專利名稱：一種豬產仔數性狀的分子標記方法
技術領域：
本發明屬于動物的基因多態性技術領域，具體涉及豬的性激素結合球蛋白(SHBG)基因多態性。

背景技術：
性激素結合球蛋白(Sex Hormone-Binding Globulin，SHBG)，又稱睪酮-雌二醇結合球蛋白，SHBG是一運輸性激素的載體，動物性激素到達靶組織是由血液中的SHBG來調控的，SHBG是在肝細胞中表達的一種糖蛋白質，這種蛋白質特異性地與性激素相結合并參與其轉運，調控血液中生物活性的性激素濃度。生理情況下，性激素結合球蛋白(SHBG)復合物的快速解離與游離性激素和SHBG相結合之間存在著動態平衡，性激素由于與SHBG結合而得到保護，從而避免了血管的吸附、生物和化學的破壞以及快速降解，只有游離的性激素才具有生物活性。性激素變化可引起性功能異常，但是，由于SHBG對游離性激素水平有調節作用，甚至即使血漿中性激素總體水平正常.而游離的性激素卻可能異常。SHBG基因主要在肝臟、卵巢(或睪丸)內表達，雖然組織來源不同，但結構基因是相同的，由于SHBG基因發生單核苷酸突變造成SHBG分子一級結構的改變，改變了SHBG與性激素結合和運輸的效率，從而使性激素(雌二醇、睪酮等)不能作用于靶組織，造成母豬的卵巢機能紊亂，使母豬出現乏情。因此，研究豬的SHBG基因多態性與母豬繁殖性能的關系，將對提高母豬繁殖性能提供又一分子遺傳基礎。
豬的SHBG基因至今尚未見研究報道。但人的SHBG相關研究較多，為研究豬的SHBG基因提供了寶貴的可借鑒的資源，人的SHBG基因位于17號染色體上的p12→p13，基因全長4kb，它是在激素和代謝調節因子的調控下由肝細胞進行表達合成。目前較多的研究主要在于人的SHBG基因多態性對性激素的調控水平上，以期能在遺傳疾病方面獲得進展。在人類SHBG基因上的研究表明，在患有高雄激素癥，尤其是患有多囊卵巢綜合癥(Papillary SerousOvarian Carcinoma PSOC)和一些患有高度危險性的糖尿病和心臟病的人的血清中SHBG水平含量很低，說明SHBG與人的卵巢功能、血液中性激素及其他疾病有關。SHBG基因變異，尤其是在5’端座位上距翻譯起始位點第8個堿基的A→G，極顯著地影響血清中SHBG水平，Dunning等研究發現，該位點AA基因型個體比GG型個體的血液中SHBG含量高28％，Eriksson等也發現該位點AA基因型比AG和GG型個體分別高22％和26％。在內含子1中有一突變位點C→T，該突變位點也與SHBG含量存在著相關。在第8外顯子存在一個A→G突變位點，該突變位點可導致SHBG蛋白的Asn氨基酸突變為ASP氨基酸，使SHBG含量改變，但比其他位點突變所改變的程度小，但Asn突變為Asp影響了一個潛在的糖基化位點，增大了少量等位基因編碼蛋白的半衰期。含有6個單核苷酸的重復序列個體明顯比不攜帶此重復序列的SHBG水平低。家兔SHBG的單體比人的短6個氨基酸殘基，兩個N-寡糖鏈連結于Asn345和Asn361上，沒有O-寡糖鏈，也沒有明確的內部重復序列。
目前，由于豬的SHBG基因尚無研究報道，于是安徽省農業科學院立項研究豬的SHBG基因結構及多態性分析，成功分離出了豬SHBG基因第4外顯子至第6外顯子的序列，建立了第6外顯子突變體的檢測方法，并分析了其多態性與產仔數之間的相關性。


發明內容
為了實現豬性激素結合球蛋白基因第6外顯子突變體的檢測，本發明提供一種豬產仔數性狀的分子標記方法。
本發明方法包括豬基因組DNA的提取、性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子引物設計、體外擴增和基因型檢測。
具體的操作方法如下 一種豬產仔數性狀的分子標記方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)采集耳組織樣 在仔豬出生當天，采取豬的耳緣組織； (2)基因組DNA提取 從豬的耳緣組織中提取豬的基因組DNA； (3)引物設計 在豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子兩端設計1對引物，即上游引物和下游引物，其序列如下 上游引物TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC長度bp217退火溫度63℃， 下游引物GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT長度bp217退火溫度63℃； (4)聚合酶鏈式反應 A、配制聚合酶鏈式反應體系 