo12。
注意到還考慮用于本發明的兼容去污劑可以混合在一起以提供用于裂解溶液中的必要的去污劑組合物(終濃度)。例如，在裂解溶液中終濃度為2％的去污劑可以由50∶50正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽∶正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽組成。
此外，預見裂解溶液的實施方案中可以包括其他成分，例如，濃度為50mM到6M，優選200mM到400mM的離液劑鹽可以包括在溶液中以幫助蛋白質變性。此外，該溶液中可以包括0.5％到25％的醇，像異丙醇，以幫助低分子量核酸的沉淀。
在裂解溶液的制備期間，應該在溶液的其他組分已經使pH為7.9到8.4，優選約8.1的pH后加入溶菌酶、RNA酶(或者DNA酶)，和去污劑。當需要調節pH時，可以使用本領域中任何種類的熟知酸或者堿，例如，HCl或者NaOH。
還注意到如上討論的，通過用緩沖溶液的適宜量和組成制備溶液，裂解溶液的pH應該相當接近可接受的范圍。
裂解溶液優選保存在4℃，盡管還預見可以在室溫保存。通常，溶液可以保存長達3個月。然而，還預見不存在RNA酶、DNA酶，和溶菌酶時該裂解溶液可以保存長達1到2年。當需要更長保存時間時，可以在使用時有利地加入從濃縮液或者如上述從凍干粉末制備的溶菌酶、RNA酶和DNA酶。
在尤其優選的實施方案中，加入靶標宿主細胞的裂解溶液的溫度為約0到10℃，更優選1℃到8℃，最優選0℃到4℃，通常約2℃到6℃。本文中所用術語“預冷的”指本發明的裂解組合物在前面的溫度范圍內。同樣的，當預計裂解步驟時，裂解溶液在用于宿主細胞前應該置于冰上足夠的時間以實現必要的溫度。
表1提供了用于本發明方法的闡明性裂解溶液。
表1闡明性裂解溶液
裂解和溶解方法使用上述裂解溶液的方案，用本發明的方法裂解和溶解靶標宿主細胞。為了裂解和溶解靶細胞，裂解溶液含有緩沖劑和去污劑，優選兩性離子去污劑。在尤其優選的實施方案中，裂解溶液還含有溶菌酶。根據所裂解和溶解的材料的預期用途，該裂解溶液可以還包括如上述的其他任選成分。例如，當預期分離RNA時，包括DNA酶是有利的，或者當預期分離DNA質粒載體時，裂解溶液可以包括RNA酶。
在優選實施方案中，該方法包括將細胞用預冷的裂解溶液渦旋或者混合10到30秒，然后是1到10分鐘，更優選3到5分鐘室溫孵育。本發明的該優選方法提供了堿性裂解方法的相容方法，花費少一半的時間，并且通常提供更高質量的產物，即，澄清的裂解物。
裂解方法和核酸純化本發明的方法還包括對含有靶標低分子量核酸分子的宿主細胞實施一種溶液純化方法。該方法導致直接從裂解的細胞，即，直接從粗制細胞裂解物分離低分子量核酸，例如，質粒DNA。通常，使用本發明的方法和組合物，從宿主細胞釋放低分子量核酸，并通過本發明的組合物實施方案溶解宿主細胞蛋白質的相當大部分。所釋放的低分子量核酸被核酸捕獲基質從粗制細胞裂解物捕獲，并用基于醇的緩沖液洗滌該基質。用適宜的緩沖液從捕獲基質洗脫所得捕獲的低分子量核酸，其通常為高產率和極好的質量。同樣的，按照本發明的方法，用單一緩沖液裂解宿主細胞和在固態支持體，即核酸捕獲基質上結合/捕獲靶標低分子量核酸。該完整過程(如下文更完整描述)可以在約8到10分鐘內進行，并且需要僅一種標準實驗室設備。
更詳細地，用靶標低分子量核酸轉化細菌或者其他適宜的宿主細胞，如本領域中熟知的。宿主細胞生長到目標濃度(通常5×108到20×108個細胞/ml或者A600為1到4OD單位)，收獲，旋轉沉淀。從細胞沉淀傾出任何LB生長培養基或者細胞上的任何其他溶液)，將本發明的預冷裂解溶液(0℃到4℃)加入細胞沉淀中。通常，每1.5ml培養材料加入約400μl裂解溶液，盡管可以對其進行調整以對細胞濃度和裂解溶液組合物進行優化，例如，當處理更少數目的細胞時，裂解溶液中可以包括更低濃度的去污劑。注意在本發明的備選實施方案中，將裂解溶液直接加到細胞培養物中，即，在細胞被旋轉沉淀和生長培養基從細胞沉淀倒出之前。通常，組合約2∶1到約1∶3比例的細胞裂解溶液，該比例取決于細胞濃度、裂解溶液的實施方案和其他類似參數。盡管向細胞直接加入裂解溶液取消了除去生長培養基所需的離心步驟，但是其可以稍微增加裂解純化方法期間所分離核酸的蛋白質污染，這是由于起始材料中存在更高水平的潛在污染性材料。然而，當這些污染物意義較小或者時間很重要時，本發明使得可以進一步減少必要處理步驟。
裂解溶液的組成在下文中更詳細討論，該裂解溶液在宿主細胞上持續渦旋或者混合約10到30秒，更優選約20秒。重懸浮的細胞混合物接著在室溫孵育1到10分鐘，更優選地3到5分鐘，最優選地約5分鐘。室溫孵育導致從宿主細胞大量釋放低分子量核酸和溶解大部分宿主細胞蛋白質。注意更短的裂解溶液室溫孵育可以與本發明一起使用，盡管低分子量核酸的產率相應較低。此外，可以使用更長的室溫裂解孵育，但是5到10分鐘的孵育后通常觀察到低分子量核酸產率或者質量的很小提高。
