專利名稱：一種培育耐逆植物的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育耐逆植物的方法。
背景技術：
水資源短缺和土壤鹽漬化是全球農業生產面臨的嚴峻事實。由于旱災頻繁，我國 年平均受旱面積達3. 27億畝，隨著全球氣候變暖，旱災將日趨嚴重，受旱災威脅農田面積 可能超過7億畝。據估算，干旱、低溫和鹽堿等非生物脅迫對作物產量的影響達40%，我國 北方主要糧食產區每年因缺水造成減產700-800億公斤；季節性干旱在降水量豐富的南方 也頻繁發生，如廣東每年受旱面積超過750萬畝；四川省2006年作物受旱面積達2100萬 畝，占播種面積的35%，絕收397萬畝，造成直接經濟損失達61億元。水稻作為我國重要的 糧食作物，用水量占農業用水量的70%，因此水資源匱乏及干旱、低溫和鹽堿等非生物脅迫 已成為影響水稻高產穩產的重要限制因子。植物抗逆機制十分復雜，傳統的育種手段對于 作物的抗逆性改良雖有一定效果，但離人們期望的目標還有很大距離。通過生物技術培育 耐逆水稻品種是充分利用我國鹽堿地、緩解水資源短缺、保證水稻高產穩產最經濟和有效 的途徑，對保障農業可持續發展具有重要的現實意義。研究表明，植物受到干旱、低溫和鹽堿等非生物脅迫后，通過一系列復雜的信號轉 導并激活特定轉錄調控因子，再通過特定的順式作用元件，調控大量目標基因的表達，最終 提高植物的耐逆性。在提高作物對環境脅迫的分子育種中，傳統的單一抗性功能基因的轉 基因策略對農作物抗性的改良具有一定的局限性，而改良或增強一個關鍵的信號轉導途徑 中的組分，便可能同時調控多個下游抗性功能基因的表達，是提高作物抗逆性的更為有效 方法和途徑。

發明內容
本發明的目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發明提供的培育耐逆植物的方法，是將OsEILl蛋白的編碼基因導入出發植物 中，得到耐逆性高于所述出發植物的轉基因植物；所述OsEILl蛋白是如下(a)或(b)的蛋 白質(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。所述OsEILl蛋白的編碼基因可為如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC,0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與 mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆 貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子 (Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因 構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可 以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證 整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也 可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是 抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述OsEILl蛋白的編碼基因可通過pCAMBIA1301-0sEILl導入植物中；所述 pCAMBIAl301-OsEILl是在pCAMBIA 1301的多克隆位點插入所述OsEILl蛋白的編碼基因得 到的重組質粒。所述pCAMBIA1301-0sEILl具體可為在pCAMBIA 1301的BamH I和Pmac I 酶切位點之間插入所述OsEILl蛋白的編碼基因得到的重組質粒。所述耐逆植物可為耐非生物脅迫的植物。所述非生物脅迫可為干旱脅迫、低溫脅 迫(如4°C )等。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因導 入植物細胞，可獲得耐逆能力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有所述基因的表達 載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介 導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植 物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如苗木、花草等，如棉花、大豆、油菜、煙 草、百脈根、擬南芥、水稻(如日本晴水稻)、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。所述OsEILl蛋白或其編碼基因可應用于培育耐逆植物。本發明中構建了 OsEILl超表達載體并轉化水稻愈傷組織，獲得一系列超表達的轉基因水稻株系。過表達OsEILl能明顯地提高水稻幼苗對干旱和低溫脅迫的耐性，使植物 在遇到干旱和低溫等非生物脅迫時能正常生長，不致脅迫致死。本發明提供的方法可以提 高植物對非生物脅迫的耐逆性，具有廣闊的應用前景。


圖 1 為 pCAMBIAl301-OsEILl 的結構示意圖。
圖2為OsEILl超表達植物中OsEILl的表達水平分析結果。圖3為OsEILl超表達植物干旱脅迫前后的表型分析；A 培養兩周的幼苗；B 干旱 處理后的幼苗。圖4為OsEILl超表達植物低溫脅迫后的表型分析。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。“日本晴”中國農業科學院作物科學研究所，編號WD-10576。實施例1、OsEILl超表達植物的獲得和耐逆性鑒定一、OsEILl 超表達載體 pCAMBIA1301_0sEILl 的構建根據OsEILl 的核苷酸序列(GENBANK ACCESSION NUMBER :DQ153245)設計一對特 異性引物如下上游弓丨物5，-C GG !ggaixcl ATGATGGGAGGTGGTCTGG-3，；下游引物5，-TGCC|CACGT(j TCAGTAGTACCAATTCGAGC-3，。