由4×dNTP2.5mmol/l脫氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、濃度為50ng/ul豬的DNA基因組溶液2ul、含20mmol/l氯化鎂(MgCl2)的10×聚合酶鏈式反應(PCR)緩沖液2.5ul，加水17.1ul至終體積25ul；并混合均勻，制得25ul聚合酶鏈式反應體系； B、聚合酶鏈式反應條件 將25μl聚合酶鏈式反應(PCR)體系放入聚合酶鏈式反應儀器，反應條件如下 ①94℃預變性4分鐘， ②94℃變性30秒， ③退火溫度63℃30秒， ④72℃延伸30秒， ⑤重復第②～④步驟35個循環， ⑥72℃延伸7分鐘，最后降溫至4℃保存，得到豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產物； (5)限制性內切酶酶切反應，多態位點限制性片段酶切多態性(RLFP)檢測 由于豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子第17位堿基由A突變為G，導致了一個Aval限制性內切酶的酶切多態性位點，具體酶切反應操作步驟是取豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產物10ul于聚合酶鏈式反應(PCR)管中，分別加入10U/ul Aval限制性內切酶1ul，Aval限制性內切酶緩沖液2ul，加水7ul，混勻，溫度37℃反應3小時，得到酶切產物； 將酶切產物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳2小時，電泳條件常溫，電壓120V，得到含酶切產物的凝膠；將含酶切產物的凝膠置于凝膠成像系統下觀測基因型，GG型個體為產仔數性狀優良基因類型，選擇其中條帶為GG型的個體留種，可提高選留群體的產仔數。
通過實驗，對瘦肉型淮豬品系一世代豬群性激素結合球蛋白基因多態性與產仔數的相關性分析如下 224頭淮豬新品系II系一世代母豬群性激素結合球蛋白(SHBG)基因多態性檢測結果，見表3。A等位基因頻率為0.487，G等位基因頻率為0.513，該豬群在該位點存在著豐富的多態性，經卡方(x2)檢驗，在A17G位點上處于哈德-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡狀態。
表3淮豬新品系一世代豬群SHBG基因多態位點遺傳參數
性激素結合球蛋白(SHBG)基因多態性與產仔數的關聯分析 利用SPSS13.0軟件的一般線性模型(GLM)程序對224頭的初產仔數進行最小二乘分析，并對基因效應進行了分析，結果見表4。GG型個體平均總產仔數最高為11.62頭，顯著高于AA型和AG型個體；GG型個體平均活產仔數為11.28頭，極顯著高于AA型和AG型個體，因此突變型(GG型)個體為該位點產仔數性狀的優良基因型。從基因效應分析看，顯性效應均為不完全顯性，SHBG基因對總產仔數和產活仔數均表現出負的加性效應；A等位基因的平均效應值(總產仔數和產活仔數)分別為-0.549和-0.593，G等位基因的平均效應值(總產仔數和產活仔數)分別為0.522和0.563；G等位基因替代A等位基因的平均效應值分別為1.071和1.156。
表4SHBG基因多態性與初產仔數相關性及基因效應分析(均數±標準誤)
注同一行肩標*與**(或**與***)表示差異顯著(P＜0.05)；標有*與***表示差異極顯著(P＜0.01)。
結論 在世代選育過程中未打破該位點的平衡狀態。并分析了該突變與豬產仔數的關系，發現該位點與產仔數性狀呈顯著相關，GG型個體總產仔數比AA型個體高2.12頭，活產仔數高2.28頭，該群體中突變型個體(GG型)在產仔數性狀上表現出較強的優勢，是產仔數性狀的優勢基因型。G等位基因替代A等位基因的平均效應值為正效應，表明G等位基因為該群體的優良基因，增加G等位基因的頻率可增加該群體的產仔數。
本發明的有益技術效果體現在以下方面 1、首次發現豬性激素結合球蛋白基因，并建立了檢測第6外顯子突變位點的檢測方法。
2、首次發現第6位點多態性與豬產仔數存在著顯著相關。
3、可以用于豬的育種中產仔數性狀的輔助選擇，可實現種豬的早期選種，甚至在豬剛出生時就可準確地進行選留，運用該基因聚合方法可以經過一個世代就可以將性激素結合球蛋白基因的優良基因型穩定下來，即經一個世代的選育即將該品系的生長性狀的優良基因達到純合，而常規育種方法要經過大量的生產性能測定和后裔測定，并且要繼代選育5個世代以上才能達到需要的效果，大大縮短了世代間隔，加快選擇進程。
4、該方法操作簡便，聚合酶鏈式反應過程中條件要求不高，擴增片段長度較短(217bp)，擴增較容易，提高了擴增效率及判斷基因型的準確性。



