專利名稱：利用畢赤酵母生產(chǎn)豬Gp96蛋白的方法及專用培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種利用畢赤酵母生產(chǎn)豬Gp96蛋白的方法
及專用培養(yǎng)基。
背景技術：
Gp96蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熱休克蛋白(Heat shork protein,HPS)HPS90家族的代表,是一類在生物進化中高度保守且廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)。Gp96具有高度寡聚結構，其同源寡聚化有利于結合肽段和發(fā)揮分子伴侶的功能參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運、 合成等過程、并可與細胞內(nèi)的其它蛋白質(zhì)結合；參與細胞的抗損傷、修復和熱耐受過程；加工提呈腫瘤抗原及維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等作用；對細胞的生長、發(fā)育、分化及死亡具有一定的調(diào)節(jié)作用。在Gp96N末端1-355片段之間有一段重要的氨基酸序列，能與抗原提呈細胞 (antigen presenting cells,APCs)結合,增加抗原肽的提呈,誘導抗原特異性的細胞毒性 T細胞淋巴反應(cytotoxic IympHocyte7CTL),因此這段序列具有充分的免疫活性,能夠激活免疫應答，被認為在疫苗制備及抗腫瘤免疫中具有很大的應用前景。有研究表明，Gp96在天然和獲得性免疫中均具有重要的作用。在獲得性免疫中，Gp96能與APCs的受體結合，通過抗原的交叉呈遞作用誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性的CTL免疫應答，增強CD8+T細胞清除病毒的能力；能通過刺激抗原呈遞細胞(DC)和T細胞產(chǎn)生各種細胞因子激活免疫系統(tǒng)。在天然免疫中，Gp96可與Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)結合,并且能非特異地激活抗原提成細胞，表達TNF- a、IL-12等細胞因子和上調(diào)⑶86、⑶80共刺激分子及MHC類分子，給 CTL提供一個促炎性細胞因子環(huán)境和共刺激分子，激發(fā)免疫應答；另外，Gp96還可特異結合并激活中性粒細胞(PMNs)和單核細胞，增強其吞噬作用，Gp96刺激的PMNs，特別是單核細胞，使之釋放大量的IL-8，IL-8作為一種強力PMNs趨化因子，能誘發(fā)PMNs的聚集。因此， Gp96在腫瘤發(fā)病學、治療、預防學以及疫苗研發(fā)中的意義已引起廣泛關注，成為近年來最活躍的研究領域。Thomas等用泡狀口炎病毒(VSV)模型在體外證實了 Gp96_肽復合物對⑶8+T淋巴細胞的激活作用。隨后，研究顯示在體外成功地構建了 Gp96-肽復合物，Gp96是TLRs非常重要的伴侶分子，在巨噬細胞的正常功能發(fā)揮中扮演重要的角色。Heikema等把含流感病毒核蛋白(NP)編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染倉鼠細胞，以Gp96制備物作為疫苗免疫小鼠，產(chǎn)生了針對 NP的細胞免疫應答，提示對于已知抗原，這是一個生產(chǎn)以Gp96為基礎的疫苗的很好方式。已經(jīng)有專利申請?zhí)?01010140598. 6，發(fā)明名稱為“豬用抗原呈遞蛋白及編碼基因與應用”，雖然涉及了利用畢赤酵母發(fā)酵表達，但是未對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化， 培養(yǎng)基中蛋白胨和酵母膏含量高，且需添加YNB，發(fā)酵成本較高；另外，因p. pastoris-x33 屬于MUT+型酵母，甲醇的添加量對于誘導外源蛋白的表達至關重要，而且甲醇過多，會導致發(fā)酵液溶氧量急劇下降，使菌體生長受到抑制，甚至造成菌體死亡；同時，因目的蛋白 Gp96屬于糖蛋白，其生物活性和糖基化息息相關，而發(fā)酵液的pH對糖基化程度有著重要影響。
因此，對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進行合理優(yōu)化，成為至關重要的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，由如下配比的7種物質(zhì)組成酵母膏蛋白胨生物素CaSO4 MgSO4 NH4CL 甲醇的配比為(O. 3-1.0) g (0.6-1. 5) g 4xl(T5g (O. 04-0. 08) g (O. 7-1. 4) g (O. 2-0. 5) g (O. 2-1. 5)ml。在上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述酵母膏蛋白胨生物素 (biotin) CaSO4 MgSO4 NH4CL 甲醇的配比為(O. 3 或 O. 5) g : (O. 6 或 I. O) g 4xl(T5g (O. 04、0· 06 或 O. 08)g (O. 7、I. O 或 I. 4) g (O. 2 或 O. 4) g : (O. 2,1. O 或 I. 5)ml ；上述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5. 