專利名稱：一種酶法制備l-2-氨基丁酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，具體地說，涉及一種以L-蘇氨酸 為原料，用兩種酶結合反應制備L-2-氨基丁酸的方法。
背景技術：
2-氨基丁酸是抑制人體神經信息傳遞的天然氨基酸，也是一種重要的化工原料和 醫藥中間體，已廣泛應用于藥物合成，例如左乙拉西坦的合成(W0 03014080,2003)。左乙拉 西坦是一種新型抗癲癇藥，主要用于治療局限性及繼發性全身性癲癇，它的分子結構如圖 所示，其中藍色部分通常由L-2-氨基丁酸或S-2-氨基丁酰胺作為前體。
<formula>formula see original document page 3</formula>目前2-氨基丁酸的制備方法主要有化學法和生物法。化學法制備是比較經典的 方法，主要有化學法合成和化學法拆分，例如，奚強等(武漢工程大學學報，2007，29 (4) 15-17)以正丁酸、溴和氨水為原料合成了了 2-氨基丁酸；Soloshonok等在美國化學學會雜 志(Journal of the American Chemical Society, 2009,131 (21) :7208_7209)運用手性拆 分試劑與消旋的氨基丁酸形成非對映異構體進行拆分得到L-2-氨基丁酸。這些方法雖然 操作簡單，但或者反應條件苛刻，易生成副產物；或者需要昂貴的試劑，成本較高，同時大量 有機溶劑的使用還會造成環境污染。微生物發酵法是制備天然氨基酸的最傳統方法，例如，Toshihiro等(JP 2000279163,2000)利用高紅曲發酵制備2-氨基丁酸。微生物發酵法專屬性較強，條件溫 和，環境污染少，但存在反應產物成分復雜、分離繁瑣的缺點。酶催化轉化是一種高選擇性反應，不同種類的酶可作用于不同構型和不同種類 的特定底物，從而達到定向轉化的目的。目前酶法制備L-2-氨基丁酸主要有兩種，一 種是以2- 丁酮為原料，通過脫氫酶或者轉氨酶催化制備，例如，Shin等在生物技術通訊 (Biotechnology Letters, 2009, 31 (10) :1595_1599)用轉氨酶制備 L_2_氨基丁酸，Krix 等 在生物工程雜志(Journal of biotechnology 1997，53 :29_39)用亮氨酸脫氫酶催化2-丁 酮和氨基供體制備得到L-2-氨基丁酸；另一種是對消旋2-氨基丁酸進行酶法拆分，例如， 焦慶才等(CN101538596A)先用醋酐乙?；?-氨基丁酸，然后再用氨基酰化酶進行拆分。酶 催化制備方法效率高，專一性強，是一種較為理想藥物中間體制備方法，但目前酶催化工藝 能真正實現工業化的例子還不是很多，主要障礙還是目前的工藝收率偏低，成本較高，工藝 條件也不適合工業放大，因此建立一個高效、低成本，且易于工業化大生產的酶催化制備工 藝仍是值得探索的領域，在制藥工業上也有較好的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種高效、低成本，且易于工業化大生產的酶催化制備 L-2-氨基丁酸的方法，主要解決目前酶催化制備方法收率偏低，成本較高，工藝條件也不適 合工業放大的技術問題。本發明的技術方案為一種用酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用 L-蘇氨酸為起始原料，首先通過蘇氨酸脫氨酶使其轉化為2-酮丁酸，然后利用亮氨酸脫氫 酶使2-酮丁酸轉化生成L-2-氨基丁酸，反應中加入用于輔酶再生的甲酸脫氫酶。三種酶 的加入總量為0. 5 5g/L，底物L-蘇氨酸的加入量為10 100g/L，緩沖液為pH值7. 0 9. 0磷酸鹽液，調節反應液pH值所用的溶液為濃氨水，將反應液pH值調節為8. 0 8. 5 ；反 應溫度為15 40°C，優選的反應溫度為25 37°C;反應時間為3 48小時。所述的反應
為“一鍋煮”形式，即所有底物和酶同時加入開始反應，中間無需分離提純。反應式如下<formula>formula see original document page 4</formula>
