專利名稱：多拷貝高效表達重組菌絲霉素的畢赤酵母的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及重組菌絲霉素基因多拷貝表達載體及其重組酵母的制備方法。
背景技術：
菌絲霉素(Plectasin)是Mygind等從真菌(腐生子囊菌，the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigre 11a)中分離得到首例防御素(Mygind et al.， Nature, 2005,437 :975 980)。其高級結構包含一個α - β模型，由一個α -螺旋和兩個反平行的β-折疊組成，由三個二硫鍵穩定(Cys4-Cys30，Cysl5-Cys37，Cysl9-Cys39)。菌絲霉素高抗革蘭氏陽性菌、無細胞毒性、無溶血性及腦脊液滲透性好，在治療革蘭氏陽性菌病方面具有相當大的潛力，是具有治療潛能的新的肽抗生素。采用基因工程手段構建菌絲霉素基因工程菌，相對于化學合成和直接從生物組織中提取的方式以其生產工藝簡單，成本低廉等優點。中國專利申請號為201010115149. 6的發明專利申請公開了一種酵母工程菌制備重組菌絲霉素的方法，但該方法存在如下不足1)主要為單拷貝整合，表達量有限；幻發生多次自發交換產生多拷貝基因的概率極低，幻篩選多拷貝的工作量大。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術不足，提供一種重組菌絲霉素基因多拷貝表達載體及其重組酵母的制備方法，該方法采用同尾酶法體外構建菌絲霉素多拷貝表達盒，一次整合即可將多個表達盒插入酵母染色體，有效提高菌絲霉素在酵母中的表達豐度，實現其廉價生產。本發明采用如下技術方案，其特征在于該方法，包括以下步驟(一 )菌絲霉素基因所述來源于真菌的菌絲霉素基因優選自腐生子囊菌假黑盤菌(the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)(專利號為 201010115149. 6)中經過密碼子優化改造得到的菌絲霉素基因(SEQ ID NO. 1)核苷酸序列。( 二)重組菌絲霉素單拷貝表達載體的構建所述的表達載體衍生于酵母表達載體，優選的，所述酵母表達載體為pPIC系列表達載體，優選的，所述的表達載體采用PPICZ α Α。所述的單拷貝表達載體含有一個拷貝的菌絲霉素表達盒，所述的菌絲霉素表達盒包括以下元件(a)起始信號元件為醇氧脫氫酶強啟動子(AOX)；(b) α -因子信號肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號元件為AOX(TT)；在菌絲霉素基因的5'-端設計限制性內切酶BioI酶切位點，并保留了 BioI酶切位點后的酵母Kex2切割位點(KR)編碼序列，以便分泌表達后信號肽的切割獲得重組
3Plectasin，在基因3'-端設計TAATAA終止子序列及)(ba I酶切位點，以便多肽表達的終止及載體構建，由上海生工生物工程技術服務有限公司直接合成，菌絲霉素基因片段經 Xho I和)(ba I雙酶切后克隆至經相同酶切后的表達載體pPICZ α A上，構建重組表達載體 pPICPlectasin。(三)重組菌絲霉素多拷貝表達載體的構建所述的多拷貝表達載體中含有2個以上，更優選4-16個，最優選4-8個串聯排列
的菌絲霉素表達盒。將菌絲霉素單拷貝表達載體pPICPlectasin經BglII和BamHI雙酶切，得到含有醇氧化酶基因啟動子、α -信號肽因子、菌絲霉素基因、醇氧化酶基因末端終止子的完整表達盒序列作為串聯單元，連接到經BglII單酶切的表達載體pPICPlectasin上，利用BglII 和BamHI同尾酶的特性(同向連接后連接處序列發現變化使BglII和BamHI無法識別)，可以反復酶切連接操作，構建獲得一系列菌絲霉素多拷貝表達載體。(四)重組菌絲霉素不同拷貝酵母的構建及拷貝數的鑒定所述的酵母優選為畢赤酵母，所述的畢赤酵母優選畢赤酵母X-33。重組菌絲霉素多拷貝表達載體pPICPlectasinQn)經內切酶BglII線性化處理， 電擊轉化畢赤酵母X-33，將電擊后的混合液涂布在含100 μ g/ml Zeocin的YPDS平板上， ^TC培養至出現菌落，經菌落PCR鑒定陽性轉化子，甘油管保存陽性轉化子。酵母基因組提取試劑盒提取各陽性轉化子基因組DNA，并根據菌絲霉素基因序列設計引物和探針FP 5~-GAGGCTGAAGCTGGTTTTGGT ； RP 5~-AATAGACTTACAATGGTTATGACATTGCA ；探針(Probe):