5-6. 5。本發(fā)明的另一個目的是提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶質(zhì)由如下終濃度的7種物質(zhì)組成所述酵母膏在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 3%-1.0% (質(zhì)量百分含量)；所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 6%-I. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述生物素在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為4xl0_5% (質(zhì)量百分含量)；所述CaSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 04% -O. 08% (質(zhì)量百分含量)；所述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 7% -I. 4% (質(zhì)量百分含量)；所述NH4CL在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2% -O. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2% -I. 5% (體積百分含量)；所述溶劑為水。上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述酵母膏在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 3%或O. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 6%或1.0% (質(zhì)量百分含量)；所述生物素在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為4xl0_5% (質(zhì)量百分含量)；所述CaSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 04%,O. 06%或O. 08% (質(zhì)量百分含量)；所述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 7%、1.0%或I. 4% (質(zhì)量百分含
量);所述NH4CL在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2%或O. 4% (質(zhì)量百分含量)；所述甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為0.2^^1.0%或1.5% (體積百分含
量)O上述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5. 5-6. 5。本發(fā)明的第三個目的是提供上述第一個目的中發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將上述7種物質(zhì)按照上述配比混合，得到上述第一個目的的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的第四個目的是提供上述第二個目的的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將上述溶質(zhì)中的7種物質(zhì)均溶于水達到上述終濃度，得到上述第二個目的的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的第五個目的是提供一種制備Gp96N蛋白的方法。本發(fā)明提供的方法，為在上述的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌p. pastoris_X33/ pPICZ a A/Gp96N/12,收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到Gp96N蛋白；上述工程菌p. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12為將Gp96N蛋白的編碼基因通過重組載體導入P.pastoris-X33中得到的重組菌；上述重組載體為pPICZ a A/Gp96N,具體為將Gp96蛋白的編碼基因插入pPICZ a A 載體中Xho I和Xba I位點間得到的重組載體；上述Gp96N蛋白為豬Gp96N蛋白，其氨基酸序列為序列表中的序列I。在上述方法中，上述豬Gp96N蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；在上述方法中，上述發(fā)酵的溫度為28°C，所述發(fā)酵的時間為72h_80h ;所述發(fā)酵的 pH 為 6. 