專利名稱：：鈣離子信號調節親環素配體基因caml作為豬肉質性狀的遺傳標記及應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于豬的分子標記制備
技術領域：
，具體涉及一個豬CAML基因的克隆和作為豬分子標記輔助選擇的領域，即利用位于該基因第1內含子插入/缺失突變的分子標記來預測豬生長、胴體和肉質生產性狀。
背景技術：
：傳統上，家畜改良計劃是基于一些可觀測的表型進行選擇的，而這些表型代表的是所有基因和環境的綜合效應。近些年采用傳統的育種方法做了持續不斷的努力，盡管也取得了一些進步，但是在產仔數，肉質性狀等許多性狀的改良上并未取得實質性的進步。造成這些困難的原因有很多，例如遺傳力低，產活仔數的遺傳力僅為0.09，而且，某些性狀如產仔數是限性的，在性成熟之前無法測量，因此需要至少一年時間，得到可以利用的數據需要較長的時間周期。應用分子遺傳學的方法例如SNP和微衛星等標記，可以克服這些生理上的限制。分子標記輔助選擇等分子技術的發展是基于遺傳標記信息，在出生后對某些性狀進行直接選擇提供了可能。相比表型信息，這種信息具有兩種優勢。第一是可以早期獲得數據，有利于縮短遺傳間隔，第二是可能提高選擇的準確性，在兩種性別中，通過對某個基因突變的直接選擇，也提高了選擇反應的準確性。能夠應用于分子標記輔助選擇的基因或標記必須對目標性狀具有較大的遺傳貢獻率，即主效基因或標記，因此尋找這些主效基因和與之緊密連鎖的分子標記成為分子標記輔助選擇的前提和基礎，也是當前和今后一段時間豬分子生物學領域的研究重點和急需解決的問題。目前已有多個位于功能基因內部的與生產性狀緊密連鎖的分子標記被發現。例如，與產仔數顯著相關的候選基因ESR，PRLR，RBP4，與生長性狀顯著相關的MC4R，與肉質性狀顯著相關的PRKAG3，與抗病能力顯著相關的FUT1，SLA,NRAMP，以及與被毛顏色顯著相關的KIT，MC1R。這些基因標記信息與傳統的表型信息一起，通過標記輔助選擇的方法，被積極的應用在生豬的商業生產中，給生豬產品的提高與促進帶來了很大的幫助。目前已有多個位于功能基因內部的與生產性狀緊密連鎖的分子標記被發現并申請專利。Gerbens等證實了位于豬6號染色體上肌肉組織特異候選基因心臟脂肪酸結合蛋白與豬中肌內脂肪含量和其它生產性狀的關系，該基因已被申請專利，其專利申請號為WO97/35878;另夕卜，Rothschild等發現了1印tin受體基因內與瘦肉率有關的分子標記，其專利中請號為U.S.Pat.Nos.5972621。CAML(calcium-modulatingcyclophilinligand)基因編碼一個親環素B結合蛋白，稱為鈣離子信號調節親環素配體(Bram,R.J，etal.，1995)。Clipstone,N.A.，andCrabtree,G.R.(1992)在JurkatTcells中的實驗中證明了CAML的過表達能造成calcineurin依賴的NFAT的激活。HollowayM.Petal(1998)認為CAML過表達誘導消耗細胞內鈣離子庫存儲，增加細胞質中鈣離子濃度。而鈣流入增加會使細胞質中濃度達到增強磷酸化酶calcineurin活性的閾值時，使NFAT去磷酸化后進入核內，作用于基因調控區。哺乳動物中，Calcineurin信號通路在調節骨骼肌纖維類型的轉化中起關鍵作用(Olsonandffilliams,2000；Parsonsetal.，2003)。NFAT家族是calcineurin的主要作用目標，影響快慢肌MyHC的表達水平(McCullaghetal.,2004)Calcineurin選擇性地慢肌或者氧化型肌纖維的啟動子具有上調作用，而抑制Calcineurin活性會導致慢肌向快肌轉化(Chin,Ε.Retal.1998)。根據所含的酶系及其活性特點，將肌纖維分為四種慢速氧化型肌纖維((I型)；快速氧化型((2a型)；快速酵解型(2b型)和中間型肌纖維(2x型)。2a型、2b型、2x型又統稱為II型肌纖維。已有的研究結果表明，I，IIa型纖維比例的增加和數量的增多有益于肉質偏好發展，而IIb型纖維增加會使肉質變劣。因此，CAML基因可能通過CaN/NFAT生物學通路對肌纖維類型轉化的調控，進而影響肉質的變化。目前已有人，小鼠，大鼠，牛，猩猩，犬的基因組結構、表達和功能研究報道，人CAML基因定位于5q23(Bram,R.J等，Thegeneforcalcium-modulatingcyclophilinIigand(CAMLG)islocatedonhumanchromosome5q23andasyntenicregionofmousechromosome13.Genomics31(2),257-260(1996))，包括兩個不同的轉錄本，cDNA序列全長為2203bp(GeneBank登錄號NM_001745)，有4個外顯子。但目前國內外對豬CAML基因的cDNA全長克隆、基因組結構分析以及多態性研究還是空白。