FAM-CCATGGGATGAAGATGA-MGB,以線性化單拷貝表達載體pPICPlectasin作為單拷貝標準品建立標準曲線，實時熒光定量PCR鑒定轉化子的拷貝數。(五)重組菌絲霉素不同拷貝酵母的誘導表達將含不同菌絲霉素基因拷貝數的重組酵母接種在BMGY中，振蕩培養使菌增殖至 OD = 5-6，離心收集菌體，將菌體重懸在BMMY中，使其OD值達到1. 0，在下進行甲醇誘導。每隔M小時補加甲醇至甲醇終濃度為0. 5%，在搖瓶水平比較重組菌絲霉素不同拷貝酵母的表達量，發現菌絲霉素單拷貝和四拷貝轉化子拷貝數與表達量存在線性關系。通過附圖和實施例對本發明具體實施方式
進行說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。


圖1.重組菌絲霉素單拷貝表達載體pPICPlectasin示意2.菌絲霉素多拷貝表達載體構建示意3.菌絲霉素單拷貝、二拷貝、四拷貝、八拷貝表達載體Bglll/BamHI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析1，6 =DNA分子量標準；2-5 單拷貝，二拷貝、四拷貝、八拷貝37 °C酶切4h圖4.實時熒光定量PCR驗證畢赤酵母菌絲霉素多拷貝轉化子整合拷貝數標準曲線用紅色表示；各拷貝樣品用藍色表示圖5. Tricine-SDS-PAGE檢測多拷貝轉化子120h發酵液上清
1-4 菌絲霉素單拷貝，二拷貝，四拷貝，八拷貝轉化子誘導120h的發酵液上清；5:蛋白分子量標準
具體實施例方式下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如“分子克隆實驗室手冊” (New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精編分子生物學實驗指南”(美/F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，北京，科學出版社，1998)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。本發明的實施例中使用的畢赤酵母X33及pPIC系列表達載體pPICZ α A均購自 hvitrogen公司，質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)，限制性內切酶購自 NEB 公司(New England Biolabs)。實施例1菌絲霉素基因工程菌的構建1. 1基于酵母偏愛密碼子設計Plectasin的基因根據巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)密碼子使用的偏愛性(http://WWW. kazusa. or. jp/codon/)人工設計Plectasin的基因，所得序列如SEQ ID NO. 1所示。1. 2重組菌絲霉素單拷貝表達載體的構建在Plectasin基因的5’ -端設計了 Plectasin基因中不具備但載體多克隆位點上具有的限制性內切酶》ιοΙ酶切位點，并保留了 BioI酶切位點后的酵母Kex2切割位點 (KR)編碼序列，以便分泌表達后信號肽的切割，獲得重組Plectasin，在基因3’ -端設計 TAATAA終止子序列及^CbaI酶切位點，以便多肽表達的終止及載體構建所設計用于表達的 Plectasin基因，由上海生工生物工程技術服務有限公司直接合成，Xho I和)(ba I雙酶切后克隆至》ιοΙ和)(ba I雙酶切后的表達載體pPICZ α A上，構建重組菌絲霉素單拷貝表達載體pPICPlectasin (圖1)，測序正確后轉化并保存在大腸桿菌DH5 α中。1. 3重組菌絲霉素多拷貝表達載體的構建提取大腸桿菌DH5ci中重組菌絲霉素單拷貝表達載體pPICPlectasin，利用表達載體存在的一對同尾酶Bgl II/BamHI位點來構建重組菌絲霉素多拷貝表達載體 pPICPlectasin (2n).Plectasin單拷貝表達載體pPICPlectasin中含有的表達盒(pAOXl及目的基因)，約3.61Λ。