5。在上述方法中，在所述發(fā)酵中，還包括向所述發(fā)酵的體系中補加無水甲醇的步驟； 發(fā)酵的體系為發(fā)酵容器中的所有物質(zhì)。上述補加無水甲醇的方法依次包括如下步驟I)在自所述發(fā)酵開始第10h_14h，補加無水甲醇；2)在步驟I)后每12h_18h，再次補加無水甲醇至發(fā)酵結束。在上述方法中，步驟I)中，所述補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的 0.5% -1.5% (體積百分含量)。步驟2)中，所述再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系的總體積的 0.2% -1.0% (體積百分含量)。本發(fā)明的實驗證明，一方面，本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，降低了碳氮源的百分含量，降低了發(fā)酵成本；培養(yǎng)基中添加了常用的無機離子，不僅強化了工程菌對目的蛋白的表達途徑，提高了表達量，而且便于工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)；另一方面，本發(fā)明提供的發(fā)酵方法對在P. pastoris-X33表達外源蛋白中起至關重要作用的甲醇添加量、添加時間進行了優(yōu)化，極大的降低了甲醇添加量，避免了發(fā)酵后期因甲醇累積對菌體造成的毒害，降低了發(fā)酵成本，使整個發(fā)酵工藝更溫和環(huán)保，而且對發(fā)酵需要的PH進行了優(yōu)化，控制整個發(fā)酵周期的PH為6. 5，有利于豬Gp96N蛋白的糖基化和保持其生物活性，發(fā)酵周期為72_90h，縮短了發(fā)酵時間，提高了原料和設備的利用率。


圖I為豬Gp96N SDS電泳2 為豬 Gp96N ffestern-blot 檢測圖3為BCA蛋白定量標準曲線
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實施例中的培養(yǎng)基中組分濃度如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例I、p. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12 的發(fā)酵Up. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12 的制備DpPICZa A/Gp96N 的獲得Gp96N的氨基酸序列為序列表中的序列1，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。制備序列2，以下列引物進行PCR擴增Fl :5’ CATCTCGAGATGGAGGATGAAGTGGATGTGG,其中 CTCGAG 為 XhoI 酶切位點；F2 :5’ CATTCTAGATTAGTATTCATCATCTTCTACTTCCTTTG,其中 TCTAGA 為 XbaI 酶切位PCR 條件為94°C 4min ；94°C 50s,55°C 50s, 72°C Imin ；30 個循環(huán)；72°C IOmin0得到IOOObp的PCR擴增產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的載體 PPICZaA(購自美國Invitrogen公司，目錄號V195_20)連接，得到重組質(zhì)粒pPICZ a A/ Gp96N,經(jīng)過測序，該載體為將序列表中的序列2插入pPICZ a A的XhoI和XbaI酶切位點之間得到的載體，命名為pPICZ a A/Gp96N。2)重組工程菌的構建先用限制性內(nèi)切酶SacI單酶切重組質(zhì)粒pPICZ a A/Gp96N,得到線性化的質(zhì)粒，再將得到的線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入P. pastoris-X33感受態(tài)細胞(購自美國Invitrogen公司，貨號C1800-00)(電轉(zhuǎn)參數(shù)為1.51 、25 4 、200 0)，得到重組菌。提取重組菌的基因組DNA作為模板，引物為Fl和F2，進行PCR擴增，得到大小為 IOOObp左右的目標片段，PCR鑒定結果表明，序列表的序列2所示的豬Gp96N基因已整合到 p. pastoris-X33 的基因組中，將該重組菌命名為 p. pastoris_X33/pPICZ a A/Gp96/12。