本發明涉及一種高效合成α-氨基丁酸的單細胞工廠及其構建與應用，屬于微生物技術領域。
背景技術：
非天然α-氨基酸是區別于能夠由生物體自身合成的22種天然α-氨基酸的一大類氨基酸，它們具有重要的生物活性和生理作用，廣泛用于多肽、手性藥物以及生物堿等化合物的合成。α-氨基丁酸是抑制人體神經信息傳遞的非天然氨基酸，具有加強葡萄糖磷酸酯酶的活性，促進腦細胞代謝的作用。α-氨基丁酸也是一種重要的化工原料和醫藥中間體，已廣泛用于藥物的合成，如抗結核藥物鹽酸乙胺丁醇和抗癲癇藥物左乙拉西坦的合成，市場巨大。
α-氨基丁酸的合成方法主要包括化學合成法、酶拆分法及酶轉化法三種。其中化學法包括脫硫反應、氨化水解反應、丁酮酸還原法等，化學合成雖然操作簡單，但往往反應條件苛刻且易生成副產物，有時需要利用對環境有害的大量有機溶劑，如Jeffery E.A.等利用電化學法制備得α-氨基丁酸，產率僅有48％，同時存在副產物谷氨酸。相比之下，微生物法制備α-氨基丁酸具有特異性較強，條件溫和，對環境友好等優點。并且隨著基因工程技術的發展，構建重組微生物合成非天然氨基酸代謝途徑已經可以完成。目前，α-氨基丁酸的微生物法制備主要通過細胞外酶轉化法，包括對消旋α-氨基丁酸進行酶法拆分制備及以2-丁酮酸為原料通過脫氫酶或轉氨酶來催化制備。
在之前的研究中，發明人構建了以大宗化學品L-蘇氨酸為廉價底物，通過L-蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶及輔酶再生系統的酶體系進行一步法制備α-氨基丁酸。以酶轉化過程中發現L-蘇氨酸脫氨酶的量需要精確控制，不然會造成中間產物酮丁酸的積累，從而抑制了酮丁酸到α-氨基丁酸的轉化，造成了酶轉化生產α-氨基丁酸的中斷。同時，利用酶轉化體系去進行α-氨基丁酸的生產需要對產酶的三種重組菌進行細胞破碎，工藝繁瑣成本高昂，同時在轉化的過程中因酶的失活而影響了轉化的穩定性，另外因輔因子的損耗需要不斷地外源添加，進一步增加了α-氨基丁酸的生產成本。因此，有必要尋找一種高效穩定但成本低廉的制備α-氨基丁酸的方法。
技術實現要素：
為了解決上述問題，本發明提供了利用rbs序列優化控制L-蘇氨酸脫氨酶的表達量，同時將其與L-氨基酸脫氫酶及提供輔因子NADH循環的脫氫酶串聯到質粒上并在大腸桿菌中的表達，構建成重組大腸桿菌單細胞工廠，利用該單細胞工廠進行全細胞轉化高效制備α-氨基丁酸的方法。
本發明構建了能高效合成α-氨基丁酸的單細胞工廠，主要通過利用rbs優化控制L-蘇氨酸脫氨酶(ltd)在重組菌中的表達量，以達到控制中間產物酮酸的積累量，同時利用啟動子以及rbs序列進行優化來控制提供輔因子NADH循環的脫氫酶表達量從而控制輔因子NADH的生成速率，最后將不同rbs強度的L-蘇氨酸脫氨酶與L-氨基酸脫氫酶基因及經過啟動子以及rbs序列優化后的提供輔因子NADH循環的脫氫酶構建在大腸桿菌表達系統中的重組共表達載體，并將其轉化到大腸桿菌E.coli BL21中，成功構建了不同的基因工程菌單細胞工廠。在不添加任何外源輔因子的條件下，利用這些單細胞工廠進行全細胞轉化法對廉價底物L-蘇氨酸進行轉化高效制備α-氨基丁酸，為α-氨基丁酸的工業化生產提供了一種實際有效策略。
本發明的第一個目的是提供一種高效合成α-氨基丁酸的重組菌單細胞工廠，所述重組菌單細胞工廠是將重組共表達載體轉化到宿主菌中得到的；所述重組共表達載體是在質粒載體上串聯L-蘇氨酸脫氨酶基因、L-氨基酸脫氫酶基因、提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因；其中，以L-氨基酸脫氫酶基因的表達為基準，控制供輔因子NADH循環的脫氫酶的表達量使輔因子NADH的生成速率處于相對較高的水平，控制L-蘇氨酸脫氨酶的表達量處于相對較合適的水平。
所述的重組菌單細胞工廠能得到較優的從L-蘇氨酸到中間產物酮丁酸及從酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率，不會造成中間產物酮丁酸的積累因而不會造成對反應的抑制。同時所述的重組菌單細胞工廠不需要外源添加輔因子，相比于其他方法減少了底物進出細胞或擴散的路徑從而增加了轉化速率。
在一種實施方式中，所述控制，是通過但不限于，啟動子以及rbs序列優化，也可以是增強子、終止子、沉默子優化等。
在一種實施方式中，所述控制是通過啟動子和/或rbs序列優化來進行。
所述重組菌單細胞工廠的構建方法，包括：
(1)根據啟動子及L-蘇氨酸脫氨酶的基因序列，設計不同強度的rbs序列用來控制L-蘇氨酸脫氨酶的表達量從而控制L-蘇氨酸到酮丁酸的轉化速率；
(2)對輔因子NADH的供應速率進行了調控，主要是對啟動子以及rbs序列進行優化來控制提供輔因子NADH循環的脫氫酶表達量從而控制輔因子NADH的再生速率；
(3)將rbs優化后的L-蘇氨酸脫氨酶基因、L-氨基酸脫氫酶基因、啟動子以及rbs優化后的提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因按順序連接，構建重組共表達載體，并將重組共表達載體轉化宿主菌中，構建基因工程菌單細胞工廠。
在一種實施方式中，所述L-蘇氨酸脫氨酶基因前有質粒載體自身攜帶的啟動子、針對L-蘇氨酸脫氨酶基因和質粒載體設計的表達強度低于質粒載體本身rbs的rbs序列；所述L-蘇氨酸脫氨酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因之間通過質粒載體自身攜帶的rbs連接；所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因前有針對提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因和質粒載體設計的啟動子、表達強度高于或等于質粒載體本身rbs的rbs序列。
在一種實施方式中，所述宿主菌可以是大腸桿菌，也可以是其他宿主，比如枯草芽孢桿菌、棒桿菌、酵母等。
在一種實施方式中，所述宿主菌為E.coli BL21。