發明內容本發明的目的在于克隆豬CAML基因，尋找該基因的遺傳變異與豬生長、胴體和肉質生產性狀間的關系，為豬的標記輔助選擇提供遺傳標記。本發明提供了豬CAML基因的cDNA序列，其序列分別如SEQIDNO1所示。所獲得的CAML基因cDNA序列長度為1683bp，序列中包含891bp的開發閱讀框，74bp5’非翻譯區和718bp的3’非翻譯區。申請人:獲得了一種作為豬標記輔助選擇應用的與豬生產性狀相關的分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO11所示。在序列表SEQIDNO11所示序列的第283-592位堿基處有310個堿基缺失。檢測上述分子標記的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQIDNO9和10所示。申請人:提供了一種豬標記輔助選擇應用的與豬生產性狀相關的分子標記的制備方法，按照以下步驟用人CAML基因cDNA序列為信息探針，在豬的表達序列標簽(EST)數據庫中作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的EST;然后對EST進行拼接；根據拼接的序列設計設計三條正反向擴增引物獲得豬的cDNA序列，所述的三條正反向擴增引物序列如SEQIDNO3,4；SEQIDNO:5，6禾口SEQIDNO:7，8所示；所述的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所示；根據與人CAML基因的cDNA序列的比對結果大致得出豬CAML基因的編碼區序列，其編碼氨基酸對應的cDNA序列如SEQIDNO:2所示；提取豬血液中的DNA；利用設計的如SEQIDNO:9，10所示引物擴增豬CAML基因的整個編碼區序列，PCR產物回收，克隆，測序，將獲得的序列進行品種間的多序列比對，尋找分子標記，然后按照序列表SEQIDN09和10所示引物，擴增得到如序列表SEQIDNO11所示的序列。本發明制備的分子標記可在豬皮率，背最長肌pH值，股二頭肌色值和肌內水分性狀關聯分析中的應用。本發明的引物可在豬皮率，背最長肌PH值，股二頭肌色值和肌內水分性狀關聯分析中的應用。本發明提供了2頭梅山豬(中國地方豬血緣)和2頭大白豬(外來豬血緣)包括豬CAML基因第1內含子及第二外顯子的部分基因組核苷酸序列，通過這2個豬種的上述序列進行ClusterW比對提供了位于該擴增片段內部的變異，其突變位點如圖1所示。制備該基因片段的步驟如下選擇2頭大白豬和2頭梅山豬為試驗材料，從血液中提取DNA，根據豬CAML基因組DNA序列設計引物，其引物的序列如序列表SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示，進行PCR擴增，PCR產物純化、克隆測序、序列比較分析。更詳細的技術方案參見《具體實施方式》的內容。序列表SEQIDNO1是本發明克隆的豬CAML基因的cDNA序列(SEQIDNO1)；序列表SEQIDNO2是豬CAML基因的編碼的蛋白質序列(SEQIDNO2)；序列表SEQIDNO3是擴增豬CAML基因cDNA的正向引物序列(SEQIDNO3)；序列表SEQIDNO4是擴增豬CAML基因cDNA的反向引物序列(SEQIDNO4)；序列表SEQIDNO5是擴增豬CAML基因cDNA的正向引物序列(SEQIDNO5)；序列表SEQIDNO6是擴增豬CAML基因cDNA的反向引物序列(SEQIDNO6)；序列表SEQIDNO7是擴增豬CAML基因cDNA的正向引物序列5(SEQIDNO7)；序列表SEQIDNO:8是擴增豬CAML基因cDNA的反向引物序列6(SEQIDNO8)；序列表SEQIDNO9是實施豬CAML基因包括第一內含子及第二外顯子序列擴增的正向特異引物序列(SEQIDNO9)；序列表SEQIDNO10是實施豬CAML基因包括第一內含子及第二外顯子序列擴增的反向特異引物序列(SEQIDNO10)；序列表SEQIDNO.11是為豬CAML基因第1內含子中，在該序列的第283-592位堿基處有310個堿基插入或缺失突變(SEQIDNO:11，即本發明制備和用于關聯分析的遺傳標記的DNA序列)，序列長度為751bp。圖1不同豬種CAML基因序列比對結果和突變位點。(圖中DB1，DB2分別為實驗選取的兩頭“大白豬”(外來豬血緣)，Ml，M2為實驗中選取的兩頭“梅山豬”即中國地方豬血緣)。圖2豬CAML基因第一內含子插入/缺失多態的瓊脂糖凝膠電泳圖譜和分型結果。圖中泳道2-11代表序列表SEQIDNO:9和SEQIDNO10所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為751bp，441bp；泳道2，3，4為II基因型，泳道5，8，10，11為ID基因型，泳道6，7和9為DD基因型。根據本發明的方法可以用于開發成診斷方法或試劑盒，從而在育種計劃中利用這些方法來選擇攜帶有利等位基因的豬，可以達到較好的選擇效果。具體實施例方式實施例1豬CAML基因cDNA序列的制備豬CAML基因cDNA全長序列的制備需要首先合成cDNA第一鏈(該試劑盒購自美國Ferment公司)，利用成年“大白，，“梅山豬”的背最長肌組織總RNA合成cDNA第一鏈。