2、發(fā)酵I)活化以p.pastoris-X33/pPICZaA/Gp96/12為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面活化和種子培養(yǎng)后， 接種于BMGY培養(yǎng)基中，ρΗ6· O,經(jīng)200rpm、28°C搖床培養(yǎng)至OD600 = 2. O時，室溫(25°C )下 3000rpm離心5min收集濕菌體；2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基I的組分如下酵母膏(購自OXOID公司，貨號1^0021)0.3%、蛋白胨(購自OXOID公司，貨號LP0042)0.6%、biotin(生物素)(購自Sigma公司，貨號 G-4501)4xl0_5、CaSO4O. 04%, MgSO4O. 7%, NH4CLO. 2%、甲醇 O. 2% (體積百分含量)和水， 初始PH為6. O ;以invitrogen公司提供的BMMY培養(yǎng)基配方(I %酵母膏、2%蛋白胨、IOOmM磷酸鉀，I. 34% YNB、4xlO_5生物素、I %甘油或O. 5%甲醇，除甲醇是體積百分含量外，其他組分均為質(zhì)量百分含量)為對照發(fā)酵培養(yǎng)基甲，組分如下酵母膏2 %、蛋白胨I %、IOOmM磷酸鉀、YNB1. 34%，biotin (生物素)4xl0_5、甲醇O. 5% (體積百分含量)和水。分別用上述兩種培養(yǎng)基重懸濕菌體，相同條件下進行甲醇誘導發(fā)酵。用發(fā)酵培養(yǎng)基I重懸濕菌體后的發(fā)酵液命名為發(fā)酵液I。
用對照發(fā)酵培養(yǎng)基甲重懸濕菌體后的發(fā)酵液命名為發(fā)酵液甲。相同條件如下用IOOml的培養(yǎng)基在體積為500ml的三角瓶中重懸濕菌體，使得初始發(fā)酵體系中菌體0D_ = 1.0，六層紗布封口搖瓶，200印111、281搖床培養(yǎng)IOh后，向發(fā)酵體系中第一次補加O. 5ml的無水甲醇(補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的 O. 5% ), 200rpm、28°C繼續(xù)培養(yǎng),每隔16h后，向發(fā)酵體系中補加O. 5ml的無水甲醇(再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的O. 4% )，共發(fā)酵72h后，收集發(fā)酵液5000rpm 離心lOmin，收集上清。在發(fā)酵過程中，持續(xù)用氨水調(diào)節(jié)使pH值保持為6. 5。分別收集在第12h、28h、44h、60h、72h的發(fā)酵液1，離心后的上清液，經(jīng)過SDS電泳圖，結果如圖I所示，其中，泳道1-7分別為在12h、28h、44h、60h、72h的上清液，可以看出， 均得到約為55KD的目的產(chǎn)物，與預期的豬Gp96N的蛋白發(fā)生糖基化的大小一致，說明發(fā)酵產(chǎn)物的上清中得到豬Gp96N的蛋白。再進行Western-blot檢測(抗體為用豬Gp96N的蛋白為抗原免疫得到的多克隆抗體)，結果如圖2所示，其中，1-4分別為在12h、28h、44h、60h的上清液，可以看出，得到約 55KD的目的產(chǎn)物豬Gp96N的蛋白，進一步證明發(fā)酵產(chǎn)物的上清液中有豬Gp96N蛋白。3)檢測產(chǎn)量分別收集發(fā)酵液I和發(fā)酵液甲離心后的上清液，用PBS緩沖液(每ILPBS緩沖液中含 NaC18g、KC10. 2g, Na2HPO4 · 12H203. 58g,KH2PO4O. 24g、pH7. 2)4°C透析，再濃縮(截留分子量為55KD)至20ml，得到濃縮液I (純化的豬Gp96N)和對照濃縮液甲(純化的豬Gp96N)； 再通過BCA蛋白定量試劑盒(購自北京博邁德，貨號PP0101)檢測濃縮液I和對照濃縮液甲中豬Gp96N的蛋白濃度，BCA蛋白定量檢測的標準曲線為圖3(Y :蛋白濃度(μ g/ml) ；X 吸光值)所示。結果如下濃縮液I中豬Gp96N的蛋白濃度為20mg/ml，經(jīng)過換算，IOOmlp. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12的菌液表達目的蛋白400mg，即發(fā)酵液I的目的蛋白產(chǎn)量為4. Omg/ml發(fā)酵液；對照濃縮液甲中豬Gp96N的蛋白濃度為10mg/ml，經(jīng)過換算，IOOmlp. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12的菌液表達目的蛋白200mg，即對照發(fā)酵液甲的目的蛋白產(chǎn)量為2. Omg/ml發(fā)酵液。實施例2、p. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12 的發(fā)酵I)活化以由實施例I的I得到的p.pastoris-X33/pPICZaA/Gp96/12為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面活化和種子培養(yǎng)后，接種于BMGY培養(yǎng)基中，pH6. 0，經(jīng)200rpm、28°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 4.0 時，室溫下(25 °C ) 3000rpm離心5min收集濕菌體；2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基2的組分如下酵母膏O. 