專利名稱：肺組織模型的制作方法
技術領域：
本發明提供不含任何人工骨架的工程化三維肺部模型組織培養物?？色@得健康肺組織以及疾病組織的三維模型。根據本發明的產品可例如呈組織培養物、包含所述培養物的板或陣列、或試劑盒的形式出售。本發明可應用于醫學和科學研究中，用于測試化合物對肺組織的影響，篩選、測試和/或評估藥物，以及在某些情況下診斷肺部疾病。
背景技術：
組織工程化是生物醫學研究中迅速發展的一個領域，其旨在修復、替換或再生損傷組織。由于最近發生悲慘的II期臨床藥物試驗事件(例如TGN1412)，故組織工程化的其它目標包括產生人類組織模型以供醫藥化合物的安全和功效測試。一般組織工程化且尤其我們的模型利用生物形態形成，它是自組裝的一個實例。時下根據若干觀點推行細胞和組織工程化。一方面，其用以獲得對細胞生物學和生理學更深入的了解。組織工程化研究中正在發展兩個主要方向基于組織骨架的系統和無組織骨架的系統。雖然基于骨架的系統主要使用生物可降解的骨架材料來提供人工三維結構以促進細胞的相互作用，但無骨架的系統允許指導細胞與細胞的相互作用并允許細胞生長在模型中其分泌的骨架材料上。在US 2001/0055804A1 (“人類瘤前乳房疾病的三維活體外模型(Three dimensional in vitro model of human preneoplastic breast disease) ") Φ, 一禾中三維活體外細胞培養系統，其適用作瘤前乳房疾病的模型供篩選藥物。所述模型通過在包含如生長因子、雌激素等其它添加劑的培養基中在再造基膜上共培養源自乳房的瘤前上皮細胞、內皮細胞和乳房成纖維細胞來制備。因此，在此解決方案中，基膜、優選Matrigel 用作組織骨架。根據描述，在此系統中約3天-7天內形成分支管泡單元脈管系統的網狀物。所述系統涉及乳房而非肺，且不建議通過此方法來制造肺培養物。在US 2003/0109920( “工程化動物組織(Engineered animal tissue)，，)中，從成人肺獲得微血管內皮細胞并放在存在于三維膠原蛋白凝膠中的兩層人類皮膚成纖維細胞之間。因此，形成夾層結構。盡管從人類肺獲得血管內皮細胞，但通過此方法制備的人工組織類似于人類皮膚，因此，其實際上不能認為是肺組織模型。在US 2008/011沘90( “胎肺細胞和其用途(Fetal pulmonary cells and uses thereof)")中，教示一種類三維組織制劑，其基于胎小鼠上皮細胞、內皮細胞和間充質細胞。作者使用小鼠胚胎肺細胞制備所述制劑，以獲得肺假體并對所述類三維組織制劑進行篩選。作為基質，使用水凝膠MATRIGEL ，以建立適當的細胞-細胞相互作用。從描述中看出，在共培養上皮細胞和成纖維細胞時成纖維細胞過度生長。W02008/100555 ( “供高通量毒性篩選和藥物發現的工程化肺組織構造 (Engineered lung tissue construction for high throughput toxicity screening anddrug discovery)")涉及一種肺組織模型制劑，其包含胎肺細胞和用生物相容性材料且優選成纖維細胞生長因子制成的組織骨架。胎肺細胞包含上皮細胞、內皮細胞和間充質細胞。 列出大量適用的生物相容性材料。W02004/046322( “生物組織的復制(Replication ofbiological tissue)”)提議在微重力環境下制備人工三維組織。此組織是基于人類乳癌細胞并可用作乳癌模型。在旋轉式生物反應器室中，最初培養結締組織細胞，直到形成三維球狀結構，然后內皮細胞和上皮細胞依序加入培養物中。應當注意此教示是理論上的，而且雖然提供培養細胞和處理培養物的方案，但實驗的實際結果未揭示。瓦曲斯(Vertrees，RA)、威申貝格爾(Zwischenberger，JB)等人Q008)使用已經證實的正常永生肺細胞系在培養瓶中生長成傳統單層(ML)和在旋轉式有壁容器中生長成三維培養物。