在一種實施方式中，所述質粒載體可以是任意一種可商業化購買的質粒載體，或者是任意一種已有報道的經改造的質粒載體。
在一種實施方式中，所述L-蘇氨酸脫氨酶選自但不限于大腸桿菌來源的L-蘇氨酸脫氨酶(核苷酸序列是NCBI上Gene ID:948287)。
在一種實施方式中，所述L-氨基酸脫氫酶選自：但不限于，芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶(NCBI上Gene ID:1206507)、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶(NCBI上Gene ID:936557)、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶(NCBI上Gene ID:1099526)、紅球菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶(NCBI上Gene ID:4219741)。
在一種實施方式中，所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶選自：但不限于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶(NCBI上GenBank:KM454879.1)、枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶(NCBI上GeneID:938261)、惡臭假單胞桿菌的葡萄糖脫氫酶(NCBI上Gene ID:1045820)。
在一種實施方式中，所述rbs序列，可以是不同強度的rbs序列。
在一種實施方式中，所述L-蘇氨酸脫氨酶基因前的啟動子或rbs序列，可以是針對不同表達系統進行優化得到的。
在一種實施方式中，所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因前的啟動子或rbs序列，也可以是針對不同表達系統進行優化得到的。
在一種實施方式中，所述表達系統包括但不限于大腸桿菌表達系統，也可以是枯草芽孢桿菌表達系統、棒桿菌表達系統、酵母表達體系等。
在一種實施方式中，所述宿主為大腸桿菌；所述L-蘇氨酸脫氨酶基因前的啟動子為T7啟動子；L-蘇氨酸脫氨酶基因前直接連接的rbs序列為序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列中的任意一種；所述L-蘇氨酸脫氨酶基因和L-氨基酸脫氫酶基因通過序列為SEQ ID NO:22所示序列的RBS連接。
在一種實施方式中，所述提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因前的啟動子為tac啟動子，rbs序列為SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39中的任意一種。可選地，rbs序列為SEQ ID NO:37的序列。
在一種實施方式中，所述重組共表達載體是在質粒載體pET-28a的基礎上構建得到的；L-蘇氨酸脫氨酶基因和L-氨基酸脫氫酶基因通過pET-28a自身攜帶的rbs直接連接。
本發明的第二個目的是提供一種發酵合成α-氨基丁酸的方法，是利用本發明的重組菌單細胞工廠。
在一種實施方式中，所述方法，是將重組菌單細胞工廠活化后轉接于發酵培養基中，IPTG誘導表達或直接表達重組蛋白，離心收集菌體，然后利用菌體全細胞轉化生產α-氨基丁酸。
在一種實施方式中，發酵培養基中具備微生物生長所需的營養成分，即碳源、氮源、無機鹽、生長因子等；碳源包括葡萄糖、甘油等；氮源主要有酵母膏、蛋白胨等，以及磷酸鹽(磷源)和硫酸鹽(硫源)等；另外，培養基中還可以適量加入金屬離子。
在一種實施方式中，所述發酵培養基為TB培養基、TY培養基、TYG培養基或者GP培養基。
在一種實施方式中，所述全細胞轉化是將獲得的菌體洗滌后，再加入pH 7.5的50mM PB緩沖液重懸，然后于30℃下加入底物L-蘇氨酸及甲酸或甲酸鹽或葡萄糖，以20％甲酸或1M鹽酸及5M氨水控制pH在7.5左右。
本發明還要求保護所述的重組菌單細胞工廠應用于α-氨基丁酸、酮丁酸或其相關附屬產物的合成。
本發明的有益效果：
α-氨基丁酸一種重要的化工原料和醫藥中間體，被廣泛用于藥物的合成如抗結核藥物鹽酸乙胺丁醇和抗癲癇藥物左乙拉西坦的合成。本發明首次構建了重組L-蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶及提供輔因子NADH循環的脫氫酶的單細胞工廠，利用rbs序列優化控制L-蘇氨酸脫氨酶的表達量，可以有效控制作為轉化過程中中間產物酮丁酸的積累量，因為一定量的酮丁酸會抑制轉化過程的進行，同時利用啟動子及rbs序列優化控制了提供輔因子NADH的脫氫酶表達量，優化了輔因子NADH的再生速率，最后將其與高效的氨基酸脫氫酶串聯到質粒上并分別在大腸桿菌表達體系中的表達，構建了重組菌單細胞工廠，利用該單細胞工廠進行全細胞轉化高效制備α-氨基丁酸。利用該單細胞工廠對L-蘇氨酸進行全細胞轉化為α-氨基丁酸，轉化過程操作簡單、重組菌培養成本低廉，且轉化過程中不需要添加任何輔因子，轉化批次穩定無中斷現象，在提高轉化效率的同時降低了成本，具有重要的工業應用價值。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做詳細的說明，以下實施例不對本發明產生限制。
實施例1：L-蘇氨酸脫氨酶的rbs序列優化及重組L-蘇氨酸脫氨酶大腸桿菌的構建
[1]將來源于大腸桿菌L-蘇氨酸脫氨酶基因ltd序列結合T7啟動子針對其在大腸桿菌中的表達量設計了不同表達強度的rbs序列，然后送至上海生工生物進行基因合成。PCR引物包括含有不同表達強度的rbs序列(用下劃線加粗表示，序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示)的引物rbs1、rbs2、rbs3、rbs4、rbs5、rbs6及L-蘇氨酸脫氨酶基因的末端引物ltdR(序列如SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:13)。