5%、蛋白胨1.0%、biOtin(生物素)4xl0_5、 CaSO4O. 06%、MgSO4L 0%、NH4CLO. 4%、甲醇 1.0% (體積百分含量)，初始 pH 為 5.5 ；用150ml發(fā)酵培養(yǎng)基2在體積為IL的三角瓶中重懸濕菌體，使得初始發(fā)酵體系中菌體0D_ = 2.0，六層紗布封口搖瓶，200印111、281搖床培養(yǎng)12h后，向發(fā)酵體系中第一次補加I. 5ml的無水甲醇(補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的1% )，200rpm、 28°C繼續(xù)培養(yǎng)，每隔16h后，向發(fā)酵體系中補加I. 5ml的無水甲醇(再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的O. 9 % )，共發(fā)酵80h后，收集發(fā)酵液2在5000rpm離心lOmin， 收集上清。在發(fā)酵過程中，持續(xù)用氨水調(diào)節(jié)使PH值保持為6. 5。對照組的發(fā)酵培養(yǎng)基(命名為發(fā)酵培養(yǎng)基乙)和發(fā)酵條件如下發(fā)酵培養(yǎng)基乙的組分為酵母膏O. 2%、蛋白胨O. 4%、biotin(生物素)4xl0_5、 CaSO4O. 06%、MgSO4L 0%、NH4CLO. 4%、甲醇 2. 0% (體積百分含量)，初始 pH 為 5.5 ；對照組發(fā)酵條件如下用150ml發(fā)酵培養(yǎng)基乙在體積為500L的三角瓶中重懸濕菌體，使得初始發(fā)酵體系中菌體0D_ = 2. O，六層紗布封口搖瓶，200rpm、28°C搖床培養(yǎng)14h 后，向發(fā)酵體系中第一次補加2.0ml的無水甲醇(補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的I. 3% )，200rpm、28°C繼續(xù)培養(yǎng)，每隔16h后，向發(fā)酵體系中補加2. Oml的無水甲醇(再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的1.3% )，共發(fā)酵80h后，收集發(fā)酵液乙5000rpm離心lOmin，收集上清。在發(fā)酵過程中，持續(xù)用氨水調(diào)節(jié)使pH值保持為6. 5。與實施例一的SDS電泳和Western-blot的方法相同，結果也無顯著差異。3)檢測產(chǎn)量分別收集發(fā)酵液2和發(fā)酵液乙的離心后上清液，用PBS緩沖液4°C透析，再濃縮 (截留分子量為55KD)至30ml，得到濃縮液2和對照濃縮液乙；再通過BCA蛋白定量試劑盒(北京博邁德)檢測濃縮液2和對照濃縮液乙中豬 Gp96N的蛋白濃度；結果如下濃縮液2中豬Gp96N的蛋白濃度為28mg/ml，經(jīng)過換算，150mlp. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12的菌液表達目的蛋白840mg，即發(fā)酵液2的目的蛋白產(chǎn)量為5. 6mg/ml發(fā)酵液。對照濃縮液乙中豬Gp96N的蛋白濃度為10mg/ml，經(jīng)過換算，150mlp. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12的菌液表達目的蛋白300mg，即對照發(fā)酵液乙的目的蛋白產(chǎn)量為2. Omg/ml發(fā)酵液。實施例3、p. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12 的發(fā)酵I)活化以由實施例I的I得到的p.pastoris-X33/pPICZaA/Gp96/12為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面活化和種子培養(yǎng)后，接種于BMGY培養(yǎng)基中，pH6. 0，經(jīng)200rpm、28°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 6.0 時，室溫下3000rpm離心5min收集濕菌體；2)發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基3的組分如下酵母膏0.3%、蛋白胨0.6%、1^0^11(生物素)4110_5、 CaSO4O. 08%, MgSO4L 4%, NH4CLO. 4%、甲醇 I. 5% (體積百分含量)，初始 pH 為 6. O ；用IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基3在體積為IL的三角瓶中重懸菌體，使得初始發(fā)酵體系中菌體0D_ = 3.0，六層紗布封口搖瓶，200rpm、28°C搖床培養(yǎng)14h后，向發(fā)酵體系中第一次補加 I. 5ml的無水甲醇(補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的I. 5% )，200rpm、28°C 繼續(xù)培養(yǎng)，每隔18h后，向發(fā)酵體系中補加I. Oml的無水甲醇(再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的O. 9% ),共發(fā)酵76h后，收集發(fā)酵液3在5000rpm離心IOmin,收集上清。