研究這些培養物與從手術患者試樣收集的對照組織之間分化存在和標記物表達的比較情況。作者的目的是發展已知細胞系的傳統單層與三維細胞培養物。近來，凱莉·貝呂貝(Kelly BeruBe)和她的同事發展出人類肺上皮的三維組織工程化模型供安全測試。其使用正常人類支氣管上皮細胞[NHBE]。從人類獲得的原代細胞在微孔膜上生長，形成三維(3D)細胞培養物。這些三維培養物在細胞、具有活性纖毛的細胞和產生并分泌粘液的其它細胞之間形成緊密聯結。這些特征非常類似于在天然人類呼吸上皮組織中發現的情況，且認為其準確地模擬人類對組織損傷的反應。此培養物實際上形成模仿粘膜表面的厚細胞層[休斯·特瑞西(Hughes Tracy)等人，2007]。盡管存在大量有關肺模型的文獻，但似乎現有技術僅僅揭示基于組織骨架的三維模型，并且現有技術沒有揭示至少包含上皮細胞和成纖維細胞的無組織骨架的簡單肺組織模型。本發明者意外地發現，通過簡單的生化方法，可迅速建造無組織骨架的肺組織模型系統，其在若干方面都比二維系統或基于基質的系統有利。本發明提供一種備用于各種測試的模型組織。此模型適合于研究各種肺組織中細胞-細胞相互作用以模擬正常功能和疾病發展。

發明內容
本發明提供一種工程化三維肺部模型組織培養物，所述模型組織培養物a)不含任何人工組織骨架，b)由培養細胞構成或具有培養細胞材料，其中所述細胞處于與組織材料的一種或一種以上其它細胞類型細胞的直接細胞-細胞相互作用中，c)至少包含肺部上皮細胞和間充質細胞，優選肺部間充質細胞，優選成纖維細胞， 其中模型組織中肺部上皮細胞與間充質細胞的比率優選為至少1 6，優選至少1 3，且至多6 1，優選至多3 1，d)具有一個或一個以上細胞聚集體的形態，其中聚集體的表面富集肺部上皮細胞，或其中肺部上皮細胞和間充質細胞、優選成纖維細胞在所述聚集體中至少部分分離，和e)其中所述上皮細胞表達上皮分化標記物。a)在一個優選實施例中，所述模型組織培養物不含人工基質材料來提供三維環境給細胞。在一個實施例中，所述模型組織培養物不含任何人工組織骨架材料，無論是生物可降解還是生物不可降解的組織骨架材料，例如多孔三維基質；三維凝膠基質。在一個實施例中，所述模型組織培養物不含或不包含微孔膜支撐物。b)在一個優選實施例中，所述模型組織培養物也包含細胞外基質，其細胞外基質蛋白為構成所述組織的至少一種細胞類型、優選為成纖維細胞所分泌。c)在其它優選實施例中，肺部上皮細胞包含至少一種下列細胞類型-I型肺細胞[肺泡I型細胞(ATI)]-II型肺細胞[肺泡II型細胞(ATII)]。所述II型肺細胞(具有ATII特征的肺泡上皮細胞)優選表達一種或一種以上下列標記物TTF1轉錄因子、表面活性蛋白A(SFPA)、表面活性蛋白C(SFPC)和水通道蛋白 3 (AQP 3)。所述I型肺細胞(具有ATI特征的肺泡上皮細胞)優選表達一種或一種以上下列標記物TTF1轉錄因子、水通道蛋白3(AQP 3)、水通道蛋白4(AQP 4)和水通道蛋白5 (AQP 5)。在各種其它實施例中，肺部上皮細胞與肺部間充質細胞中的至少一者存在于模型中。細胞優選為兩棲動物、爬行動物、鳥類細胞或更優選為哺乳動物細胞。優選鳥類細胞為家禽肺部細胞。優選哺乳動物細胞為食草動物、優選家畜動物的細胞，如例如綿羊、山羊的細胞、 牛細胞或嚙齒動物細胞(例如兔或鼠類細胞)。其它優選哺乳動物細胞為如豬細胞等雜食動物細胞。極優選的細胞為人類細胞。在其它實施例中，肺部上皮細胞和/或間充質細胞從下列中獲得-建立的細胞系，優選從商業來源獲得，-健康供體-患者供體。在一個優選實施例中，細胞為原代細胞。在一個優選實施例中，細胞不為去分化細胞或為僅僅部分去分化的細胞。在另一個優選實施例中，細胞為去分化細胞，或細胞在其培養成三維模型組織培養物前去分化。在一個優選實施例中，肺部上皮細胞包含小氣道上皮細胞、優選具有ATII特征的小氣道上皮細胞。在另一個優選實施例中，本發明的模型組織培養物也包含內皮細胞。