單拷貝表達載體上下游側翼分別為獨個的Bgl II及BamH I位點。限制性內切酶BamH I、BglII為同尾酶，含目的基因的pPICPlectasin用Bgl II及BamH I消化分離表達盒(約1.61Λ)，用BglII單酶切獲得線性質粒pPICPlectasin，將表達盒再插入線性質粒pPICPlectasin以產生串聯重復表達盒，重復該插入程序可產生一系列逐漸增加數目表達盒的載體(圖2)，用體外形成的多拷貝子轉化畢赤酵母增加了多拷貝表達盒重組子出現的頻率。圖3為構建的Plectasin —，二，四和八拷貝重組載體，分別為3. 6,5. 2,8. 4和 14.8kb，經BamH I、Bgl II雙酶切后產生的表達盒分別為1. 6、3. 2、6. 4和12. 8kb。1. 4菌絲霉素各拷貝表達載體轉化篩選及拷貝數鑒定Bgl II線性化菌絲霉素二拷貝、四拷貝、八拷貝表達載體，電轉化畢赤酵母X-33 感受態細胞及陽性轉化子的篩選。甘油管保存陽性轉化子。將鑒定的重組表達載體pPICPlectasin^i)經內切酶Bgl II線性化處理，電擊轉化(1.2Κν，25μΡ，400Ω)處理好的感受態畢赤酵母Χ_33，電擊結束后，加入冰預冷的 IM山梨醇，混勻后轉入離心管中，30°C靜止濁；取適量樣品涂YPDS平板(含100yg/mL Zeocin)，倒置培養至出現菌落。根據優化的菌絲霉素基因序列設計上下游引物F 1,-GTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCA-3~ ；Rl，-ACCACCCTTAGCACAGTAACCACCCTTGTAACCCTTAATA-3~。煮凍煮菌落PCR法檢測轉化子。瓊脂糖凝膠(1 % )電泳檢測PCR結果，甘油管保存陽性轉化子。酵母基因組提取試劑盒提取各陽性轉化子基因組DNA，并根據菌絲霉素基因序列設計引物和探針如下，實時熒光定量PCR鑒定轉化子的拷貝數。 FP 5~-GAGGCTGAAGCTGGTTTTGGT ；RP 5~-AATAGACTTACAATGGTTATGACATTGCA ；探針(Probe)FAM-CCATGGGATGAAGATGA-MGB線性化單拷貝表達載體pPICPlectasin作為單拷貝標準品建立標準曲線。起始質粒拷貝數為5. 16X107，進行兩倍梯度稀釋，共10個梯度，每個梯度三個平行樣品作為擴增的標準曲線。將提取的各拷貝轉化子基因組稀釋成50ng/y L作為PCR模板。熒光定量PCR反應體系
Template1.5 μ L
2XMix7.5 μ L
ROX0.3μ L
FP(200nM)0.3μ L
RP(200nM)0.3μ L
Probe(250nM)0.36 μ L
ddH204.99 μ L
Total 循環參數 啟動50°C 預變性95°C 變性95°C 退火延伸60 0C
15μ L
2min 5min 15s
60s 循環40次
提取各拷貝轉化子的畢赤酵母X-33基因組DNA進行熒光定量PCR驗證(圖4)，結果發現菌絲霉素單拷貝，二拷貝，四拷貝和八拷貝轉化子的Ct值存在線性關系，即后者總比前者早一個循環達到熒光信號閾值，整個擴增曲線斜率為-3. 289, R2為0. 992，擴增效率為101.41%。其中單拷貝至八拷貝三個平行樣品Ct值的平均值分別為32. 174,31.269, 30.019,28. 671。實施例2重組菌絲霉素的誘導表達的接種量接種鑒定正確的菌絲霉素二拷貝，四拷貝，八拷貝轉化子至IOmL BMGY培養基中，300C，250rpm搖至OD600nm4. 0 (對數生長期，大約16_18h)；室溫，2500g離心5min。棄上清，用50mL BMMY培養基重懸細胞至OD6tltlnmL 0 ；在250mL三角瓶中加入上述培養物，加蓋4層滅菌紗布，放入搖床繼續生長；每M小時，加甲醇至終濃度為0. 5%繼續誘導；在下列的各個時間點，011，對11，4811，7211，9611，12011取11^培養基至1. 5mL離心管并測量該時間點的OD值，室溫12000rpm離心2_;3min，誘導時間為120h。將菌懸液稀釋為相同的 OD值，離心收集上清至離心管中，-20°C保存。Tricine-SDS-PAGE電泳結果表明，單拷貝和四拷貝重組菌株120h的發酵上清液在約4. 4kDa處有明顯加粗的條帶，與菌絲霉素理論分子量相符，結合凝膠成像軟件分析發現四拷貝轉化子的菌絲霉素表達量是單拷貝轉化子的 4倍(圖5)，表達量和拷貝數之間存在線性關系。 以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要書及其等同物界定。