宿主細胞上包括預冷的裂解緩沖液，和隨后室溫孵育提供了溫度梯度，在該溫度梯度期間宿主細胞蛋白質被裂解緩沖液溶解。不被理論所束縛，認為本發明的該方面利用了一系列溫度(從0℃-4℃到室溫)和某種程度上pH改變(由于緩沖液的溫度改變)時不同的細胞蛋白質溶解度。然而，預見可以關于本發明的方法調整裂解緩沖液溫度和宿主細胞孵育溫度，對低分子量核酸的總的產率和純度產生一定影響。
室溫孵育后，將所釋放的低分子量核酸和溶解的細胞碎片轉移到自旋柱，其具有至少一層核酸(NA)捕獲基質(優選的實施方案可以具有摻入到該自旋柱的第二和/或第三層NA捕獲基質)。上面的混合物通過該自旋裝置以約14,000RPM(20,000×G)旋轉約30秒，使用小型或微型離心機(本領域中技術人員將認識到在本發明的背景中可以使用其他速度和時間，只要流體穿過自旋柱，如本領域中熟知的)。注意在該方面也可以使用其他方法，例如，真空過濾等等材料通過核酸捕獲基質的方法。
在備選實施方案中，NA捕獲基質材料直接包括在裂解緩沖液中并在室溫裂解緩沖液/宿主細胞孵育期間直接加到宿主細胞。在這些情況中，裂解緩沖液/核酸捕獲基質在加到宿主細胞沉淀之前必須完全混合從而基質完全重懸浮。
NA捕獲基質結合到從細胞碎片，即粗制裂解物釋放的低分子量核酸的部分。令人驚奇地，孔隙大小大于1-2μm的核酸捕獲基質優選用于本發明，并且優選地，在低分子量核酸的捕獲期間使用多層核酸捕獲基質，每一層具有至少1-2μm的孔隙大小。注意還預期孔隙大小小于1-2μm的基質材料也用于本發明，但是表現出傾向于阻塞并且需要較大孔隙材料不必要的額外的處理。此外，優選用于此處的較大的孔隙材料傾向于提供更好的捕獲特征，而較小的孔隙材料不能提供所述捕獲特征。為了最大化捕獲的低分子量核酸的純度，對裝載的核酸捕獲基質實施一次或多次洗滌步驟。洗滌緩沖液通常為20mMTris-Cl，pH7.2，0.2M NaCl，和2mM EDTA，pH 8.0)/異丙醇溶液。通常，Tris緩沖液異丙醇的比例為約30-35∶70-65，優選約32.5∶67.5(注意可以用其他類似醇，例如乙醇代替異丙醇)。注意到本發明可以使用其他洗滌緩沖液組合物，只要它們比低分子量核酸優先從捕獲基質解離污染物。該洗滌步驟除去來自裝載的核酸捕獲基質的松散結合的蛋白質和其他大分子。
最后，用10mM Tris，0.1mM EDTA溶液(pH約8.5)從NA捕獲基質洗脫低分子量核酸。通常的洗脫參數包括使用更小的體積保持靶標低分子量核酸的較高濃度，和最小化洗脫緩沖液中EDTA或者其他酶抑制性組分的量。
如關于上面的洗脫緩沖液闡明的，可以在與最終用途應用相容的溶液中，例如，使用對聚合酶具有很小的抑制活性的洗脫緩沖液實施低分子量核酸的洗脫。同樣地，可以對洗脫的樣品直接實施最終用途應用而不必沉淀和在適宜的緩沖液中重懸浮該核酸。用于本發明的其他洗脫緩沖液包括水、TE緩沖液、10-50mM Tris緩沖液，等等。
核酸捕獲基質許多不同的核酸捕獲基質組合物可以與本發明的方法和組合物聯用以捕獲低分子量核酸。用于本發明的捕獲基質組合物包括基于二氧化硅、尼龍和丙烯酸的材料。濾器捕獲基質材料的通常的孔隙大小為1到25μm，優選1到5μm，最優選3到5μm。注意具有更大孔隙的基質材料可以與本發明連用，但是在捕獲低分子量核酸中較不有效。此外，更小孔隙捕獲基質材料，例如，小于1μm，也可以與本發明連用，但是傾向于在捕獲過程期間堵塞(注意到具有1到2μm孔隙大小的基質材料也可以表現出一定水平的堵塞，這取決于基質層數和樣品大小)。
在優選實施方案中，捕獲基質材料的第一層摻入到如本領域中熟知的旋轉裝置中。捕獲基質材料將在組成和孔隙大小上與前述參數相容，但是優選為孔隙大小為3到5μm的玻璃纖維。在某些實施方案中，旋轉裝置包括兩層捕獲基質材料，例如，第一(上)層材料的孔隙大小約5μm，第二層(下一層)捕獲基質具有的孔隙大小約為3μm。額外的捕獲基質材料為捕獲靶標低分子量核酸提供了額外的表面區域/支持體。通常，這兩層是不同的材料，盡管考慮這兩層可以是相同材料。此外，層之間的孔隙大小通常是不同的，較大的孔隙大小材料在較小的孔隙大小材料之上。最后，可以加入額外的捕獲基質材料，盡管濾器材料的堵塞可能變得更嚴重。
注意NA捕獲基質中可以包括玻璃料，其在一層或多層捕獲基質材料層之下用于支持。通常的玻璃料由惰性材料，例如聚乙烯組成，具有5到70μm的孔隙大小。
在備選實施方案中，一部分，例如350μl NA捕獲基質漿液，例如，溶液中的二氧化硅顆粒直接沉積到裂解溶液/宿主細胞材料中并孵育短的時間段(通常使用渦旋或者其他混合技術)。如上旋轉沉淀捕獲基質漿液/裂解溶液混合物，并用適宜的洗滌緩沖液洗滌沉淀的基質。
如上文，用適宜的洗脫緩沖液釋放捕獲的低分子量核酸。此外，二氧化硅包被的磁珠可以用作NA捕獲基質。這些珠子的使用和制備在美國專利號6,368,800中描述，將該專利并入作為參考。使用二氧化硅包被的磁珠避免了在靶標核酸的純化期間需要離心步驟。