本發明所提供的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法中，所使用的蘇氨酸脫氨酶來源 于E. coli K12，亮氨酸脫氫酶來源于球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus IFO 3525)，這 兩個酶均通過E. coli克隆表達得到，可通過發酵大量制備，是相對易得和廉價的催化劑。 所述的酶為經細胞破碎、冷凍干燥得到的凍干粉粗酶制劑。本發明的有益效果是本發明提供了一種利用微生物酶在溫和條件下制備 L-2-氨基丁酸的方法。與其它方法相比，本方法不但具有反應條件溫和、專一性強、便于定 向控制等諸多優點，而且以價格相對低廉的L-蘇氨酸為起始原料，以可大量生產的克隆表 達蛋白為催化劑，以“一鍋煮”的反應方式進行轉化，以結晶的方式進行產物分離，這些特點 使整個工藝成本較低，有利于大批量地工業制備。用該方法制備L-2-氨基丁酸，所得產物 的純度可達到98%以上，光學純度> 99%，適合在制藥工業上推廣應用。
具體實施例方式下面將通過實施例對本發明的技術內容作進一步的闡述，其目的是為更好理解本 發明的內容。因此，所舉之例并不限制本發明的保護范圍。實施例1在5ml反應瓶中依次加入20mg L-蘇氨酸，32mg甲酸銨(約2. 5倍當量)， 0. 2mgNAD+及2ml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. ΙΜ,ρΗ 7. 5)，用濃氨水將溶液pH值調至 7. 5，再加入Img蘇氨酸脫氨酶粗酶，2mg亮氨酸脫氫酶粗酶及2mg甲酸脫氫酶粗酶，在25°C 下磁力攪拌反應3小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率> 95% (C18柱；UV 200nm檢測；流 動相:20mM 磷酸鹽緩沖液(pH 3. 0)/ 乙腈=95/5，v/v)，ee 值> 99% (CR(+)柱；UV 200nm 檢測；流動相高氯酸水溶液(pH 1. 5))。實施例2在25ml三角瓶中依次加入50mg L-蘇氨酸，80mg甲酸銨(約2. 5倍當量)， 2. 5mgNAD+及5ml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. 1M，pH 8. 0)，用濃氨水將溶液pH值調至8. 0，再加入5mg蘇氨酸脫氨酶粗酶，IOmg亮氨酸脫氫酶粗酶及20mg甲酸脫氫酶粗酶，在 37°C下160rpm旋轉式搖床上反應20小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率> 99%，ee值> 99%。實施例3在25ml三角瓶中依次加入150mg L-蘇氨酸，480mg甲酸銨(約2. 5倍當量)， 2. 5mgNAD+及5ml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. 1M，pH 7. 0)，用濃氨水將溶液pH值調 至7. 0，再加入2. 5mg蘇氨酸脫氨酶粗酶，Img亮氨酸脫氫酶粗酶及5mg甲酸脫氫酶粗酶，在 30°C下160rpm旋轉式搖床上反應24小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率約為65%，ee值 > 99%。實施例4在50ml三角瓶中依次加入200mg L-蘇氨酸，320mg甲酸銨(約2. 5倍當量)， 2mgNAD+及IOml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. ΙΜ,ρΗ 8. 0)，用濃氨水將溶液pH值調至 8. 0，再加入2mg蘇氨酸脫氨酶粗酶，2mg亮氨酸脫氫酶粗酶及40mg甲酸脫氫酶粗酶，在室溫 (15°C )下160rpm旋轉式搖床上反應48小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率約為80%，ee 值> 99%。實施例5在50ml三角瓶中依次加入300mg L-蘇氨酸，960mg甲酸銨(約2. 5倍當量)， 5mgNAD+及IOml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. 1M，pH 8. 5)，用濃氨水將溶液pH值調 至8. 5，再加入2mg蘇氨酸脫氨酶粗酶，5mg亮氨酸脫氫酶粗酶及IOmg甲酸脫氫酶粗酶，在 30°C下160rpm旋轉式搖床上反應18小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率> 99%，ee值> 99%。