在發(fā)酵過程中，持續(xù)用氨水調(diào)節(jié)使PH值保持為6. 5。對照組的發(fā)酵培養(yǎng)基(命名為發(fā)酵培養(yǎng)基丙)和發(fā)酵條件如下發(fā)酵培養(yǎng)基丙的組分為酵母膏O. 2%、蛋白胨O. 4%、biotin(生物素)4xl0_5、CaSO4O. 06 %、KCL0. 4 %、甲醇2. O % (體積百分含量)，初始pH為5. 5 ;對照組發(fā)酵條件如下用IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基丙在體積為500L的三角瓶中重懸菌體，使得初始發(fā)酵體系中菌體0D_ = 4.0，六層紗布封口搖瓶，200印111、281搖床培養(yǎng)14h 后，向發(fā)酵體系中第一次補加2.0ml的無水甲醇(再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的2. 0% )，200rpm、28°C繼續(xù)培養(yǎng)，每隔16h后，向發(fā)酵體系中補加2. Oml的無水甲醇(再次補加無水甲醇的量為占補加時發(fā)酵體系總體積的1.9% )，共發(fā)酵80h后，收集發(fā)酵液丙5000rpm離心lOmin，收集上清。在發(fā)酵過程中，不人為調(diào)節(jié)pH，保持發(fā)酵液自然pH值。。與實施例一的SDS電泳和Western-blot的方法相同，結果也無顯著差異。3)檢測產(chǎn)量分別收集發(fā)酵液3和發(fā)酵液丙的離心后上清液，用PBS緩沖液4°C透析，再濃縮 (截留分子量為55KD)至20ml，得到濃縮液3和對照濃縮液丙；再通過BCA蛋白定量試劑盒(北京博邁德)檢測濃縮液3和對照濃縮液丙中豬 Gp96N的蛋白濃度，
濃縮液3中豬Gp96N的蛋白濃度為30mg/ml，經(jīng)過換算，IOOmlp. a A/Gp96/12的菌液表達目的蛋白600mg，即發(fā)酵液3的目的蛋白產(chǎn)量結果如下
pastoris-X33/pPICZ 為6. Omg/ml發(fā)酵液；對照濃縮 pastoris-X33/pPICZ 為3. Omg/ml發(fā)酵液。
液甲中豬Gp96N的蛋白濃度 a A/Gp96/12的菌液表達目的蛋白
為 15mg/ml,經(jīng)過換算，IOOmlp. 300mg,即發(fā)酵液的目的蛋白產(chǎn)量
權利要求
1.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，由如下配比的7種物質(zhì)組成酵母膏蛋白胨生物素CaSO4 MgSO4 NH4CL 甲醇的配比為(O. 3-1. O) g (O. 6-1. 5) g、4xl(T5g、 (O. 04-0. 08) g (O. 7-1. 4)g (O. 2-0. 5) g (O. 2-1.5)ml。
2.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述酵母膏蛋白胨生物素CaSO4 MgSO4 NH4CL 甲醇的配比為(O. 3 或 O. 5) g : (0.6 或 1.0) g 4xl(T5g (O. 04、0· 06 或 O. 08)g (O. 7、I. O 或 I. 4) g (O. 2 或 O. 4) g : (O. 2,1. O 或 I. 5)ml ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為5. 5-6. 5。
3.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，由溶質(zhì)和溶劑組成,所述溶質(zhì)由如下終濃度的7種物質(zhì)組成所述酵母膏在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 3%-1.0% (質(zhì)量百分含量)；所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 6%-I. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述生物素在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為4xl0_5% (質(zhì)量百分含量)；所述CaSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 04% -O. 08% (質(zhì)量百分含量)；所述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 7^-1.4% (質(zhì)量百分含量)；所述NH4CL在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2% -O. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2% -I. 5% (體積百分含量)。