表2提供了代表性NA捕獲基質材料與相應孔隙大小以及幾種通過商業途徑可獲得的旋轉裝置。
表2NA捕獲基質材料
裂解方法的自動化本發明的方法和組合物可用于在高通量應用中從靶標宿主細胞分離高產率和高質量的低分子量核酸。
使用標準實驗室設備和人員可以一次對一個樣品實施本發明的方法。然而，由于實施本發明的方法所需的有限數目的步驟和/組合物，和由于這些步驟復雜性的有限水平，預期這些方法可以用于高度自動化步驟以從許多分散處理的樣品分離靶核酸樣品。
具體地，本發明的組合物和方法可用于多孔，例如，96或384孔方案中。細胞生長于具體步驟所需的適宜數目的孔中。適宜的細胞生長后，用多孔板離心沉淀細胞。將多孔板中的每個細胞樣品重懸浮在約400μl預冷的裂解溶液中。搖動平板，或者用多通道移液管或者96針頭吹打每孔組分，以便完全重懸細胞。樣品在室溫下孵育約3到5分鐘。使用多通道移液管或者96孔針頭，將來自每管的裂解物轉移到相應多孔濾器板中。濾液真空通過濾器基質(如上討論的相同類型的捕獲基質形式)以在捕獲基質上捕獲低分子量核酸。再次使用多通道移液管或者96孔針頭，向濾器板的每孔加入約400μl洗滌緩沖液。洗滌緩沖液穿過捕獲基質以除去殘留的蛋白質和核酸，并抽真空直到多數殘留的醇從捕獲的低分子量核酸除去。制備適宜的板以接收洗脫的低分子量核酸，并對每種樣品實施洗脫。也可以用離心實施該強行使液體穿過濾器板的方法。注意到在自動化方法期間應該避免離心，其中該方法在自動化工作站上進行。
最后，注意用二氧化硅包被的磁珠可以實施本發明的自動化方法。純化步驟應該基本上和上面的相同，只是應該利用珠子的磁性性質將NA捕獲基質與裂解物分離并且應該不需要離心步驟。
使用預先校準的設備，可以將該方法自動化成高通量方法。預見用于高通量操作的其他方法并且這些方法不限于96孔或者384孔板。同樣的，本發明的方法對于許多離散的高質量低分子量核酸樣品的自動化制備是理想的。
低分子量核酸純化試劑盒本發明的實施方案提供了用于實施上述核酸純化/分離方法的試劑盒。在本發明的一個實施方案中，該試劑盒包括裂解溶液和NA捕獲基質材料(作為旋轉柱或者基質漿液)。在優選實施方案中，該試劑盒還包括洗脫溶液和洗滌緩沖液。本發明的試劑盒還可以包括分子生物學級水、收集管、384孔板(任選裝入NA捕獲基質)、96孔板(任選裝入NA捕獲基質)、移液器頭、微型離心機、保護性手套，等等。
為了最大穩定性，該試劑盒可以含有凍干的溶菌酶、RNA酶和/或DNA酶，它們可以在試劑盒第一次使用時加入裂解溶液中。在某些實施方案中，可以單獨提供去污劑以僅在使用前加入到其他成分中。
最后，在某些試劑盒中，考慮還可以包括用于細胞培養的許多管，例如，Lid-Bac管(美國專利號5,958,778和6,503,455，并入本文作為參考)。這些管應該允許在單個管中培養靶細胞和處理、裂解和溶解那些相同的細胞(使用本發明的裂解溶液和方法)。然后通過加入核酸捕獲基質漿液在該相同管或者在另一管，例如，其中直接裝入一層核酸捕獲基質的旋轉裝置中分離靶核酸。
結合溶液在根據本發明的備選實施方案中，用包含緩沖劑、PEG和鹽的溶液優先將來自澄清的裂解物的核酸結合到二氧化硅纖維。優選的結合溶液包括分子量為2,000到10,000道爾頓的1到20％PEG；約100到2000mM鹽，例如，NaCl；約10到200mM緩沖液，例如，Tris。與該結合緩沖液使用的NA捕獲基質包括二氧化硅珠和纖維。優選的二氧化硅纖維具有1到20μm，更優選約3到5μm的孔隙。
已經一般性描述了本發明，通過參考下面的實施例將更容易理解本發明，這些實施例僅為了闡明而提供，并且不打算作為限制。
實施例實施例1制備裂解溶液表3提供了本發明的一種潛在的裂解溶液的組合物。每種組分的濃度是按照每升溶液組分的重量來計。
表3.裂解溶液
實施例2室溫孵育增加了高質量質粒DNA的回收下面的實施例闡明裂解緩沖液與含有質粒的細菌細胞3到10分鐘室溫孵育，優選5分鐘室溫孵育對于高質量質粒DNA的高產率回收是有益的。
如本領域中熟知的，將細菌宿主細胞用pUC19質粒轉化在96孔板中過夜生長。將平板在室溫解凍15分鐘，并向板的每孔加入前面描述的裂解緩沖液約400μl。注意裂解緩沖液在加到細菌培養物之前預冷到0℃。
培養物經立即旋轉沉淀，或者在平板振蕩器上重懸浮，并在室溫孵育不同的時間量。除去具有0到10分鐘室溫孵育的每種裂解物并將其轉移到基于二氧化硅的NA捕獲基質并以14000轉/分鐘旋轉沉淀1分鐘。從每孔除去所得濾液，并用洗滌緩沖液(20mM Tris-Cl pH 7.2，0.2M NaCl，2mM EDTA pH 8，75％異丙醇)洗滌NA捕獲基質。以14000轉/分鐘旋轉洗滌緩沖液1分鐘。用50μl洗脫緩沖液(10mM Tris-Cl和0.1mM EDTA)從NA捕獲基質洗脫捕獲的pUC19，并檢查每種洗脫樣品的pUC19產率和蛋白質污染。