圖1為本發明性激素結合球蛋白(SHBG)基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖， 圖2為性激素結合球蛋白(SHBG)基因SSCP非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖， 圖3為性激素結合球蛋白(SHBG)基因部分序列比對分析圖， 圖4為性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子限制性內切酶(Aval)酶切圖。

具體實施例方式 下面結合附圖，通過實施例對本發明作進一步地描述。
實施例 一種豬產仔數性狀的分子標記方法的具體操作方法如下 (1)采集耳組織樣 在仔豬出生當天，用豬耳號鉗采取豬的耳緣組織0.2克左右，放入1.5ml的離心管中，倒入75％的酒精1ml左右，然后放入-20℃冰箱保存待用。
(2)基因組DNA提取 從冰箱中取出耳緣組織，用剪刀將其剪碎，倒入DAN組織提取液600ul，其DNA組織提取液配方見表1，提取液現用現配。然后放入55℃溫浴12小時，然后加入Tris飽和酚600ul，上下搖動混勻15分鐘，用低溫高速離心機離心10分鐘，離心機轉速要求12000轉/分鐘；用1ml移液器取出上清液至已滅菌的1.5ml離心管中，再加入等體積的Tris飽和酚，再上下搖動混勻15分鐘，再離心10分鐘(12000轉/分鐘)；取上清液，加入等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混勻10分鐘，離心10分鐘(12000轉/分鐘)。取上清液加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻10分鐘，離心10分鐘(12000轉/分鐘)。取上清液加入2倍體積的冰乙醇(約1ml)，再加1/10體積的約60μl的NaAc(醋酸鈉)水平搖動，可見絮狀、白色DNA樣品出現。將樣品置于-20℃冷凍30分鐘，取出或挑出DNA或離心(12000轉/分鐘)10分鐘，DNA沉于管底。用75％乙醇洗滌DNA，搖動洗滌后，離心5-10(12000轉/分鐘)。棄去75％的乙醇，自然干燥后，加入適量(約50μl)TE溶解，放-20℃冰箱中保存。
表1DNA組織提取液配方(總體積200ml) (3)引物設計 用Primer 5.0軟件對豬的SHBG基因第6外顯子兩端設計1對引物，引物序列見表2。
表2SHBG基因第6外顯子引物序列
(4)聚合酶鏈式反應(PCR) 25ul聚合酶鏈式反應體系，由4×dNTP2.5mmol/l脫氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/ul Taq聚合酶0.4ul、濃度為50ng/ul的DNA基因組模板溶液2ul、含20mmol/l MgCl2的10×聚合酶鏈式反應(PCR)緩沖液2.5ul，加水17.1ul至終體積25ul；并混合均勻。
聚合酶鏈式反應儀器的反應條件 ①94℃預變性4分鐘； ②94℃變性30秒； ③退火溫度63℃30秒； ④72℃延伸30秒； ⑤重復第②～④步驟35個循環； ⑥72℃延伸7分鐘，最后降溫至4℃保存。
經以上反應得到SHBG基因的體外擴增產物，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。SHBG基因擴增片段長度為217bp；見圖1。由圖1看出沒有非特異性擴增產物，可以進行下一步分析。
(5)單鏈構象多態性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析 取4ulPCR產物與變性緩沖液(1ml變性緩沖液中含去離子甲酰胺980uL、0.5M的EDTA20uL，溴酚藍25mg)混勻置于聚合酶鏈式反應(PCR)管中，在98℃下變性10分鐘，立即放冰浴5分鐘，取出后立即上樣于12％非變性聚丙烯酰胺凝膠孔中，室溫下電壓120V電泳13小時，銀染顯色，利用凝膠成像系統進行帶型分析。見圖2，由圖2可知該位點存在3種基因型，即AA型、GG型和AG型。
(6)擴增產物的測序 對第(5)步的單鏈構象多態性檢測(SSCP)分型后的兩種純合基因型，即AA型和GG型個體的PCR擴增產物進行回收純化，并進行克隆，進行正反向測序，進一步驗證電泳分型結果。然后將測得含突變位點的序列與GenBank中12號染色體和GQ478019序列進行同源性比對分析，分析發現外顯子6的第17位發生了一個堿基A→G的突變，該突變導致了一個谷氨酰胺(Gln)被精氨酸(Arg)替換，即產生了錯義突變，使野生型性激素結合球蛋白該位點的谷氨酰胺(Gln)突變為精氨酸(Arg)，造成性激素結合球蛋白的一級結構的改變，變為突變體。如圖3，左端第1個堿基為外顯子6第1堿基。