ltdR：5’-CGGGATCCTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3’(BamH I)
[2]以含有不同表達強度的rbs序列的引物、末端引物ltdR組成引物對，利用大腸桿菌的染色體DNA作為模板，進行PCR擴增，即可得到能夠表達出不同表達量的L-蘇氨酸脫氨酶的核苷酸序列。比如，以rbs1、ltdR為引物進行擴增，即可得到一段核苷酸片段，這段核苷酸片段含有L-蘇氨酸脫氨酶基因且L-蘇氨酸脫氨酶基因前直接連接有一段rbs序列。
[3]將上一步得到的能夠表達出不同表達量的L-蘇氨酸脫氨酶的核苷酸片段分別連接到質粒載體pET-28a上(分別用Xba I和BamHI進行雙酶切，然后連接)，得到6個重組質粒pET-28a-rbs1-ltd、pET-28a-rbs2-ltd、pET-28a-rbs3-ltd、pET-28a-rbs4-ltd、pET-28a-rbs5-ltd、pET-28a-rbs6-ltd，將重組質粒轉化到感受態E.coli BL21，篩選正確的轉化子，即得到重組L-蘇氨酸脫氨酶大腸桿菌。
[4]將[3]中所構建好的重組L-蘇氨酸脫氨酶大腸桿菌利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于100ml的LB基中。接種量1％，培養溫度37℃，搖床轉速160r/min。培養至OD600約0.6～0.8時加入終濃度為1mM的IPTG，置于16℃搖床24h誘導表達。對L-蘇氨酸脫氨酶的酶活力進行測試，取培養好的菌液，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用100mL pH 7.0的50mM PB緩沖液洗滌二次，將重組大腸桿菌重懸于10mL的50mM PB緩沖液中。將懸浮好的細胞放入超聲波細胞破碎儀中進行細胞破碎，破1s，停3s，300W的功率工作時間10min。取破碎液于離心機內4℃，10000r/min離心30min去除沉淀，測定上清液酶活。
[5]L-蘇氨酸脫氨酶酶活測定方法：利用0.1M的pH 7.5的PB緩沖液來配制40mM的蘇氨酸底物溶液。將0.96mL的底物緩沖液加入到比色皿中，再加入40μL的酶液并立即混勻。通過計算酶反應液在230nm紫外光下吸光值的變化去測定酮丁酸濃度的變化，然后與酮丁酸的標準曲線對照得出酮丁酸的濃度變化值。酶活的定義為：每分鐘產生的1μmol的α-酮丁酸所需的酶量。
[6]結果顯示重組L-蘇氨酸脫氨酶大腸桿菌pET-28a-rbs1-ltd/BL21、pET-28a-rbs2-ltd/BL21、pET-28a-rbs3-ltd/BL21、pET-28a-rbs4-ltd/BL21、pET-28a-rbs5-ltd/BL21及pET-28a-rbs6-ltd/BL21在LB培養基中所誘導出的酶活分別為0.13U/mL、0.34U/mL、0.72U/mL、2.56U/mL、4.89U/mL、11.6U/mL。
實施例2：共表達L-蘇氨酸脫氨酶和L-氨基酸脫氫酶的重組質粒和重組菌的構建
[1]以蠟樣芽孢桿菌、紅球菌、枯草芽孢桿菌及天藍色鏈霉菌的基因組DNA作為模板。
[2]根據L-氨基酸脫氫酶基因序列和pET-28a質粒上的酶切位點設計L-氨基酸脫氫酶基因引物，包括蠟樣芽孢桿菌的L-亮氨酸脫氫酶基因Bcldh(引物為PBcldhF、PBcldhR)、紅球菌的L-苯丙氨酸脫氫酶基因Rjpdh(引物為PRjpdhF、PRjpdhR)、枯草芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶基因Bsadh(引物為PBsadhF、PBsadhR)、天藍色鏈霉菌的纈氨酸脫氫酶基因Scvdh(引物為PScvdhF、PScvdhR)。引物序列如下(如SEQ ID NO:14～SEQ ID NO:21)：
PBcldhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH I)
PBcldhR：5’-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATAT C-3’(Sac I)
PRjpdhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGACTCTCACCGCGGAAC-3’(BamH I)
PRjpdhR：5’-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3’(Sac I)
PBsadhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGATCATAGGGGTTCCT-3’(BamH I)
PBsadhR：5’-CGAGCTCTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’(Sac I)
PScvdhF：5’-CGGGATCCAAGGAGATATACATGGTGACCGACGTAAACGG-3’(BamH I)
PScvdhR：5’-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3’(Sac I)
其中下劃線為pET-28a質粒載體上本身攜帶的rbs序列；引物命名方式：P+菌株種屬首字母+基因名稱+引物方向，即PBcldhF代表用于擴增來源于蠟樣芽孢桿菌的ldh基因的上游引物。
[3]分別以蠟樣芽孢桿菌、紅球菌、枯草芽孢桿菌及天藍色鏈霉菌的基因組DNA作為模板，利用上述對應的引物進行PCR擴增，得到含有L-氨基酸脫氫酶基因的核苷酸片段且該基因前直接連接有pET-28a質粒載體上本身攜帶的rbs序列AAGGAG(序列如SEQ ID NO:22所示)。
