專利名稱：微流控芯片及核酸提取純化方法
微流控芯片及核酸提取純化方法
技術領域：
本發明涉及核酸提取與純化領域，尤其涉及一種微流控芯片及核酸提取純化方法。
背景技術：
生物大分子核糖核酸的分離與純化技術是進行分子生物學各方面研究的基礎，是 生命科學研究與應用中的關鍵技術。隨著微流控技術的發展應用，基于微流控芯片的核酸 提取方法也得到了發展。傳統的芯片提取核酸方法是將二氧化硅固定在芯片內壁，或者將 硅膠、硅藻土、玻璃珠、有機硅烷顆粒、磁珠等基質填充在芯片通道內，來吸附核酸。首先采 用變性劑、蛋白酶K等裂解組織，釋放出核酸后，再用苯酚、氯仿萃取，異丙醇沉淀，去除上 清后得到核酸。傳統方法步驟繁瑣，耗時長，提取率低，重復性差。

發明內容鑒于此，有必要提供一種高效、穩定、簡便的提取純化核酸的微流控芯片。同時，還有必要提供一種高效、穩定、簡便的核酸提取純化方法。一種微流控芯片，包括細胞培養微單元、混合微單元、核酸收集微單元及微通道， 所述細胞培養微單元用于培養增殖和消化細胞，再將消化好的細胞通入至所述混合微單 元，所述混合微單元用于裂解消化好的細胞，并將細胞裂解液通入至所述核酸收集微單元， 所述核酸收集微單元用于收集純化核酸，所述微通道連接所述細胞培養微單元、混合微單 元及核酸收集微單元，并是液體通入和流出的通道。優選的，微流控芯片為3層膜結構。優選的，3層膜結構包括兩層聚二甲基硅氧烷膜和一層玻璃基片，所述兩層聚二甲 基硅氧烷膜位于所述玻璃基片上方。優選的，該微流控芯片還包括氣室、氣體通道、橫向微閥及縱向微閥，所述氣室用 于存儲氣體，氣體通道用于連接氣室并且控制氣體的流向，所述橫向微閥及縱向微閥控制 所述微通道中液體的流向。優選的，氣室、氣體通道、橫向微閥及縱向微閥位于所述兩層聚二甲基硅氧烷膜之 間。優選的，細胞培養微單元、混合微單元、核酸收集微單元及微通道位于中間的聚二 甲基硅氧烷膜與玻璃基片形成的空間之中。優選的，核酸收集微單元還包括磁場裝置，所述磁場裝置用于磁性吸附四氧化三 鐵磁性納米顆粒。利用上述微流控芯片的核酸提取純化方法，包括如下步驟A、培養含目的核酸的細胞；B、通入消化液對細胞進行脫壁消化；C、通入裂解液對 消化后的細胞進行裂解，得到含核酸物質的細胞裂解液；D、從細胞裂解液中提取純化核酸。優選的，還包括進行步驟A之前依次使用雙蒸水、D-Hanks平衡鹽溶液對微流控芯片進行浸泡和沖洗步驟和結束步驟D之后撤去磁場，使用雙蒸水對微流控芯片進行沖洗步
馬聚ο優選的，步驟B中通入消化液對細胞進行脫壁消化還包括在此之前通入中性pH的 磷酸鹽緩沖液對細胞進行沖洗步驟。優選的，步驟D包括D1、通入pH 6. 3-6. 7的酸性的懸浮有四氧化三鐵磁性納米 顆粒的緩沖液，通過磁場固定四氧化三鐵磁性納米顆粒；D2、將含有核酸的細胞裂解液通過 四氧化三鐵磁性納米顆粒，在酸性條件下，核酸與四氧化三鐵磁性納米顆粒相結合形成核 酸_磁納米顆粒復合物而被固定；D3、通入洗滌液對未結合到四氧化三鐵磁性納米顆粒上 的蛋白質、脂類細胞雜質成分進行洗滌；D4、通入pH 8. 4-8. 6的堿性的緩沖液對核酸-磁納 米顆粒復合物進行洗脫，堿性條件下，核酸與四氧化三鐵磁性納米顆粒分離，收集含有純化 核酸的洗脫液。優選的，核酸為DNA。通過將細胞的培養、細胞裂解、核酸的收集純化集中到一個微流控芯片上，優化了 核酸提取純化流程，極大的提高了提取純化的效率，簡化人為操作程序，并且實現了傳統方 法難以實現的時空分辨信息，取得了較好的核酸提取純化效果。