參考圖1A，在0.5％瓊脂糖凝膠上運行來自每種孵育條件的分離的質粒DNA。溴化乙錠染色的凝膠表明所有孵育條件提供了質粒DNA的良好產率，包括立即旋轉條件。圖1B和表4提供了關于孵育時間的每種樣品濃度和A212值的圖示和列表闡明。注意隨著室溫孵育期的進行，樣品中蛋白質污染降低直到約3分鐘，此時樣品中蛋白質和核酸濃度穩定。一并考慮，圖1A和1B闡明裂解緩沖液對靶細胞的室溫孵育減少了分離的pUC19的蛋白質污染而沒有不利地影響質粒的產率。該實施例表明裂解溶液對宿主細胞的3到10分鐘，優選5分鐘室溫孵育可用于最大化所得低分子量核酸的產率和純度。此外，使用本發明的溶液和方法，更短的孵育，0到2分鐘，似乎不能完全允許污染物與靶核酸分離。注意短孵育時間的DNA的高濃度(如通過吸收讀數確定)由于污染而增加并不代表實際濃度。對于大于或者等于3分鐘的孵育時間所示的濃度代表所分離DNA的真實濃度。
表4使用不同室溫孵育的質粒產率和蛋白質污類
實施例3去污劑類型和濃度對于裂解緩沖液有效性是關鍵的用于用核酸轉化細菌宿主細胞的方法和溶液與生長轉化的細胞用于分離所述核酸是本領域中熟知的。此外，用于從細菌宿主細胞純化質粒DNA的發明性方法與上面實施例2中所示基本上相同，只是改變裂解緩沖液中去污劑類型以確定哪種類型的去污劑在該背景中最有用。
關于用于該實施例中的裂解緩沖液條件，所制備的標準裂解緩沖液具有50mM Tris-Cl(pH-8)；10mM EDTA(pH-8)；350μg/ml RNA酶；1200μg/ml溶菌酶；7.5％PEG-8000；1％去污劑(根據樣品改變類型)；50μl/ml玻璃基質珠；和0.75M NaCl。
使用上面的該基本組合物制備了一系列12種不同的裂解緩沖液，每一種具有加到1％的終濃度的不同類型的去污劑。具體地，去污劑為(1)N，N′，N′-聚氧乙烯(10)-N-牛脂-1，3-二氨基丙烷(N，N，N-PTD)，(2)NDSB-195，(3)NDSB-201，(4)NDSB-256，(5)Apo-10，(6)Apo-12，(7)CHAPS，(8)正-辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷，(9)De-Oxcholic Acid，(10)SDS，(11)Triton X-100與SDS混合(50∶50)，和(12)Triton X-100。注意在缺少RNA酶、溶菌酶和去污劑時可以使裂解緩沖液達到pH 8.5。如圖2中所示，用于裂解緩沖液中的去污劑類型對純化的質粒DNA的產率和質量都具有顯著影響。例如，包括N，N，N-PTD去污劑導致高產率/高質量一步質粒制備，而在完全相同的條件下，包括De-oxcholic Acid提供了質粒DNA的足夠產率，但是降低了所純化的質粒DNA的質量。同樣的，去污劑類型對所得產率和質量具有深遠影響。
用兩性離子去污劑實施一系列實驗以確定它們用于裂解緩沖液中的有效性。通常，兩性離子(zw)去污劑以1到4％的濃度使用以確定所有或者特定類型的兩性離子去污劑在本發明的方法中有效。有趣地，兩性離子去污劑正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-8)、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-10)、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-12)、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-14)都顯示出足夠(zw-8)或者良好的結果(zw-10、zw-12和zw-14)(數據未顯示)。
為了進一步限定兩性離子去污劑在裂解溶液中的有效性，將去污劑單獨或者混合以約1％到4％的終濃度摻入相同的裂解溶液(zw-10、zw-12和zw-14)中。表5闡明這些結果的概述，表明1到4％的兩性離子去污劑對于宿主細胞高產率和純度地分離低分子量核酸是極佳的。包括使用NP40或者Qiagen試劑盒純化的DNA的數據用于比較。
表5兩性離子去污劑濃度和類型影響靶核酸的產率和純度
該數據闡明了在本發明的裂解溶液和方法的背景中使用兩性離子去污劑的有效性。
實施例4預冷的裂解溶液增強所純化核酸的質量本發明的裂解方法和溶液用于評估向pUC19轉化的DH5α細胞加入不同溫度的裂解溶液的效果。如上確定分離的pUC19的質量。
用于用pUC19轉化細胞，和生長轉化細胞以分離pUC19的方法和溶液是本領域中熟知的。制備如上面實施例中描述的裂解溶液，其含有由3％zw 3-10、3％zw 3-12、或3％zw 3-14組成的去污劑。每種去污劑條件的裂解溶液在加入細胞前在室溫放置、冷卻到4℃或者冷卻到約0℃。表6和圖3中的結果表明用冷卻的裂解溶液(4℃和0℃)分離的DNA比用室溫裂解溶液分離的DNA具有更高質量的分離DNA。圖3中的泳道3-18表明在每種溫度下來自每種去污劑類型的產率大約相同(每泳道運行2μl每種樣品)，相反地，來自相同樣品的吸收讀數表明不管去污劑類型，使用室溫裂解溶液分離的pUC19具有更高水平的蛋白質污染(見表6)。