實施例6在IOOml三角瓶中依次加入Ig L-蘇氨酸，1. 6g甲酸銨(約2. 5倍當量)，IOmgNAD+ 及30ml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. 1M，pH 8. 5)，用濃氨水將溶液pH值調至8. 5，再 加入IOmg蘇氨酸脫氨酶粗酶，IOmg亮氨酸脫氫酶粗酶及20mg甲酸脫氫酶粗酶，在30°C油 浴中磁力攪拌反應24小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率> 99%，ee值> 99%。將反應液升溫到70 80°C，加入硅藻土，過濾后減壓濃縮至3ml，冷卻結 晶，得到產物 0. 65g, ESI-MS m/z :104[M+H]+ 給出分子量為 103 ；1H-WR (D2O) δ /IO"6 0. 81 (3Η，-CH3)，1. 73 (2Η，-CH2-)，3. 54 (1Η，-CH-)驗證產物為 2-氨基丁酸，收率為 75 %，純 度> 98%，ee 值> 99%。實施例7在50ml三角瓶中依次加入Ig L-蘇氨酸，1. 6g甲酸銨(約2. 5倍當量)，5mg NAD+ 及IOml磷酸鹽緩沖液(Na2HP04/NaH2P04，0. 1M，pH 8. 5)，用濃氨水將溶液pH值調至8. 5，再 加入6mg蘇氨酸脫氨酶粗酶，20mg亮氨酸脫氫酶粗酶及20mg甲酸脫氫酶粗酶，在30°C油浴 中機械攪拌反應18小時后，取樣進行HPLC分析，轉化率> 99%，擾值> 99%。將反應液真空減壓除水，得到產物及鹽混合物約3g，不再進一步純化，直接用于制 備藥物中間體的下一步反應。
權利要求
一種酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用L-蘇氨酸為起始原料，首先通過蘇氨酸脫氨酶使其反應轉化為2-酮丁酸，然后利用亮氨酸脫氫酶使2-酮丁酸反應轉化生成L-2-氨基丁酸，反應中加入用于輔酶再生的甲酸脫氫酶。
2.根據權利要求1所述的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，三種酶的加入 總量為0. 5 5g/L，底物L-蘇氨酸的加入量為10 100g/L，反應時需加入pH值為7. 0 9. 0緩沖液，反應溫度為15 40°C，反應時間為3 48小時。
3.根據權利要求2所述的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，反應溫度為 25 37°C。
4.根據權利要求2所述的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的緩沖液 為磷酸鹽溶液，用濃氨水調節反應液pH值為8. 0 8. 5。
5.根據權利要求1所述的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的三種酶 為經細胞破碎、冷凍干燥得到的凍干粉粗酶制劑。
6.根據權利要求1所述的酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用“一鍋煮” 形式，即所有底物和酶同時加入開始反應，中間無需分離提純。
全文摘要
本發明公開了一種酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，主要解決目前酶催化制備方法收率偏低，成本較高，工藝條件也不適合工業放大的技術問題。本發明的技術方案為一種用酶法制備L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用L-蘇氨酸為起始原料，首先通過蘇氨酸脫氨酶使其轉化為2-酮丁酸，然后利用亮氨酸脫氫酶使2-酮丁酸轉化生成L-2-氨基丁酸，反應中加入用于輔酶再生的甲酸脫氫酶。本發明提供了一種高效、低成本，且易于工業化大生產的酶催化制備L-2-氨基丁酸的方法。
文檔編號C12P13/04GK101818178SQ201010146920
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者文軍, 曾聰明, ?？? 蘇金環, 陶軍華 申請人:尚科生物醫藥(上海)有限公司