圖1為本發明微流控芯片平面結構示意圖。圖2為四氧化三鐵磁性納米顆粒的結構示意圖。
具體實施方式微流控芯片的芯片主體包括兩層聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜和一層玻璃基片，兩 層PDMS膜設置位于玻璃基片上方，采用三層芯片設計，使整個核酸的提取和純化全過程包 括細胞培養，細胞裂解，核酸分離、洗脫及收集等集成到一個芯片上，適于多種核酸樣品的 提取與純化。3層膜結構的微流控芯片，上面2層為PDMS膜，下面為玻璃基片，中間的PDMS膜與 玻璃基片之間為微流控通道結構，包括細胞培養微單元110、混合微單元120、核酸收集微 單元130及微通道，如圖1所示。上面兩層PDMS膜之間形成的區室包括氣室和氣體通道， 氣室主要用于存儲氣體，是氣體物質的緩沖間，氣體通道主要用于控制氣體的進出和流向； 并且集成有橫向微閥和縱向微閥，如橫向微閥151，縱向微閥152，控制液體的進出流向。細胞培養微單元110主要用于培養細胞；混合微單元120主要用于裂解培養好的 細胞；核酸收集微單元130利用磁場吸附的四氧化三鐵磁性納米顆粒(四氧化三鐵磁性納 米顆粒及其制備方法見下文描述，并已另案申請專利)來吸附核酸，與核酸形成核酸-磁納 米顆粒復合物，從而達到核酸與細胞雜質成分分離的目的；微通道包括第一通道141、第二 通道142、第三通道143、第四通道144、第五通道145、第六通道146、第七通道147及第八通 道 148。通過最左邊的第一通道141將待培養的含目的核酸的細胞懸浮液通入到細胞培 養微單元110，細胞在細胞培養微單元110處培養增殖，培養過程中產生的廢液從第二通 道142流出；待細胞培養結束后，從第一通道141通入消化液將細胞脫壁消化，消化好的細胞被輸送到混合微單元120，與此同時通過第三通道143將細胞裂解液通入到混合微單元 120，消化好的細胞在混合微單元120處被細胞裂解液充分裂解；待細胞裂解成細胞碎片， DNA等核酸從細胞核中釋放出來后，通過第四通道144將四氧化三鐵磁性納米顆粒通入到 核酸收集微單元130中，核酸收集微單元130下面分布有磁場，四氧化三鐵磁性納米顆粒通 過磁場引力被固定在基片上，用于懸浮四氧化三鐵磁性納米顆粒的緩沖液從第五通道145 中流出；然后再將含有核酸的細胞裂解液通入到核酸收集微單元130，在pH酸性的溶液中， 核酸與四氧化三鐵磁性納米顆粒相結合形成核酸_磁納米顆粒復合物而被固定在基片上； 從第六通道146中通入酸性洗滌液對核酸收集微單元130進行洗滌以除去蛋白、脂類等細 胞雜質成分，洗滌結束后的廢液通過第五通道145流出；從第七通道147通入堿性緩沖液對 核酸_磁納米顆粒復合物進行洗脫，收集從第八通道148流出含有純化核酸的洗脫液。下面通過實施例來具體說明核酸的提取純化方法流程。實施例一，人宮頸癌海拉(Hela)細胞核酸的提取純化A、用雙蒸水、D-Hanks平衡鹽溶液(D_漢克斯平衡鹽溶液主要用于洗滌細胞和組 織，也是合成培養基的基礎液)依次對微流控芯片的各通道和微單元進行浸泡和沖洗；B、將培養好的人宮頸癌Hela細胞從貼壁培養的培養瓶上消化懸浮在培養液中， 通過第一通道141通入微流控芯片的細胞培養微單元110，在二氧化碳培養箱中培養24小 時，直到細胞布滿細胞培養微單元110 ；C、再從第一通道141通入pH為中性(pH值為7. 