表6裂解溶液的溫度影響NA質量
該數據一般地闡明與在室溫加入細胞的裂解溶液相比，預冷的相同裂解溶液提供了更高質量的分離的質粒DNA。然而，注意在室溫加入的裂解溶液不提供分離的質粒DNA，并且分離的質粒DNA具有相當好的質量。
實施例5核酸捕獲基質的基質材料和孔隙大小對于高產率和質量分離是關鍵的本發明的裂解方法用于評估具有不同組成和孔隙大小的許多濾膜物質分離高質量低分子量核酸的有效性。研究了濾器類型和孔隙大小分離高產率和高質量低分子量核酸的有效性。
從靶標宿主細胞釋放低分子量核酸的方法如上文描述。簡言之，在96孔培養板中靶標宿主細胞中增殖靶標低分子量核酸。宿主細胞生長到預定濃度，旋轉沉淀細胞并除去生長培養基。向每孔加入約240μl預冷的裂解溶液并將細胞在調節到7的平板振蕩器上重懸浮2分鐘。
改變過濾板的孔中的過濾條件，其中每個板的孔具有6種過濾組合之一，如下制備這些過濾組合樣品1包括兩層NA捕獲基質；層1(上層)為玻璃纖維層(1.2μm孔隙大小)，層2(中間)為玻璃纖維(0.8μm)，玻璃料為聚乙烯；樣品2包括與樣品1相同的組合，只是玻璃料為疏水的；樣品3包括兩層，第一層為23μm玻璃纖維濾器，其在孔隙大小為25μm的玻璃料上面；樣品4包括11μm玻璃纖維濾器/聚丙烯25-30μm組合；樣品5包括聚丙烯25-30μm上20μm/11μm玻璃纖維濾器組合；樣品6包括聚丙烯25-30μm上7μm玻璃纖維濾器組合。
表7中的結果表明，不像常規分離技術，本發明提供了用孔隙大小通常大于約1μm的捕獲基質提供了最佳結果。用樣品3和5中基質組合看到了本實施例的最好結果，表明11μm玻璃纖維濾器和23μm玻璃纖維濾器上的20μm玻璃纖維濾器提供了用于本發明的良好的低分子量核酸捕獲和釋放特征。
表7NA捕獲基質結果
使用在1.5ml宿主細胞培養液和400μl裂解預冷的溶液實施第二系列實驗。樣品與室溫下的裂解溶液孵育5分鐘。如下試驗14種不同的捕獲基質組合(1)Pallflex U100z Med.(粗糙的面向上)；(2)S&S GF#25；(3)Pallflex 2500-S 2608G(平滑的面向上)；(4)Pallflex 2500-S2608G(粗糙的面向上)；(5)Pallflex 2500 AE53009M(平滑的面向上)；(6)Pallflex 2500 AE 53009M(粗糙的面向上)；(7)Whatman GMF 934AH；(8)Whatman GMF 150 2μm(相同孔隙大小的兩層)；(9)Wha tman 150 2μm(僅頂層)；(10)20μm PE玻璃料與5μm GF層；(11)一層5μm GF；(12)S&S GF號24(平滑的面向上)；(13)23μm玻璃纖維濾器(Ciro)和(14)23μm玻璃纖維濾器(Ciro)與標準緩沖液。
試驗所分離的質粒DNA的濃度和質量以及用于測序反應中。(見表8和9)。結果表明玻璃纖維和較大孔隙大小樣品是核酸捕獲基質的良好候選者。
表8NA捕獲基質濃度、A260/280、和A212結果
表9分離的低分子量核酸的測序質量
第三個系列實驗在表10和圖4中顯示，其中試驗了NA捕獲基質材料和孔隙大小從細菌宿主細胞來源分離質粒DNA的能力。收獲含有XL1Blue/pBS2的細菌宿主細胞并如上面實施例中在前描述的用裂解溶液處理。相似處理的樣品與尼龍、PVDF或者玻璃纖維濾器接觸，這些濾器具有如下描述的孔隙大小(1)0.45μm尼龍纖維，(2)1.2μm尼龍纖維，(3)5.0μm尼龍纖維，(4)PallflexEmfab纖維與70μm玻璃料，(5)0.45μm PVDF，(6)1.0μm玻璃纖維濾器，(7)兩層1.2μm玻璃纖維濾器，(8)23μm玻璃纖維濾器，(9)20μm玻璃料上為3μm玻璃纖維濾器，再上面為5μm玻璃纖維濾器。
圖4表明盡管用尼龍或者Pallflex分離質粒DNA產生了合適的結果，玻璃纖維材料，尤其樣品9中兩層玻璃纖維材料在本發明背景中提供了極好的NA捕獲基質。如表10中所示，所分離的質粒DNA的質量顯示出良好的A260/A280比例和A212讀數，特別對于具有孔隙大小為4/μm的第一層和孔隙大小為3μm的第二層的兩層玻璃纖維捕獲基質的樣品9。
表10質粒DNA質量
實施例6本發明的方法和組合物可用于許多不同的宿主細胞和靶標低分子量核酸下面的實例中的數據闡明所述裂解溶液可用于從幾種不同的宿主細胞分離不同大小的質粒DNA。宿主細胞/載體組合在LB/amp培養基中過夜生長14到16小時。每種細胞條件由1.5ml沉淀的培養物組成，將該沉淀的培養物用400μl裂解溶液(見實施例1)處理。表11和圖5中數據表明本發明的方法和組合物可用于許多不同的宿主細胞和不同的質粒。
表11來自不同宿主細胞的質粒DNA
