專利名稱：防治多種真菌病害的細菌菌株nj118的制作方法
技術領域：
本發明涉及防治多種真菌病害的單一細菌菌株njll8，屬于農作物防病治病技術 領域，專用于灰霉病、炭疽病、蔓枯病、菌核病的無公害防治，是一種很好的化學農藥替代
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背景技術：
由植物病原真菌引起的病害，約占植物病害的70 80%。一種作物上可發現幾種 甚至幾十種真菌病害。目前，真菌病害的防治主要依賴化學農藥。化學農藥的大量使用在 保證作物高產、穩產，控制病害流行方面發揮著重要作用，但是由于化學農藥本身的缺點及 長期不合理的使用，逐漸暴露出一些嚴重的問題，如3R問題(抗藥性Resistance、農藥殘留 Residue、病蟲害再猖獗Resurgence)等。此外，隨著經濟的發展、人們生活水平的提高，人 們越來越重視食品安全問題。生物農藥因其安全性而得到世界各國的重視。目前國際上已 經有焚光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescense)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、 方文身寸土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)、綠粘帚霉(Glioladium virens)、黃絲曲霉 (Talaromyces favus)及多種木霉(Trichodex)等菌株開發為殺菌劑。技術問題本發明的目的是針對農業生產中的實際問題和需求，篩選出一株抗菌譜廣、活性 高、對環境安全的新型生防細菌菌株，更好地防治植物真菌病害，減少化學農藥的使用。技術方案本發明是從森林土壤中分離篩選到1株具有較強拮抗活性的細菌，經微生物學鑒 定為吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，菌株代號為njll8。吡咯菌素 伯克霍爾德氏菌作為一種生防細菌，在國內屬首次報道，是一種新型的生防細菌。該菌株已 保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中 心(CGMCC)。地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日 期是2009年3月10日，保藏號是CGMCC No. 2930。生防菌株njllS用于制備生防菌劑的方法為將上述防治多種真菌病害的細菌菌株njllS接種到LB液體培養基中，25-30°C、 150-250rpm振蕩培養3_5天，使菌體數量達到101(lCFU/mL以上就得到其懸浮劑成品。有益效果使用該發明生產的生防菌劑具有生產成本低、使用方便、防治效果好等優點，適用 于灰霉病、炭疽病、蔓枯病、菌核病等病害的生物防治。本發明對于保護生態環境，提高農產 品的質量具有重要意義。實驗證明，菌株njllS對香蕉灰霉病、黃瓜炭疽病、西瓜蔓枯病、油菜菌核病抑菌 圈直徑都大于40mm。在溫室盆栽試驗中，njllS對黃瓜炭疽病和油菜菌核病的防治效果分 別達到了 85. 和86.6%。三具體實施例方式本發明是從森林土壤中分離篩選到1株具有較強拮抗活性的細菌，經微生物學 鑒定為吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，菌株代號為njll8。吡咯 菌素伯克霍爾德氏菌作為一種生防細菌，在國內屬首次報道，是一種新型的生防細菌。該 菌株現保存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號是CGMCC No.2930。1生防細菌的分離取南京市中山陵內樹木根表5mm 土層土樣共30份。將采集的土樣5g加入裝有 50mL無菌水的三角瓶中，150rpm振蕩1小時，然后進行4_5次10倍系列稀釋。吸取稀釋 10000和100000的稀釋液200 μ L于LB平板上均勻涂布，每個稀釋度中設3次重復于28 °C 下培養2天。挑取不同類型的菌落于LB平板上純化3次，隨后劃線于LB斜面，于4°C保存 備用。將篩選獲得的細菌在LB平板上活化后分別移入到50mL的LB液體培養基中，ISOrpm, 28°C振蕩培養48小時得到細菌菌液。在PDA和LB等比例混合的平板中央放置病原真菌菌 絲塊(直徑5mm)，四周呈對角線放置4個直徑為5mm的濾紙片，3個接種待測細菌菌液5 μ L， 1個設無菌水處理為對照，每個處理重復3次，28°C培養，待對照處理真菌生長至平板邊緣 時測定抑菌圈。通過此方法，我們分離獲得509株細菌，篩選獲得8個具有較強拮抗活性的 菌株。2菌株的鑒定根據16S rDNA序列測定數據，以及細胞形態和生理生化實驗數據(表1)分析， njll8被鑒定為吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)。發明人對njll8 的平板拮抗活性進行測定，發現njll8對香蕉灰霉病、黃瓜炭疽病、西瓜蔓枯病、油菜菌核 病具有較強的平板拮抗活性。溫室防效測定發現njll8對黃瓜炭疽病和油菜菌核病的防治 效果分別達到了 85. 和86. 6%，有較大的潛力開發成商業化的活菌生防制劑。表1生防菌株njll8的理化試驗表(BI0L0G GN2)
權利要求
防治多種真菌病害的菌株nj118，其特征在于，該菌株為吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)，于2009年3月10日保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.2930。
2.權利要求1所述防治多種真菌病害的菌株njll8在防治灰霉病、炭疽病、蔓枯病、菌 核病方面的應用。
3.用權利要求1所述防治多種真菌病害的菌株njll8制備的生防菌劑。
4.權利要求3所述防治多種真菌病害的菌株njllS的制備方法，其特征在于將權利要求1所述防治多種真菌病害的菌株njllS在LB等細菌培養液25-30°C、 150-250rpm振蕩培養3_5天后得到的發酵液即可作為生防菌劑。
5.權利要求3或4所述njllS生防菌劑在防治灰霉病、炭疽病、蔓枯病、菌核病方面的 應用。
全文摘要
本發明涉及防治多種真菌病害的細菌菌株nj118，屬于農作物防病治病技術領域。經鑒定為吡咯菌素伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)。菌種為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，保藏號為CGMCC No.2930。菌種在LB等細菌培養液25-30℃、150-250rpm振蕩培養3-5天后得到的發酵液即可作為生防菌劑。Nj118菌株對灰霉病、炭疽病、蔓枯病、菌核病表現出較好的平板拮抗效果，有較大的潛力開發成商業化的活菌生防制劑。
文檔編號C12N1/20GK101942402SQ201010173758
公開日2011年1月12日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者劉寶生, 方繼朝, 王利華, 謝霖, 郭慧芳, 鐘萬芳 申請人:江蘇省農業科學院