[4]將上一步得到的多個含有L-氨基酸脫氫酶基因的核苷酸片段與實施例1構建的重組質粒pET-28a-rbs1-ltd、pET-28a-rbs2-ltd、pET-28a-rbs3-ltd、pET-28a-rbs4-ltd、pET-28a-rbs5-ltd、pET-28a-rbs6-ltd連接(核苷酸片段與質粒分別用BamHI和Sac I進行雙酶切，然后連接)，得到能夠共表達L-蘇氨酸脫氨酶和L-氨基酸脫氫酶的重組質粒pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh等，然后將重組質粒轉化到感受態E.coli BL21，篩選正確的轉化子，即得到共表達L-蘇氨酸脫氨酶和L-氨基酸脫氫酶的重組菌。
實施例3：提供輔因子NADH循環的脫氫酶重組大腸桿菌的構建及甲酸脫氫酶的啟動子及rbs序列優化的重組大腸桿菌的構建
[1]根據不同來源的提供輔因子NADH循環的脫氫酶的基因序列及串聯到pET-28a質粒上的酶切位點設計引物，其中包括博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶fdh(引物為PfdhF、PfdhR)、枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶Bsglcdh(引物為PBsglcdhF、PBsglcdhR)、惡臭假單胞桿菌的葡萄糖脫氫酶Ppglc(引物為PPpglcdhF、PPpglcdhR)。分別以相應的引物、基因組模板進行PCR，得到相應菌株來源的提供輔因子NADH循環的脫氫酶的基因片段，將其與pET-28a質粒連接(核苷酸片段與質粒分別用BamHI和Sac I進行雙酶切，然后連接)，得到表達提供輔因子NADH循環的脫氫酶的重組質粒pET-28a-fdh、pET-28a-Bsglcdh、pET-28a-Ppglcdh，將重組質粒轉化到感受態E.coli BL21，篩選正確的轉化子，即得到表達提供輔因子NADH循環的脫氫酶的重組菌。
比如，以PBsglcdhF、PBsglcdhR為引物對、枯草芽孢桿菌染色體DNA作為模板進行擴增，得到來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因片段，將其與pET-28a質粒連接(核苷酸片段與質粒分別用BamH I和Sac I進行雙酶切，然后連接)，得到表達來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶的重組質粒pET-28a-rbs2-Bsglcdh，將重組質粒轉化到感受態E.coli BL21，篩選正確的轉化子，即得到表達提供輔因子NADH循環的來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶的重組菌。
其中引物序列(如SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:32)如下：
PBsglcdhF：5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3’(BamH I)
PBsglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Hind III)
P28aPromoterF：5’-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3’(Sph I)
PBsglcdhRBglII：5’-GAAGATCTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(Bgl II)
PPpglcdhF：5’-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’(BamH I)
PPpglcdhR：5’-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’(Hind III)
PPpglcdhRBglII：5’-GAAGATCTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’(Bgl II)
PfdhF：5’-ACCGGGATCCATGAAAATCGTTCTGGTTCTG-3’(BamH I)
PfdhR：5’-CGCGTCGACTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(Sal I)
PfdhRBglII：5’-GAAGATCTTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3’(Bgl II)
[2]以甲酸脫氫酶為例，還可以進行以下優化：
同時選取了tac啟動子，并根據pXMJ-19質粒上的tac啟動子及甲酸脫氫酶的基因序列，設計含有不同強度的rbs序列(用下劃線加粗表示，如SEQ ID NO:33～SEQ ID NO:39所示)的PCR引物r1FDH、r2FDH、r3FDH、r4FDH、r5FDH、r6FDH、r7FDH，及甲酸脫氫酶基因的末端引物pFDHRBamHI。
其中引物序列(如SEQ ID NO:40～SEQ ID NO:49)如下：
pFDHRBamHI:5’-CGGGATCCTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(BamHI)
pTacFSphI:5’-CATGCATGCTGACAATTAATCATCGGCT-3’(Sph I)
prrnBRBglII:5’-GAAGATCTAGAGTTTGTAGAAACGC-3’(Bgl II)