實施例7所純化的低分子量核酸可以直接用于PCR反應用本發明的方法和組合物從宿主細胞回收后，所純化的低分子量核酸可直接在PCR反應中擴增。用本發明的方法和溶液處理含有來自小鼠cDNA文庫的pGEM克隆的細菌細胞，并將分離的pGEM直接用于PCR反應中，即從本發明的NA捕獲基質洗脫pGEM后，不對其實施額外的步驟。PCR反應摻入T7和Sp6引物并且用本領域中熟知的PCR方法實施該PCR反應。
如圖6中所示，用本發明的方法和組合物分離的pGEM DNA是PCR的極好的模板。該數據表明本發明提供了可以直接用于PCR的質量DNA，重要的是，該DNA在用于這些反應中時不需要額外的操作。
實施例8用本發明的方法和組合物可以以96孔形式分離質粒DNA在96孔板中生長含有pUC19質粒的細菌宿主細胞以確定本發明的方法和組合物是否可應用于高通量應用。
如上述生長和旋轉沉淀細胞，只是細胞生長在96孔板的孔中并且用平板離心機沉淀。向每孔加入約400μl預冷的裂解溶液。將板振蕩、渦旋或者每孔單獨上下吹打以完全混合裂解溶液中的細胞。然后室溫孵育5分鐘并洗脫和分析DNA。如表12中所示，從96孔板生長的宿主細胞分離的質粒DNA顯示出良好的質量和產率。注意質粒DNA在96孔濾器板中捕獲，該板中每孔具有一對玻璃纖維層，它們的孔隙大小為5μm和3μm，NA捕獲基質在7μm玻璃料上。
該實施例中的數據表明本發明的方法和組合物適用于高通量應用，例如，96孔形式板。此外，所述數據還表明通過在平板振蕩器上振蕩平板，在平板渦旋器上渦旋該平板，或者用96孔針頭吹打每孔的內含物可以完成細胞與裂解溶液的混合。
表12來自96孔板的48個孔的數據
實施例9使用本發明的方法和組合物純化的質粒DNA的質量與其他常規質粒DNA純化方法相當來自劃線LB瓊脂板的2到5毫升培養物(Top10細胞/pSV-β-gal)過夜生長達到所希望的細胞密度。在15ml錐形管中實施生長。收獲約1.5ml細胞并沉淀和根據本發明中描述的方法和組合物或者根據生產商的建議(Qiagen、Invitrogen、Biorad或者Promega)處理(見實施例1-8)。具體地，使用裂解溶液分離的質粒DNA的質量與用Qiagenprep Miniprep試劑盒、WizardPlus SV Minipreps DNA純化系統(Promega)、AurumPlasmid Mini試劑盒(BioRad)、S.N.A.PMiniPrep試劑盒(Invitrogen)分離的質粒DNA的質量進行比較。對每種方法使用相似數量的起始細胞和洗脫體積。
通過瓊脂糖凝膠分析、分光光度法分析、DNA測序和限制酶消化比較純化的質粒DNA。
瓊脂糖凝膠電泳分析將用QIAgen方法和本文中描述的裂解方法分離的約4％質粒DNA加到含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中。注意在加入凝膠前向每個樣品加入1.5×Orange II染料。此外，加入100ng和200ng pUC19質粒DNA作為對照。如圖7A中所示，根據本發明分離的質粒DNA提供了與QIAgen分離的質粒DNA相當的產率。
分光光度分析用SPECTRAmax微板分光光度計(MolecularDevices Corp.)分析來自每種純化方法的樣品以確定DNA濃度和純度。將樣品在UV-Star 96孔板(Greiner bio-one Corp.)中稀釋20倍。在下面的波長采集吸收讀數260、280和212nm。每種樣品一式兩份地進行。將濃度和A260/280比率平均以確定圖7B中給出的值。圖7B中的數據闡明本裂解方法提供了極佳的濃度和產率，與QIAgen、Invitrogen、BioRad或者Promega試劑盒相當或者更好。
DNA測序通過ABI BigDyeTM終止子化學在ABI 3700測序儀上測序進一步分析每種方法的樣品。對質粒DNA實施測序并且一式兩份地進行。將模板DNA加入反應物并且模板DNA根據載體和沉淀的起始材料而變。將200ng到300ng模板DNA等分到96孔板(Genemate-ISC Bioexpress)中，總體積為4μl。測序參數如下步驟1-94℃2分鐘；步驟2-94℃10秒；步驟3-50℃5秒；步驟4-70℃4分鐘；步驟5-返回步驟2并重復25次，步驟6-10℃保持。
在裝入ABI 3700 DNA測序儀前實施測序清除。向每孔加入約15微升99％異丙醇并使用Expender Heat Sealer熱封，然后快速渦旋。將樣品在室溫孵育15分鐘并以1900×g離心30分鐘。離心后，除去熱封并將板倒置在紙巾上然后倒轉返回到離心板載體。將該板以500×g旋轉1分鐘。將該板從離心機除去并將DNA重懸浮在10微升1/10×TE中并裝入測序儀。用基于PHRED的軟件版本0.020425.c(CodonCorporation)實施質量得分。100質量得分≥20的那些樣品為合格的結果。
如表13中所示，所有5種試劑盒都提供了合格的測序得分。此外，圖8提供了每種試劑盒的DNA的闡明性測序追蹤。該數據表明本裂解和純化方法和組合物提供了與使用其他試劑盒廠商的試劑盒分離的DNA相當質量的DNA。注意到本發明，包括洗脫步驟，在約14分鐘內進行，而QIAgen花費約28分鐘，Invitrogen花費約31分鐘，Promega花費約36分鐘。BioRad Aurum試劑盒花費約23分鐘。該數據闡明本文提供的裂解溶液和方法的改良的實用性。