3-7. 5)的磷酸鹽緩沖液對培養細 胞進行沖洗，然后通入消化液對細胞進行脫壁消化，直到細胞從玻璃基片上脫落；D、將消化好的細胞通入混合微單元120，同時從第三通道143將含有十二烷基磺 酸鈉等成分的細胞裂解液通入混合微單元120，溶液在此處混合，細胞被裂解，促使核酸釋 放到裂解液中；E、從緩沖液通道泵入pH為酸性的(pH為6. 3-6. 7)的懸浮有四氧化三鐵磁性納米 顆粒的緩沖液，通過磁場使四氧化三鐵磁性納米顆粒固定在核酸收集微單元；F、將上述步驟D中得到的含有核酸的細胞裂解液通入到核酸收集微單元130，在 PH酸性的溶液中，核酸與四氧化三鐵磁性納米顆粒相結合形成核酸_磁納米顆粒復合物；G、從第六通道146通入洗滌液對核酸收集微單元130中未結合到納米顆粒上的蛋 白、脂類等細胞雜質成分進行洗滌；H、從第七通道147通入pH為堿性(pH為8. 4-8. 6)的緩沖液對核酸-磁納米顆粒 復合物進行洗脫，并收集含有純化核酸的洗脫液；I、撤除磁場，用雙蒸水對整個微流控芯片進行洗滌。通過將細胞的培養、細胞裂解、核酸的收集純化集中到一個微流控芯片上，優化了 核酸提取純化流程，極大的提高了提取純化的效率，提升了生命科學研究過程的速度和質 量，簡化人為操作程序，避免了有毒試劑的使用，并且實現了傳統方法難以實現的時空分辨 信息，取得了較好的核酸提取純化效果。四氧化三鐵磁性納米顆粒及其制備方法如圖2所示，為四氧化三鐵磁性納米顆粒的結構示意圖，該納米顆粒包括四氧化 三鐵納米內核(Fe3O4)、二氧化硅網狀分子、氨基鏈烴化合物和羧基鏈烴化合物，并且氨基鏈 烴化合物和羧基鏈烴化合物具有鏈端氨基和羧基，二氧化硅網狀分子形成殼層，其上同時交聯有氨基鏈烴化合物和羧基鏈烴化合物，四氧化三鐵納米內核粒徑為8-12nm，被二氧化 硅網狀分子包裹形成核心。四氧化三鐵磁性納米顆粒的制備流程包括如下步驟在200ml無水乙醇中加入7. Og/Ι的2. Oml預制的硅化四氧化三鐵納米顆粒內核 材料，然后再加入7. 2ml濃氨水，最后加入不同配比的正硅酸乙酯、二乙烯三胺基丙基三甲 氧基硅烷與N-(丙基三甲氧基硅烷)-乙二胺-三乙酸鈉120ml。將上述溶液混勻，在攪拌 的條件下反應1 左右后停止反應，溶液由剛開始完全透明的狀態變為半透明，即得到表 面同時修飾有氨基和羧基的四氧化三鐵硅殼磁性復合納米顆粒，爾后用磁分離器洗滌、收 集顆粒備用。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1.一種微流控芯片，其特征在于，包括細胞培養微單元、混合微單元、核酸收集微單元 及微通道，所述細胞培養微單元用于培養增殖和消化細胞，再將消化好的細胞通入至所述 混合微單元，所述混合微單元用于裂解消化好的細胞，并將細胞裂解液通入至所述核酸收 集微單元，所述核酸收集微單元用于收集純化核酸，所述微通道連接所述細胞培養微單元、 混合微單元及核酸收集微單元，并是液體通入和流出的通道。
2.如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片為3層膜結構。
3.如權利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述3層膜結構包括兩層聚二甲基硅 氧烷膜和一層玻璃基片，所述兩層聚二甲基硅氧烷膜位于所述玻璃基片上方。