以梗稻 口口口 禾中"曰本 Hf" (Oryza sativa subsp. japonica cv. Nipponbare) 的cDNA為模板，用上述特異性引物進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，用限制性內切 酶BamHI和Pmac進行雙酶切，回收酶切產物；用限制性內切酶BamH I和Pmac I雙酶 切 pCAMBIAl301 (Cambia，GPO Box 3200，Canberra, ACT 2601，Australia),回收骨架 載體；將所述酶切產物和所述骨架載體進行連接，然后進行測序，測序結果表明，得到了 pCAMBIAl301-OsEILl (在 pCAMBIA 1301 的 35S CaMV 啟動子的下游，BamH I 和 Pmac I 酶切 位點之間插入了序列表的序列2所示的OsEILl)。pCAMBIAl301-OsEILl的結構圖見圖1。二、OsEILl超表達植物的獲得1、將 pCAMBIA1301-0sEILl 通過電轉化方法導入農桿菌 LBA4404 (http //www, cbs. knaw. nl/, NCCB bacteria/plasmids database, NCCB number2760)，HSJiiiH干胃。2、根癌農桿菌介導的OsEILl超表達水稻的獲得用步驟1的重組農桿菌菌液浸染“日本晴”水稻愈傷組織；將浸染的愈傷在無菌的 濾紙上吸干，再轉到共培養基上24°C暗培養2-4天；清洗的愈傷組織轉到含潮霉素的選擇 培養基上進行抗性篩選；經選擇后的抗性愈傷轉到預分化培養基培養7-10天后再轉到分 化培養基進行光照培養；待小苗長至2-4cm時轉到裝有生根培養基的試管中生長2-3周， 生長良好的小苗經2-3天的煉苗后便可移栽到溫室中(TciR )。得到3株陽性小苗(T1-8、 T2-UT1-6)。分別將小苗傳代，得到T1代。分別取2周的野生型水稻(日本晴)和1\代水稻幼苗，提取mRNA進行反轉 錄，獲得cDNA后通過熒光定量PCR技術分析水稻中OsEILl的表達水平(上游引物 5，-AGCACGGAGAACAAGCCAT-3，；下游引物5，-GTTGAAACCAGAGCCGAACC-3，)。將野生型水 稻中OsEILl的表達量作為1，Tl-8、T2-1、T1-6三個株系中OsEILl的表達水平如圖2所 示。結果表明Τ1-8、Τ2-1、Τ1-6均為OsEILl超表達植物，OsEILl的表達量是野生型水稻的2. 5-3. 8倍，表明該基因在轉基因水稻中的表達得到明顯的提高。三、OsEILl超表達植物對非生物脅迫的耐性T1代表示Ttl代自交產生的種子及由它所長成的植株。將3株陽性小苗(Τ1-8、Τ2-1、Τ1_6)的種子(T1代)使用潮霉素進行選擇萌發，萌 發3天后將幼苗轉至土壤后開展以下抗逆性功能分析；將野生型水稻(日本晴)的種子采 用相同處理，作為對照；每種植物取30個植株，試驗重復三次，結果取平均值。1、耐旱性鑒定對生長2周的水稻進行干旱處理(連續8天不澆水)，然后觀察水稻葉片。水稻干 旱處理前后的照片見圖3。在干旱8天后，野生型水稻的葉片全部萎焉；OsEILl超表達水稻 呈現出正常的生長狀態，葉片舒展。結果表明OsEILl提高了水稻的耐旱性。2、轉OsEILl基因植株對低溫耐性的鑒定對生長2周的水稻進行低溫處理(4°C處理2天)，觀察水稻葉片。水稻低溫處理 后的照片見圖4。4°C處理2天后，野生型水稻的葉片出現萎焉；OsEILl超表達水稻呈現出 正常的生長狀態。結果表明OsEILl提高了水稻對低溫的耐性。
權利要求
一種培育耐逆植物的方法，是將OsEIL1蛋白的編碼基因導入出發植物中，得到耐逆性高于所述出發植物的轉基因植物；所述OsEIL1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述OsEILl蛋白的編碼基因是如下1)或 2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述OsEILl蛋白的編碼基因通過 pCAMBIA1301-0sEILl 導入植物中；所述 pCAMBIA1301_0sEILl 是在 pCAMBIA 1301 的多克隆 位點插入所述OsEILl蛋白的編碼基因得到的重組質粒。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述pCAMBIA1301-0sEILl是在 PCAMBIA1301的BamH I和Pmac I酶切位點之間插入所述OsEILl蛋白的編碼基因得到的重 組質粒。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述耐逆植物為耐非生物脅迫 的植物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述非生物脅迫為干旱脅迫或低溫脅迫。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述低溫為4°C。
8.如權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述出發植物為雙子葉植物或 單子葉植物。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述出發植物為棉花、大豆、油菜、玉米、水 稻或煙草，優選日本晴水稻。
10.OsEILl蛋白或其編碼基因在培育耐逆植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種培育耐逆植物的方法。本發明提供的培育耐逆植物的方法，是將OsEIL1蛋白的編碼基因導入出發植物中，得到耐逆性高于出發植物的轉基因植物；所OsEIL1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。將OsEIL1蛋白的編碼基因導入植物，能明顯地提高植物對非生物脅迫的耐逆性(如干旱和低溫脅迫)，使植物在遇到非生物脅迫時能正常生長，不受脅迫致死。本發明提供的方法可以提高植物對非生物脅迫的耐逆性，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/29GK101831436SQ201010116830
公開日2010年9月15日 申請日期2010年3月2日 優先權日2010年3月2日
發明者萬麗云, 張執金, 張海文, 權瑞黨, 黃榮峰 申請人:中國農業科學院生物技術研究所