表13合格測序得分
限制酶消化用EcoRI、HindIII和Ned I對pSV-β-gal載體實施限制性消化。對250ng質粒DNA和1單位每種內切酶實施限制性消化。緩沖液條件如酶生產商描述。如圖9中所示，本裂解分離的DNA為限制性內切酶提供了與其他常規分離方法相當的模板DNA。
實施例10PEG和鹽結合溶液驅使NA結合二氧化硅纖維下面的實施例中的數據闡明PEG和鹽的溶液可用于迫使低分子量核酸結合基于玻璃纖維的NA捕獲基質。用如本領域中熟知的堿性裂解方法處理含有pUC19的宿主細胞。將澄清的裂解物置于本發明的基于二氧化硅的旋轉裝置上并確定所分離的pUC19的產率和A260/280讀數。備選地，將澄清的裂解物與8.5％PEG/850mM NaCl溶液組合并與上面的澄清裂解物基本上相同地處理。
如圖10B中所示，PEG和鹽驅使澄清裂解物中的pUC19結合基于二氧化硅的濾器(泳道1-4)。相比，不加入PEG和鹽的澄清裂解物不能提供任何可檢測的pUC19與目標基于二氧化硅的捕獲基質的結合(泳道5-8)。如圖10A中所示，當本發明的裂解溶液與本發明的NA捕獲基質連用時得到最佳結果-其中該裂解溶液包括先前描述的濃度的PEG和鹽(如泳道4-6和7-9中所示)。注意到當本發明的裂解溶液不含有PEG或者鹽時，泳道1-3不顯示出質粒DNA的純化。
實施例11在本發明的核酸純化方法期間可以向細胞培養物直接加入裂解溶液下面的實施例中的數據闡明本文中描述的裂解溶液甚至當直接加入液體細菌培養物(細胞未沉淀)時也在本發明的方法中有效。如實施例1中描述的制備裂解溶液。將樣品加入多層玻璃纖維(5μm和3μm)濾器裝置或者單層Whatman 23μm玻璃濾器裝置。
將約1.5ml pUC19/XL1blue轉化的細胞培養物與2.25ml冷卻的裂解溶液混合并將細胞渦旋30秒。允許細胞在室溫孵育3分鐘并除去約930μl裂解物并將其加到多層或單層旋轉裝置以分離pUC19。注意到將每種培養物分成4份樣品，導致產率為從1.5ml培養物通常預期的產率的1/4。裂解物在旋轉裝置中旋轉沉淀并用約500μl洗滌緩沖液洗滌濾器。如前面描述的實施質粒洗脫。如上述實施吸收讀數和凝膠電泳。
如表14和圖11中所示，從液體培養物提取質粒DNA導致提取和純化高質量DNA。結果顯示幾乎沒有蛋白質或者RNA污染(見圖11中A260/280讀數和質粒帶)。這些結果表明本發明的方法和溶液可以并入不需要在加入裂解溶液前沉淀細胞的方法中。這是有較大意義的結果-允許本發明的方法和溶液用于進一步減小從目標起始材料分離高質量核酸的復雜性和所需時間。
表14來自液體培養物與裂解溶液直接混合的數據(所有讀數進行兩次)
將清楚本發明適于實現本文中提到的目標和優點以及內在的那些優點。盡管為了公開的目的描述了當前優選的實施方案，但是可以進行多種改變和修飾，它們是本領域中技術人員容易聯想的并且包括在本文中公開的本發明和如所述權利要求書定義的精神內。
將本文中引用的所有出版物并入作為參考。
權利要求
1.用于裂解宿主細胞的裂解組合物，其含有緩沖劑；和兩性離子去污劑；其中宿主細胞中的至少一部分蛋白質被該兩性離子去污劑溶解。
2.權利要求1的組合物，其還含有溶菌酶。
3.權利要求2的組合物，其還含有RNA酶。
4.權利要求2的組合物，其還含有DNA酶。
5.權利要求2的組合物，其還含有聚乙二醇。
6.權利要求1的組合物，其中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
7.權利要求6的組合物，其中所述兩性離子去污劑的終濃度為約1％到約5％。
8.權利要求1的組合物，其還含有離液序列高的鹽。
9.權利要求1的組合物，其中所述組合物的最終pH為約7.9到約8.4。
10.用于從宿主細胞純化低分子量核酸的試劑盒，該試劑盒含有用于從宿主細胞純化低分子量核酸的裂解溶液，該裂解溶液含有緩沖劑和兩性離子去污劑；和捕獲低分子量核酸的核酸捕獲基質。
11.權利要求10的試劑盒，其中所述核酸捕獲基質包含旋轉柱，所述旋轉柱含有捕獲基質材料。
12.權利要求11的試劑盒，其中所述捕獲基質材料含有平均孔隙大小為至少1μm的玻璃纖維。
13.權利要求11的試劑盒，其中所述捕獲基質材料含有平均孔隙大小為至少3μm的玻璃纖維。
14.權利要求13的試劑盒，其還含有用于支持捕獲基質材料的玻璃料。
15.權利要求10的試劑盒，其還含有用于從捕獲的低分子量核酸除去污染物的洗滌緩沖液；和用于從核酸捕獲基質洗脫捕獲的低分子量核酸的洗脫緩沖液。
16.權利要求10的試劑盒，其中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
17.權利要求16的試劑盒，其中所述兩性離子去污劑的終濃度為約0.2％到約6％。