以人CAML基因的cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標簽(EST)，拼接豬EST-重疊群。以該重疊群序列進行結構預測，發現該重疊群覆蓋了全部0RF，以及5’非翻譯區和3’非翻譯區，以該重疊群推測的氨基酸序列與其他物種作相似性比較時，發現豬的該蛋白序列與人，小鼠，大鼠，牛，猩猩，犬的相似性分別為91%，85%,82%,92%,91%,93%,這說明了分離CAML基因cDNA的準確性。我們以EST-重疊群為模板設計引物，引物序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>采用上述設計的三對引物，擴增了重疊群的序列，拼接后進行生物信息學預測，與上述重疊群的結果一致，且覆蓋了全部ORF和5’，3’非翻譯區。PCR反應體系為25μ1，其中模板雙鏈cDNA為lOOng，dNTPs濃度為10mmol/L，每條引物濃度為10mmol/L，2U的TaqDNA聚合酶，加去離子水至總體積25μ1。PCR反應程序94°C預變性4min；然后94°C變性50s、57°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸lOmin。PCR產物經純化(按照上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書操作)、克隆后，進行序列測定，序列測定由上北京奧科生物技術公司完成，將測序所得到的序列與EST-重疊群進行序列拼接獲得豬CAML基因的全長cDNA序列(見SEQIDNO:1)。實施例2基因片段的獲得及多態性檢測方法的建立選擇2頭“大白豬”和2頭“梅山豬”，根據人CAML基因的基因組結構和通過實施例1獲得的豬CAML基因的cDNA序列為試驗材料，設計了以下引物，引物序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>用該引物在2頭“大白豬”和2頭“梅山豬”基因組DNA中進行PCR擴增。PCR反應體系為25μ1，其中模板DNA為50ng，dNTPs濃度為10mmol/L，每條引物濃度為IOmmol/L，IU的TaqDNA聚合酶，加去離子水至總體積25μ1。PCR反應程序94°C預變性4min；然后94°C變性50s、58°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸lOmin。不同豬種的PCR產物經純化(按照上海生工生物工程技術有限公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明書操作)、克隆后，進行序列測定，序列測定由上海生工生物工程技術有限公司完成。上述擴增片段共存在較大的片段缺失。據此，設計了以下引物，引物序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>PCR反應體系為25μ1，其中DNA為50ng，dNTPs濃度為10mmol/L，每條引物濃度為lOmmol/L，IU的TaqDNA聚合酶，加去離子水至總體積25μ1。PCR反應程序94°C預變性4min；然后94°C變性50s、58°C退火50s、72°C延伸lmin，共35個循環；最后72°C延伸IOmin0取5μ1PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并記錄分型結果。結果如圖2所示，發現只有兩個等位基因，較長的插入片段長度為751bp，我們定義為I(插入，insert,)等位基因，片段長度為441bp的是D(缺失，delete)等位基因，從而形成3種不同的基因型II、ID禾口DD0實施例3分子標記在不同豬群中的多態性分布在3個商品豬群(大白，長白和杜洛克_為外來血緣豬種)和6個中國地方豬種(梅山、淮南、八眉、通城、合作和二花臉)豬群中檢測豬CAML基因第二內含子插入/缺失多態性，檢測結果如表1所示。在所檢測的幾個豬群中D等位基因占絕對優勢，其中在杜洛克、梅山、鄂西以及鄖西豬中沒有發現I等位基因。表1豬CAML基因微衛星多態在不同豬群中基因型與基因型頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4分子標記在生產性狀中的應用為了確定豬CAML基因多態性與豬表型差異是否相關，選擇華中農業大學農業部豬遺傳育種重點實驗室組建的302頭大白X梅山F2代資源群體為試驗材料，采用實施例2所建立的微衛星分型方法進行多態性檢測，并分析豬CAML基因微衛星不同基因型與豬生產性狀的相關關系。