4.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述酵母膏在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 3%或O. 5% (質(zhì)量百分含量)；所述蛋白胨在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. % 6或1.0% (質(zhì)量百分含量)；所述生物素在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為4xl0_5% (質(zhì)量百分含量)；所述CaSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 04%、O. 06%或O. 08% (質(zhì)量百分含量);所述MgSO4在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 7%、1.0%或I. 4% (質(zhì)量百分含量)； 所述NH4CL在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2%或O. 4% (質(zhì)量百分含量)；所述甲醇在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為O. 2%、1.0%或I. 5% (體積百分含量)；所述溶劑為水。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為5.5-6. 5。
6.權利要求I或2所述的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟將所述7種物質(zhì)按照所述配比混合，得到所述培養(yǎng)基；或權利要求3-5中任一所述的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟將所述溶質(zhì)中的7種物質(zhì)均溶于水達到所述終濃度，得到所述培養(yǎng)基。
7.一種制備Gp96N蛋白的方法,為在權利要求1-5中任一所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌p. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到Gp96N蛋白；所述工程菌P. pastoris-X33/pPICZ a A/Gp96/12為將Gp96N蛋白的編碼基因通過重組載體導入P. pastoris_X33中得到的重組菌；所述重組載體為將Gp96N蛋白的編碼基因插入pPICZ a A載體中得到的重組載體； 所述Gp96N蛋白為豬Gp96N蛋白，所述豬Gp96N蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述豬Gp96N蛋白編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列2 ；所述發(fā)酵的溫度為28°C，所述發(fā)酵的時間為72h-80h ;所述發(fā)酵的pH為6. 5。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于在所述發(fā)酵中，還包括向所述發(fā)酵的體系中補加無水甲醇的步驟；所述補加無水甲醇的方法依次包括如下步驟1)在自所述發(fā)酵開始第10h-14h，補加無水甲醇；2)在步驟I)后每12h-18h，再次補加無水甲醇至發(fā)酵結束。
10.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于步驟I)中，所述補加無水甲醇的量為占所述發(fā)酵體系的總體積的O. 5% -I. 5%。步驟2)中，所述再次補加無水甲醇的量為占補加時所述發(fā)酵體系的總體積的O.2% -I. 0%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用畢赤酵母生產(chǎn)豬Gp96蛋白的方法及專用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，由如下配比的7種物質(zhì)組成酵母膏∶蛋白胨∶biotin∶CaSO4∶MgSO4∶NH4CL∶甲醇為(0.3-1.0)g∶(0.6-1.5)g、4x10-5g、(0.04-0.08)g∶(0.7-1.4)g∶(0.2-0.5)g∶(0.2-1.5)ml。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，降低了碳氮源的百分含量，降低了發(fā)酵成本；培養(yǎng)基中添加了常用的無機離子，不僅強化了工程菌對目的蛋白的表達途徑，提高了表達量，而且便于工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/84GK102586371SQ20121003746
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優(yōu)先權日2012年2月17日
發(fā)明者劉文軍, 賈曉娟, 陳才偉 申請人:中國科學院微生物研究所