利用博伊丁假絲酵母的染色體DNA作為模板，分別以含有不同強度的rbs序列的引物和pFDHRBamHI組成引物對，進行PCR，得到多條含有rbs序列和甲酸脫氫酶的基因片段，將其與pXMJ-19質粒連接(核苷酸片段與質粒分別用Hind III和BamH I進行雙酶切，然后連接)，得到表達甲酸脫氫酶的重組質粒pXMJ-19-r1fdh、pXMJ-19-r2fdh、pXMJ-19-r3fdh、pXMJ-19-r4fdh、pXMJ-19-r5fdh、pXMJ-19-r6fdh、pXMJ-19-r7fdh，將重組質粒轉化到感受態E.coli BL21，篩選正確的轉化子，即得到表達提供輔因子NADH循環的甲酸脫氫酶的重組菌。
比如，以r1FDH、pFDHRBamHI為引物對、博伊丁假絲酵母基因組作為模板進行擴增，得到來源于博伊丁假絲酵母的甲酸脫氫酶基因片段，將其與pXMJ-19質粒連接(核苷酸片段與質粒分別用Hind III和BamH I進行雙酶切，然后連接)，得到表達甲酸脫氫酶的重組質粒pXMJ-19-r1fdh，將重組質粒轉化到感受態E.coli BL21，篩選正確的轉化子，即得到表達提供輔因子NADH循環的甲酸脫氫酶的重組菌。
[3]將[1]和[2]中所構建好的表達有甲酸脫氫酶的重組菌利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于100ml的LB基中。接種量1％，培養溫度37℃，搖床轉速160r/min。培養至OD600約0.6～0.8時加入終濃度為1mmol/L的IPTG，置于16℃搖床24h誘導表達。對甲酸脫氫酶的酶活力進行測試實驗，取培養好的菌液，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用100mL pH 7.0的50mM PB緩沖液洗滌二次，將重組大腸桿菌重懸于10mL的50mM PB緩沖液中。將懸浮好的細胞放入超聲波細胞破碎儀中進行細胞破碎，破1s，停3s，300W的功率工作時間10min。取破碎液于離心機內4℃，10000r/min離心30min去除沉淀，測定上清液酶活。
[4]甲酸脫氫酶酶活測定方法：利用0.1M的pH 7.5的PB緩沖液來配制100mM的甲酸鈉底物溶液。將0.96mL的底物緩沖液加入到比色皿中，再加入40μL的酶液并立即混勻。通過計算酶反應液在340nm紫外光下吸光值的變化去測定生成NADH濃度的變化，然后與NADH的標準曲線對照得出NADH的濃度變化值，也可以根據NADH的摩爾消光系數利用公式計算得出酶活。酶活的定義為：每分鐘產生的1μmol的NADH所需的酶量。
[5]結果顯示重組菌pET-28a-fdh/BL21、pXMJ-19-r1fdh/BL21、pXMJ-19-r2fdh/BL21、pXMJ-19-r3fdh/BL21、pXMJ-19-r4fdh/BL21、pXMJ-19-r5fdh/BL21、pXMJ-19-r6fdh/BL21以及pXMJ-19-r7fdh/BL21在LB培養基中所誘導出的酶活分別為0.34U/mL、0.12U/mL、0.15U/mL、0.14U/mL、0.27U/mL、0.56U/mL、0.37U/mL、0.41U/mL。因此，以pXMJ-19-r5fdh質粒為基因來源進行下一步串聯表達。
實施例4：高效合成α-氨基丁酸的重組大腸桿菌單細胞工廠的構建
[1]以pET-28a-Bsglcdh為模板、P28aPromoterF和PBsglcdhRBglII為引物，進行PCR擴增，得到攜帶pET-28a質粒載體本身的T7啟動子、pET-28a自帶rbs以及枯草來源的葡萄糖脫氫酶的核苷酸片段；以pET-28a-Ppglcdh為模板、P28aPromoterF和PPpglcdhRBglII為引物，進行PCR擴增，得到攜帶pET-28a質粒載體本身的T7啟動子、pET-28a自帶rbs以及惡臭假單胞桿菌來源的葡萄糖脫氫酶的核苷酸片段；以pXMJ-19-r5fdh質粒作為模板、pTacFSphI和prrnBRBglII為引物進行擴增，得到攜帶pXMJ-19質粒載體本身的tac啟動子、pXMJ-19自帶rbs以及博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶的核苷酸片段。
[2]上一步得到的3個核苷酸片段連接到pMD18-T上，構建得到重組質粒pMD18-T-promoter+Bsglcdh、pMD18-T-promoter+Ppglcdh、pMD18-T-tac-promoter+r5fdh，導入感受態E.coli JM109，驗證轉化子。
[3]從[2]中轉化子中提取相應的質粒，與實施例2中已經串聯有不同rbs序列的L-蘇氨酸脫氨酶和L-氨基酸脫氫酶的表達載體pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh分別用Sph I和Bgl II進行雙酶切，然后連接。將連接好的重組質粒pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh、pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh及pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh轉化到感受態E.coli BL21，酶切驗證正確的菌株即為合成α-氨基丁酸重組大腸桿菌單細胞工廠。
實施例5：大腸桿菌感受態的制備及質粒的轉化
[1]大腸桿菌感受態的制備。將單克隆大腸桿菌于10ml LB培養基中活化，之后轉接于37℃振蕩培養至OD6000.35即可制備感受態；將培養好的菌液置于冰水中，輕輕搖晃使菌液迅速冷卻約10min；準備滅好菌的1.5ml離心管若干個，分裝菌液于管中，每管裝菌量1.2ml，將離心管放置于冰中；菌液離心8000r/min 10-20s，冰水中靜置2min，棄上清，加入預冷好的0.1M CaCl2400μL，輕輕吹吸懸浮液，放入冰中15min(該步驟重復2-3次)；最后，每管菌液離心棄上清后加入預冷好的0.1M CaCl280μL，輕輕吹吸懸浮菌液放入冰中。
[2]質粒的轉化。取[1]制備好的感受態細胞，加入需要轉化的質粒，輕輕反復吹吸，并在冰中放置45min；將離心管放入42℃水浴鍋準確放置90s，然后取出迅速放入冰中5min；加入LB培養基800μL，輕輕混合，37℃搖床培養1-1.5h；菌體離心2min，棄大部分上清，再重新吹吸懸浮，取200μL于目標抗性平板，置于37℃培養箱中培養；待轉化子長出之后提質粒驗證。