采用SAS統計軟件(SASInstitutelnc,Version8.0)GLM程序進行單標記方差分析，同時采用REG程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗，所采用模型為Yijkl=μ+Gi+Fj+Sk+A+b^Xi^+ei^Yij為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(包括基因加性效應和顯性效應；加性效應用1，0和-1分別代表II、ID和DD基因型，顯性效應用1，_1和1分別代表II、ID和DD基因型)；Sk、Y1,Fj為固定效應，分別為性另I」、年度、家系效應，biJkl為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數，胴體性狀以屠宰體重為協變量，肉質性狀以屠宰日齡為協變量，生長不考慮協變量；eukl為殘差效應。在所檢測的259頭大白豬X梅山豬F2代個體中，II基因型油18個，ID基因型有119個，DD基因型有165個。不同基因型與生產性狀間的統計分析結果總結于表2和3。從表2發現，豬CAML基因不同基因型在皮率上極顯著差異(P<0.01)，其他胴體性狀上不存在顯著性的相關關系。從表3可以得出，豬CAML基因不同基因型在背最長肌pH值性狀上存在顯著差異(P<0.05)，其他肉質性狀不存在顯著性的相關關系。該位點在背最長肌PH值，肌內水分主要以顯性效應為主，在股二頭肌色值以加性效應為主。表2豬CAML基因插入/缺失多態與胴體性狀的關聯分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注以上數值為最小二乘均值士標準誤；含有相同字母表示差異不顯著，小寫字母表示差異顯著，大寫字母表示差異極顯著；加性效應負值表示D等位基因降低性狀表型值廣表示ρ<0.05，**表示ρ<0.01(下表同)。表3豬CAML基因插入/缺失多態性與肉質性狀的關聯分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注以上數值為最小二乘均值士標準誤；含有相同字母表示差異不顯著，小寫字母表示差異顯著，大寫字母表示差異極顯著；加性效應負值表示D等位基因降低性狀表型值；*表示P<0.05，**表示P<0.01。權利要求一種作為豬標記輔助選擇應用的與豬肉質性狀相關的遺傳標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO11所示。2.如權利要求1所述的遺傳標記，其特征在于，序列表SEQIDN0:11所示序列的第283-592位堿基處有310個堿基缺失。3.檢測權利要求1所述遺傳標記的正、反向引物的DNA序列如序列表SEQIDNO9和10所示。4.一種豬標記輔助選擇應用的與豬肉質性狀相關的遺傳標記的制備方法，按照以下步驟用人CAML基因cDNA序列為信息探針，在豬的表達序列標簽(EST)數據庫中作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的EST；然后對EST進行拼接；根據拼接的序列設計設計三條正反向擴增引物獲得豬的cDNA序列，所述的三條正反向擴增引物序列如SEQIDNO:3，4；SEQIDNO:5，6禾口SEQIDNO:7，8所示；所述的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所示；根據與人CAML基因的cDNA序列的比對結果大致得出豬CAML基因的編碼區序列，其編碼氨基酸對應的cDNA序列如SEQIDNO2所示；提取豬血液中的DNA；利用設計的如SEQIDNO:9，10所示引物擴增豬CAML基因的整個編碼區序列，PCR產物回收，克隆，測序，將獲得的序列進行品種間的多序列比對，尋找分子標記，然后按照序列表SEQIDNO:9和10所示引物，擴增得到如序列表SEQIDNO11所示的序列。5.權利要求1或2所述的遺傳標記在豬皮率，背最長肌pH值，股二頭肌色值和肌內水分性狀關聯分析中的應用。6.權利要求3所述的引物在豬皮率，背最長肌pH值，股二頭肌色值和肌內水分性狀關聯分析中的應用。全文摘要本發明屬于豬的遺傳標記制備
技術領域：
，具體涉及一種與豬生長、胴體和肉質生產相關性狀的分子標記及其應用，所述的分子標記是從豬CAML基因的克隆得到的全長為751bp的DNA片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO11所示，在SEQIDNO11所示序列的283-593bp處有一段310bp的插入/缺失突變。其制備方法為從豬背膘組織中提取總RNA，反轉錄為cDNA，根據NCBI中的拼接序列設計引物擴增基因CAML全長cDNA；從豬血液中提取基因組DNA，設計引物，PCR擴增，PCR產物克隆、測序，序列比較分析，遺傳變異檢測，標記與性狀間相關性分析等。本發明公開了豬CAML基因的cDNA序列和對于第1內含子310bp插入/缺失分型的檢測技術，為豬的標記輔助選擇提供了新的遺傳標記。文檔編號C12N15/11GK101812522SQ201010145930公開日2010年8月25日申請日期2010年4月7日優先權日2010年4月7日發明者劉遠,李良良,熊遠著,王建華,雷明剛申請人:華中農業大學