18.權利要求10的試劑盒，其還含有溶菌酶。
19.權利要求10的試劑盒，其還含有RNA酶。
20.權利要求10的試劑盒，其還含有DNA酶。
21.權利要求10的試劑盒，其還含有用于培養細胞的管。
22.權利要求21的試劑盒，其中所述用于培養細胞的管為lid-bac管。
23.權利要求10的試劑盒，其中所述核酸捕獲基質整合到96孔板的至少一孔中，其中該96孔板包括在試劑盒中。
24.用于從宿主細胞純化低分子量核酸的方法，該方法包括向宿主細胞加入裂解量的裂解溶液以從宿主細胞釋放低分子量核酸，所述裂解溶液含有兩性離子去污劑；將用該裂解溶液處理的宿主細胞與核酸捕獲基質組合，該核酸捕獲基質具有平均孔隙大小為至少1μm的至少一層捕獲基質材料用于捕獲低分子量核酸；和從該核酸捕獲基質洗脫低分子量核酸。
25.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液中所述兩性離子去污劑為約0.2％到約6％。
26.權利要求25的方法，其中所述裂解溶液中所述兩性離子去污劑為約1％到約5％。
27.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
28.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液在加入宿主細胞前冷卻到低于室溫的溫度。
29.權利要求28的方法，其還包括將裂解溶液與宿主細胞在室溫孵育至少3分鐘后與所述核酸捕獲基質組合。
30.權利要求29的方法，其中所述孵育為至少5分鐘。
31.權利要求24的方法，其還包括洗脫前將具有捕獲的低分子量核酸的核酸捕獲基質用洗滌緩沖液洗滌。
32.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有聚乙二醇。
33.權利要求32的方法，其中所述聚乙二醇的終濃度為約2％到約20％。
34.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有溶菌酶。
35.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有RNA酶。
36.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有DNA酶。
37.權利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有離液序列高的鹽。
38.權利要求24的方法，其中所述低分子量核酸含有質粒DNA。
39.用于從宿主細胞釋放染色體外DNA的組合物，其含有具有約0.2％到約6％兩性離子去污劑的溶液。
40.權利要求39的組合物，其中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
41.權利要求40的組合物，其還含有溶菌酶。
42.權利要求41的組合物，其還含有RNA酶。
43.權利要求41的組合物，其還含有聚乙二醇。
44.權利要求41的組合物，其還含有離液序列高的鹽。
45.用于在分離細胞蛋白質與核酸期間溶解細胞蛋白質的組合物，其含有選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物的去污劑。
46.權利要求45的組合物，其中所述去污劑的終濃度為約0.2％到約6％。
47.權利要求46的組合物，其中所述去污劑的終濃度為約1％到約5％。
48.用于從澄清的裂解物分離核酸的裂解組合物，其含有緩沖劑；聚乙二醇；和鹽；其中將裂解組合物加入澄清的裂解物，和將澄清的裂解物和裂解組合物的組合加入二氧化硅纖維以在該二氧化硅纖維上捕獲該核酸。
49.從細胞培養物中的宿主細胞純化低分子量核酸的方法，該方法包括向細胞培養物加入裂解量的裂解溶液以從宿主細胞釋放低分子量核酸；合并用裂解溶液處理的宿主細胞與核酸捕獲基質，該核酸捕獲基質具有平均孔隙大小至少1μm的至少一層捕獲基質材料用于捕獲低分子量核酸；和從核酸捕獲基質洗脫低分子量核酸。
50.權利要求49的方法，其中以裂解溶液與細胞培養物體積的比為約1∶2到約3∶1的比例將所述裂解溶液加入該細胞培養物。
全文摘要
提供了用于溫和裂解和溶解細胞的方法和組合物。還提供了用于從宿主細胞快速純化高質量低分子量核酸的方法和組合物。將靶細胞用含有兩性離子去污劑，例如，正－十二基－N，N－二甲基－3－銨基－1－丙烷磺酸鹽的預冷的裂解溶液處理，并短暫室溫孵育。當需要核酸純化時，將裂解溶液處理的細胞與平均孔隙大小至少1μm的核酸捕獲基質接觸。
文檔編號C07H21/00GK1768265SQ200380110142
公開日2006年5月3日 申請日期2003年12月16日 優先權日2003年3月12日
發明者M·J·多曼尼科, M·邁爾斯, K·基恩, L·R·布勞恩, T·科爾曹 申請人:伊彭多夫公司