在一個優選實施例中，內皮細胞為HMVEC或HUVEC細胞。本發明的模型組織培養物任選可另外包含選自巨噬細胞、肥大細胞、平滑肌細胞的其它類型的細胞。d)在一個優選實施例中，聚集體的平均直徑或典型直徑至少為10μπι、40μπι、 60 μ m、80 μ m、100 μ m或120 μ m,且聚集體的平均直徑或典型直徑至多為1000 μ m、800 μ m、 600 μ m、500 μ m、400 μ m 或 300 μ m。聚集體的平均直徑或典型直徑極宜為100-300 μ m，在一個優選實施例中，其為約 200 μ Hl0
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聚集體的平均尺寸可通過任何實驗和數學修正方法來評估和計算或估計。雖然聚集體基本上呈球形，但顯然針對各聚集體多個直徑的直徑可歸因于與準確球形的偏差且視測量期間聚集體的位置和測量方法而確定。舉例來說，最小和最大直徑可直接在測量若干聚集體尺寸的顯微鏡中測量并求平均值。顯微鏡宜用于達成此目的。在一個優選實施例中，大部分聚集體，優選至少60 %、70 %、80 %或90 %聚集體具有至少 10μπι、40μπι、60μπι、80μπι、100μπι 或 120 μ m 的直徑禾 P 至多 1000 μ m、800 μ m、 600 μ m、500 μ m、400 μ m或300 μ m的直徑，上述比率的聚集體的直徑極宜為100-300 μ m，在一個優選實施例中，其為約200 μ m。在一個優選實施例中，各聚集體中或試劑盒各容器中培養樣品包含的細胞的量為至少IO3個，優選至少IO4個，更優選至少2X104個、3X104個、4X104個、5X104 個細胞，且至多IO6個，更優選至多5X105個、4X105個、3X105個、2X105個或至多IO5個細胞。在一個優選實施例中，肺部上皮細胞與成纖維細胞基于其表面張力的差異而分離。優選大部分肺部上皮細胞位于聚集體表面上。優選大部分肺部上皮細胞在聚集體表面上形成肺部上皮細胞襯里，優選所述肺部上皮細胞襯里至少部分覆蓋聚集體表面。在另一個優選實施例中，聚集體也包含內皮細胞。在一個優選實施例中，相比于上皮細胞和成纖維細胞，內皮細胞的比率在聚集體的中心或中心區域中高于聚集體表面中，或內皮細胞的比率從聚集體的表面向聚集體的中心增加。在一個優選實施例中，聚集體具有層狀結構，其中聚集體的核心或中心區域包含最大比率的內皮細胞，聚集體的中間層或區域包含最大比率的成纖維細胞，且聚集體的外層或表面層包含最大層的上皮細胞。e)在一個優選實施例中，工程化三維肺部模型組織的組織細胞所表達的上皮分化標記物為至少一種或一種以上選自下列群組的標記物-ATII型分化標記物，優選TTFl轉錄因子、細胞角蛋白7 (KRT7)、表面活性蛋白 A(SFPA)、表面活性蛋白C(SFPC)和水通道蛋白3 (AQP 3)，和/或標記物-ATI型分化標記物，優選水通道蛋白4 (AQP 4)和水通道蛋白5 (AQP 5)。所表達的標記物也視組織培養物中所用的細胞類型而定。任何標記物的含量都可以mRNA或蛋白含量檢測。因此，標記物的含量可為mRNA 含量和/或蛋白含量。優選本發明模型組織培養物的AQP3和SFTPA含量中的至少一者增加，即其相比于對照二維培養物上調。優選本發明模型組織培養物的選自ILlb、IL6和CXCL8的至少一種發炎標記物下調，即相比于對照二維培養物，其含量在三維培養物條件下減少。優選本發明模型組織培養物的去分化標記物S100A4與N-鈣粘蛋白中至少一者的含量相比于二維培養條件下或對照二維組織培養物中的純化的原代細胞減少。