權利要求
1.一種表達菌絲霉素的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞的染色體中整合有表達菌絲霉素的構建物，所述構建物含有2-16個串聯排列的菌絲霉素表達盒，每個所述菌絲霉素表達盒包括以下元件(a)起始信號元件為醇氧脫氫酶強啟動子(AOX) ； (b) α -因子信號肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號元件為AOX (TT)。所述酵母細胞在甲醇誘導下表達菌絲霉素，表達量與菌絲霉素基因拷貝數之間存在線性關系。
2.如權利要求1所述的表達菌絲霉素的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞選自畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母，優選的，所述酵母細胞選自畢赤酵母，更優選的，所述酵母細胞選自畢赤酵母Χ-33。
3.如權利要求1所述的表達菌絲霉素的酵母細胞，其特征在于，所述的構建物衍生于酵母表達載體，優選的，所述酵母表達載體為PPIC系列表達載體，更優選的，所述的表達載體采用PPICZ α Α,且菌絲霉素基因包括SEQ ID NO. 1所示的序列。
4.一種構建物，其特征在于，所述構建物含有2-16個串聯排列的菌絲霉素表達盒，每個所述菌絲霉素表達盒包括以下元件(a)起始信號元件為醇氧脫氫酶強啟動子(AOX)； (b) α -因子信號肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號元件為AOX(TT)；
5.構建權利要求4所述的構建物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將菌絲霉素基因定點插入包括起始信號元件、信號肽和終止信號元件的質粒中，以獲得單拷貝表達質粒；(2)對所述單拷貝表達質粒含有完整的菌絲霉素表達盒，其中，所述表達盒包含(a) 起始信號元件為醇氧脫氫酶強啟動子(AOX) ； (b) α-因子信號肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因；(c)終止信號元件為AOX(TT)；(3)采用限制性內切酶BglII和BamHI粘性末端能互補的原則，通過反復酶切、連接和轉化操作，將所述菌絲霉素表達盒重復插入所述質粒中，從而獲得含有2-16個串聯排列的菌絲霉素表達盒的構建物。
6.權利要求1所述的表達菌絲霉素的酵母細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟用權利要求4所述的構建物轉化酵母細胞，其所述的構建物整合入酵母染色體中， 從而獲得權利要求1所述的表達菌絲霉素的酵母細胞。
全文摘要
本發明公開了一種多拷貝表達重組菌絲霉素的畢赤酵母的制備方法。該方法包括根據畢赤酵母翻譯的密碼子偏愛性，設計出菌絲霉素表達基因的序列；將優化的菌絲霉素基因融合在表達載體pPICZαA的α-因子信號肽C端，構建單拷貝表達載體，該載體含有由起始信號元件醇氧脫氫酶強啟動子(AOX)、α-因子信號肽基因及融合在其C端的菌絲霉素基因和終止信號元件AOX(TT)等組成的菌絲霉素表達盒；利用限制性內切酶BglII和BamHI粘性末端能互補的原則，通過反復酶切、連接和轉化操作，獲得含菌絲霉素基因的不同拷貝串聯表達盒的重組質粒，電轉化畢赤酵母后，在甲醇誘導下能高效分泌表達菌絲霉素，表達量與菌絲霉素基因拷貝數之間存在線性關系。本發明所構建的多拷貝高表達酵母細胞可用于提高產量、降低成本，適于菌絲霉素的規模化生產。
文檔編號C12R1/865GK102409003SQ201010291818
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者張軍, 楊雅麟, 滕達, 王少然, 王建華 申請人:中國農業科學院飼料研究所