4.如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，還包括氣室、氣體通道、橫向微閥及 縱向微閥，所述氣室用于存儲氣體，氣體通道用于連接氣室并且控制氣體的流向，所述橫向 微閥及縱向微閥控制所述微通道中液體的流向。
5.如權利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述氣室、氣體通道、橫向微閥及縱 向微閥位于所述兩層聚二甲基硅氧烷膜之間。
6.如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述細胞培養微單元、混合微單元、 核酸收集微單元及微通道位于中間的聚二甲基硅氧烷膜與玻璃基片形成的空隙之間。
7.如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述核酸收集微單元還包括磁場裝 置，所述磁場裝置用于磁性吸附四氧化三鐵磁性納米顆粒。
8.利用權利要求1所述微流控芯片的核酸提取純化方法，包括如下步驟A、培養含目的核酸的細胞；B、通入消化液對細胞進行脫壁消化；C、通入裂解液對消化后的細胞進行裂解，得到含核酸物質的細胞裂解液；D、從細胞裂解液中提取純化核酸。
9.如權利要求8所述的核酸提取純化方法，其特征在于，還包括進行步驟A之前依次使 用雙蒸水、D-Hanks平衡鹽溶液對微流控芯片進行浸泡和沖洗步驟和結束步驟D之后撤去 磁場，使用雙蒸水對微流控芯片進行沖洗步驟。
10.如權利要求8所述的核酸提取純化方法，其特征在于，所述步驟B中通入消化液對 細胞進行脫壁消化還包括在此之前通入中性PH的磷酸鹽緩沖液對細胞進行沖洗步驟。
11.如權利要求8所述的核酸提取純化方法，其特征在于，所述步驟D包括D1、通入pH 6. 3-6. 7的懸浮有四氧化三鐵磁性納米顆粒的緩沖液，通過磁場固定四氧 化三鐵磁性納米顆粒；D2、將含有核酸的細胞裂解液通過四氧化三鐵磁性納米顆粒，在酸性條件下，核酸與四 氧化三鐵磁性納米顆粒相結合形成核酸_磁納米顆粒復合物而被固定；D3、通入洗滌液對未結合到四氧化三鐵磁性納米顆粒上的蛋白質、脂類細胞雜質成分 進行洗滌；D4、通入pH 8. 4-8. 6的緩沖液對核酸-磁納米顆粒復合物進行洗脫，堿性條件下，核酸 與四氧化三鐵磁性納米顆粒分離，收集含有純化核酸的洗脫液。
12.如權利要求8至11中任意一項所述的核酸提取純化方法，其特征在于，所述核酸為DNA。
全文摘要
本發明涉及一種微流控芯片及應用該芯片的核酸提取純化方法，該微流控芯片包括細胞培養微單元、混合微單元、核酸收集微單元及微通道，其中細胞培養微單元用于培養增殖和消化細胞，再將消化好的細胞通入至混合微單元裂解，然后將細胞裂解液通入至核酸收集微單元，收集純化核酸，微通道連接細胞培養微單元、混合微單元及核酸收集微單元，并是液體通入和流出的通道。通過將細胞的培養、細胞裂解、核酸的收集純化集中到一個微流控芯片上，優化了核酸提取純化流程，極大的提高了提取純化的效率，簡化人為操作程序，并且實現了傳統方法難以實現的時空分辨信息，取得了較好的核酸提取純化效果。
文檔編號C12M1/42GK102115711SQ20101004268
公開日2011年7月6日 申請日期2010年1月6日 優先權日2010年1月6日 公開號201010042681.X
發明者胡德紅, 蔡林濤, 鄭明彬, 龔萍 申請人:深圳先進技術研究院