(7)多態位點的限制性片段酶切多態性(RLFP)檢測方法的建立 由于第6外顯子第17位堿基的突變(A突變為G)導致了一個限制性內切酶Aval的酶切多態性位點，具體酶切步驟是取該基因的擴增產物10ul于聚合酶鏈式反應(PCR)管中，分別加入濃度為10U/ul的AvaI限制性內切酶1ul，Aval限制性內切酶緩沖液2ul，加水7ul，混勻后入于37℃環境下反應3小時，后用12％聚丙烯酰胺凝膠，常溫，120V電壓電泳2小時，將凝膠置于凝膠成像系統下觀測，其Aval限制性內切酶酶切結果，見圖4，豬的性激素結合球蛋白SHBG基因第6外顯子Aval限制性內切酶酶切圖其中第5泳道條帶為AA型，第8泳道條帶為GG型，第1、2、3、4、6、7、9、10、11、12泳道條帶為AG型。
權利要求
1.一種豬產仔數性狀的分子標記方法，其特征在于包括以下操作步驟
(1)采集耳組織樣
在仔豬出生當天，采取豬的耳緣組織；
(2)基因組DNA提取
從豬的耳緣組織中提取豬的基因組DNA；
(3)引物設計
在豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子兩端設計1對引物，即上游引物和下游引物，其序列如下
上游引物TGGTCTGCTCTGTGTCCTTTTC，
下游引物GAGGTGGAGCCAAGAAGAGTTT；
(4)聚合酶鏈式反應
A、配制聚合酶鏈式反應體系
由4×dNTP2.5mmol/l脫氧核苷三磷酸2ul、10mmol/ml上游引物和10mmol/ml下游引物各0.5ul、10U/μl Taq聚合酶0.4ul、濃度為50ng/ul豬的DNA基因組溶液2ul、含20mmol/l氯化鎂(MgCl2)的10×聚合酶鏈式反應(PCR)緩沖液2.5ul，加水17.1ul至終體積25ul；并混合均勻，制得25ul聚合酶鏈式反應體系；
B、聚合酶鏈式反應條件
將25μl聚合酶鏈式反應(PCR)體系放入聚合酶鏈式反應儀器，反應條件如下
①94℃預變性4分鐘，
②94℃變性30秒，
③退火溫度63℃30秒，
④72℃延伸30秒，
⑤重復第②～④步驟35個循環，
⑥72℃延伸7分鐘，最后降溫至4℃保存，得到豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產物；
(5)限制性內切酶酶切反應，多態位點限制性片段酶切多態性(RLFP)檢測
由于豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子第17位堿基由A突變為G，導致了一個Aval限制性內切酶的酶切多態性位點，具體酶切反應操作步驟是取豬性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子的體外擴增產物10ul于聚合酶鏈式反應(PCR)管中，分別加入10U/ul Aval限制性內切酶1ul，Aval限制性內切酶緩沖液2ul，加水7ul，混勻，溫度37℃反應3小時，得到酶切產物；
將酶切產物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳2小時，電泳條件常溫，電壓120V，得到含酶切產物的凝膠；將含酶切產物的凝膠置于凝膠成像系統下觀測基因型，GG型個體為產仔數性狀優良基因類型，選擇其中條帶為GG型的個體留種，可提高選留群體的產仔數。
全文摘要
本發明涉及一種豬產仔數性狀的分子標記方法。本發明方法包括豬基因組DNA的提取、性激素結合球蛋白(SHBG)基因第6外顯子引物設計、體外擴增和基因型檢測。本發明首次發現豬性激素結合球蛋白基因，發現第6外顯子的多態性與豬產仔數存在著顯著相關；并建立了檢測第6外顯子突變位點的限制性片段酶切多態性檢測方法。本發明方法可以用于豬的育種中產仔數性狀的輔助選擇，可實現種豬的早期選種，甚至在豬剛出生時就可準確地進行選留，大大縮短了世代間隔，加快選擇進程；該方法操作簡便，聚合酶鏈式反應過程中條件要求不高，擴增片段長度較短(217bp)，擴增較容易，提高了擴增效率及判斷基因型的準確性。
文檔編號C12Q1/68GK101768642SQ20101011724
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月3日 優先權日2010年3月3日
發明者李慶崗, 陶立, 劉林清 申請人:安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所