實施例6：大腸桿菌重組菌的發酵培養基
[1]LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。
[2]TB培養基(g/L)：甘油4，胰蛋白胨12，酵母提取物24，K2HPO412.5，KH2PO42.3，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
[3]TY培養基(g/L)：葡萄糖10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 3，K2HPO46，KH2PO43，檸檬酸鈉1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
[4]TYG培養基(g/L)：甘油10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，檸檬酸鈉1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
[5]GP培養基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨10，酵母提取物5，K2HPO46，KH2PO43，檸檬酸鈉1，MgSO40.2，pH 7.0-7.2。
實施例7：表達甲酸脫氫酶的重組大腸桿菌單細胞工廠全細胞轉化產α-氨基丁酸
[1]將實施例4步驟[3]得到的重組大腸桿菌單細胞工廠
pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21分別利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于100mL的LB培養基中。接種量1％，培養溫度37℃，搖床轉速160r/min。培養至OD600約0.6～0.8時加入終濃度為1mmol/L的IPTG，置于16℃搖床24h誘導表達。進行全細胞轉化實驗，取不同培養基中培養好的菌液，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用100mL pH 7.0的50mM PB緩沖液洗滌二次，分別將重組大腸桿菌重懸于100mL的pH7.5的50mM PB緩沖液中。向該體系中投入0.8M L-蘇氨酸和0.8M甲酸銨及0.1％(v/v)tween-80，置30℃搖床中繼續培養，培養過程中每隔0.5h加入20％甲酸或5M氨水以保持反應液pH為7.5。分不同時間取樣，離心并用0.22μm濾膜過濾后經HPLC分析。
[2]氨基酸的HPLC分析條件：在EP管中依次加入轉化液樣品200μL，衍生劑400μL(取10mg鄰苯二甲醛+0.5ml無水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.l M硼砂緩沖液及50μL 2-巰基乙醇)，混勻后等待2分鐘加入400μL 0.1M KH2PO4緩沖液，嚴格控制時間和試劑添加量，然后進樣。色譜柱：dimosoil C18(5μl,250mm×4.6mm)，流動相：0.05M醋酸鈉緩沖液:甲醇-63:35，檢測器：UVDetector，檢測波長：338nm，柱溫：40℃，進樣量：20μL，流速：1.0ml/min。
[3]有機酸的HPLC分析條件：色譜柱：Aminex HPX-87(300mm×7.8mm)，流動相：5mM H2SO4，檢測器：UV Detector，檢測波長：210nm，柱溫：30℃，進樣量：10μL，流速：0.6ml/min。
[4]氨基酸測定結果顯示pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21全細胞轉化制備α-氨基丁酸的產量分別為22.1g/L、48.5g/L、66.2g/L、81.8g/L、40.6g/L、39.2g/L。其中pET-28a-rbs1-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs2-ltd+Rjpdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21重組菌全細胞轉化液中L-蘇氨酸均有殘留，且并未檢測到中間產物酮丁酸的積累，說明rbs1/rbs2/rbs3所誘導出的L-蘇氨酸脫氨酶酶活較低，不能夠滿足α-氨基丁酸的高效生產。而pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs6-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21重組菌全細胞轉化液中分別檢測出40.7g/L及41.4g/L的中間產物酮丁酸，因前期實驗已經顯示來源于蠟樣的亮氨酸脫氫酶轉化速率較快完全滿足產物的快速積累，說明可能是L-蘇氨酸脫氨酶的表達量較高導致中間產物的積累進而抑制了轉化的進行。
[5]將重組菌pET-28a-rbs3-ltd+Bsadh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Bcldh+r5fdh/BL21利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于2L的LB基中。接種量8％，培養溫度37℃，轉速300r/min，通氣量1.0vvm。培養2-3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導溫度降低為28℃，誘導16h后，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用pH 7.5的50mM PB緩沖液將重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養時同等體積的pH 7.5的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入1M L-蘇氨酸及1M甲酸銨，于30℃、300r/min進行轉化，并以20％甲酸或者5M氨水調節使pH6.0。待轉化20h后取樣，離心并用0.22μm濾膜過濾后經HPLC分析，得到α-氨基丁酸的產率分別為86.2g/L、99.6g/L及43.1g/L。
實施例8：重組菌pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21在不同發酵培養基培養后進行全細胞轉化產α-氨基丁酸
將重組菌pET-28a-rbs4-ltd+Scvdh+r5fdh/BL21利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于2L的TB基、TY基、TYG基及GP基中。接種量8％，培養溫度37℃，轉速300r/min，通氣量1.0vvm。培養2-3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導溫度降低為28℃，誘導16h后，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用pH 7.5的50mM PB緩沖液將重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養時同等體積的pH 7.5的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入1.8M L-蘇氨酸和1.8M甲酸銨，于30℃、300r/min進行轉化，并以20％甲酸或者5M氨水調節使pH7.5。待轉化10h及20h后分別取樣，離心并用0.22μm濾膜過濾后經HPLC分析。發現L-蘇氨酸到α-氨基丁酸在TB基、TY基、TYG基及GP基發酵后的全細胞轉化20h后轉化率均可以達到98％以上，但是在10h時的轉化率差別較大，分別為68％，46％，49％，64％，因酵母提取物的成本相比于葡萄糖來說較高，因此確定最佳的發酵培養基為GP培養基，其最終α-氨基丁酸的產量達到181g/L，時空產率為9.05g/L·h。
實施例9：表達葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌單細胞工廠全細胞轉化產α-氨基丁酸
[1]將實施例4步驟[3]得到的重組大腸桿菌單細胞工廠
pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21及pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh/BL21重組菌重組菌利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于2L的LB基中。接種量8％，培養溫度37℃，轉速300r/min，通氣量1.0vvm。培養2-3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導溫度降低為28℃，誘導16h后，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用pH 7.5的50mM PB緩沖液將重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養時同等體積的pH 7.5的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入1M L-蘇氨酸及1M葡萄糖，于30℃、300r/min進行轉化，并以1M鹽酸或者5M氨水調節使pH7.5。待轉化18h后取樣，離心并用0.22μm濾膜過濾后經HPLC分析。
[2]氨基酸測定結果顯示pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21及pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh/BL21全細胞轉化制備α-氨基丁酸的產量分別為33.5g/L、89.1g/L、100.2g/L、27.8g/L。其中pET-28a-rbs3-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs4-ltd+Bcldh+Bsglcdh/BL21、pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21重組菌全細胞轉化液中并未檢測到中間產物酮丁酸的積累，而重組菌pET-28a-rbs6-ltd+Bsadh+Ppglcdh/BL21全細胞轉化液中檢測出73.6g/L的中間產物酮丁酸，說明在以葡萄糖脫氫酶為輔酶NADH再生用酶時利用rbs4及rbs5序列去誘導L-蘇氨酸脫氨酶表達時有利于α-氨基丁酸的制備，其中以rbs5序列為L-蘇氨酸脫氨酶的核糖體結合位點序列最佳。
實施例10：重組菌pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21在不同發酵培養基培養后進行全細胞轉化產α-氨基丁酸
將重組菌pET-28a-rbs5-ltd+Rjpdh+Ppglcdh/BL21利用LB培養基活化，37℃、160r/min培養過夜后分別轉接于2L的TB培養基、TY培養基、TYG培養基及GP培養基中。接種量8％，培養溫度37℃，轉速300r/min，通氣量1.0vvm。培養2-3h后加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導溫度降低為28℃，誘導16h后，4℃，8000r/min離心10min收集菌體，用pH 7.5的50mM PB緩沖液將重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養時同等體積的pH 7.5的50mM PB緩沖液中，向該體系中投入2M L-蘇氨酸和2M葡萄糖，于30℃、300r/min進行轉化，并以1M鹽酸或者5M氨水調節使pH7.5。待轉化10h及20h后分別取樣，離心并用0.22μm濾膜過濾后經HPLC分析。發現重組菌利用L-蘇氨酸轉化成α-氨基丁酸在TB培養基、TY培養基、TYG培養基及培養GP基發酵后的全細胞轉化20h后轉化率也均可以達到98％以上，但是在10h時的轉化率差別較大，分別為47％，62％，66％，53％，因此確定最佳的發酵培養基為TYG培養基，其最終葡萄糖酸的產量達390.8g/L，α-氨基丁酸的產量達到204g/L，α-氨基丁酸的時空產率為10.2g/L·h。
綜上，本發明采用如下手段可以取得較好的效果：L-蘇氨酸脫氨酶基因前有質粒載體自身攜帶的啟動子、針對L-蘇氨酸脫氨酶基因和質粒載體設計的表達強度低于質粒載體本身rbs的rbs序列；L-蘇氨酸脫氨酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因之間通過質粒載體自身攜帶的rbs連接；提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因前有針對提供輔因子NADH循環的脫氫酶基因和質粒載體設計的啟動子、表達強度高于或等于質粒載體本身rbs的rbs序列。
本發明的重組菌單細胞工廠能得到較優的從L-蘇氨酸到中間產物酮丁酸及從酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率，不會造成中間產物酮丁酸的積累因而不會造成對反應的抑制。同時所述的重組菌單細胞工廠不需要外源添加輔因子，相比于其他方法減少了底物進出細胞或擴散的路徑從而增加了轉化速率。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
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<212> DNA
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agtaacaatt tcagcaccgt ttctataacc taat 34
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gaaacgcaag aattaactac gacaaactcg ggaa 34
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actttctaaa tacctctacc tactctctat aaccc 35
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taaaatcaca tccaatttac tacggaaata tccac 35
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ttaagcaata aaatatatac ttacggttta caa 33
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c 61
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c 61
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cccaagcttg tacgcaagaa tacttaacta cggttagagg gatgaagatc gttttagtc 59
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cccaagcttg tcatagaaaa atttaaccta cggttacagg gatgaagatc gttttagtc 59
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cccaagcttc tcatagatag aaataaccta cggttacagg gatgaagatc gttttagtc 59
<210> 43
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cccaagctta caaatactct ataaaaaaaa ctacggttag aataatgaag atcgttttag 60
tc 62
<210> 44
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cccaagcttc tcatctaata caatacaaac tacggttaga acaatgaaga tcgttttagt 60
c 61
<210> 45
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cccaagctta atctacaata aatctcacaa ctacggttat aataatgaag atcgttttag 60
tc 62
<210> 46
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cccaagcttt gttaaacaag gtccaactac ggttaacaca atgaagatcg ttttagtc 58
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
cgggatcctt atttcttatc gtgtttac 28
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
catgcatgct gacaattaat catcggct 28
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gaagatctag agtttgtaga aacgc 25