在各種其它實施例中，肺部上皮細胞與肺部間充質細胞中的至少一者存在于模型中，且類似于胚胎肺發育，-肺部上皮細胞分泌一種或一種以上選自FGF4、FGF8、FGF9的成纖維細胞生長因子。-肺部上皮細胞在細胞表面FGFR2b受體上表達。-肺部間充質細胞、優選成纖維細胞分泌TOF7和FGF10，且表達FGFRlc和FGFR2c 受體。在本發明組織培養物的一個優選實施例中，ATII型分化標記物和/或ATI型分化標記物的表達量高于在用作參考的二維組織培養物中所測量的表達量，更優選所述實施例中的表達量高至少10%、至少20%或至少30%。優選所述模型組織中所述上皮標記物的mRNA含量和/或蛋白含量高于一種或一種以上或每一種下列參考培養物-相同細胞類型的二維培養物，-僅僅肺部上皮細胞的培養物，-僅僅原代成纖維細胞、優選人類成纖維細胞的培養物。優選至少兩種所述標記物的含量升高。在一個優選實施例中，應用小氣道上皮細胞。在另一個優選實施例中，應用顯示至少一些ATII型特征的小氣道上皮細胞。在此情況下，模型組織顯示至少一種或一種以上選自下列ATII型分化標記物群組(例如上文所列標記物)的標記物的mRNA含量和/或蛋白含量增加。本發明的工程化三維肺部模型組織優選顯示一種或一種以上促炎性細胞因子和或一種或一種以上EMT標記物的表達減少。優選所述模型組織中所述一種或一種以上促炎性細胞因子的mRNA含量和/或蛋白含量低于一種或一種以上或每一種下列參考培養物-相同細胞組成的二維培養物，-僅僅肺部上皮細胞的培養物，其中所述肺部上皮細胞類似于模型組織培養物加以處理。促炎性細胞因子優選選自下列群組CXCL-8 促炎性細胞因子、IL6、ILla, ILlb, TNF α。在一個極優選實施例中，促炎性趨化因子為CXCL-8化學引誘物。在一個優選實施例中，模型組織培養物包含肺部上皮細胞和肺部間充質細胞且不包含內皮細胞，其中-一種或一種以上下列標記物的含量相對于包含非培養細胞的對照增加E-cad、 IL-Ib 和 / 或 IL6，-E-cad的含量相對于對照二維培養物增加，-一種或一種以上下列標記物的含量相對于對照二維培養物減少IL_lb、CXCL8、 IL6。在一個優選實施例中，模型組織培養物包含肺部上皮細胞、肺部間充質細胞和內皮細胞，其中
一種或一種以上下列標記物的含量相對于包含非培養細胞的對照減少E-cad、 N-cad,-E-cad的含量相對于對照二維培養物增加，-一種或一種以上下列標記物的含量相對于對照二維培養物減少N-cad、 S100A4。在一個優選實施例中，三維肺部模型組織培養物另外包含選自下列群組的細胞-內皮細胞，例如以模擬脈管系統，-巨噬細胞，-肥大細胞。在后期，模型可使用下列細胞類型擴增-平滑肌細胞，-神經細胞。疾病模型本發明也涉及如上所定義的工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述上皮細胞和/或成纖維細胞包含具有患病肺組織的病理特征的受影響細胞， 使得所述模型組織培養物為肺部疾病模型組織培養物。在優選實施例中，疾病包含選自組織發炎、腫瘤、纖維化、損傷的病狀，且模型組織培養物分別被視為發炎模型、腫瘤模型、纖維化模型或再生模型。疾病模型的受影響細胞可為(但不限于)從患者獲得的細胞(患者細胞)；具有疾病特征的細胞系，例如腫瘤細胞系；暴露于引起疾病特征的環境作用(例如促炎性物質) 的細胞；暴露于誘變劑作用且針對疾病特征加以選擇的細胞；或經遺傳修飾的細胞，其經轉化以表達一種蛋白質或其中一種基因沉默，使得具有患病特征。在一個優選實施例中，細胞從健康個體獲得，且在其中誘發疾病病況。在此實施例中，例如可確定腫瘤誘發的信號傳導或潛在藥物靶。在另一個實施例中，腫瘤模型組織從永生細胞制備，例如從惡性轉化或腫瘤細胞或細胞系制備。雖然在此實施例中不存在“健康”對照，但因為與安慰劑藥物接觸的樣品提供藥物治療樣品的對照，所以此系統適用于藥物測試。在一個實施例中，腫瘤細胞從患者獲得，且可測試計劃療法的效率。因此，模型組織培養物可用于建立個人化療法。
制備方法本發明也提供如本文所定義的工程化三維肺部模型組織培養物的制備方法，所述方法包含以下步驟-制備至少原代成纖維細胞與肺部上皮細胞的混合懸浮液，-將混合懸浮液或其等分試樣放在適于?；瘧腋∫杭毎娜萜髦?，-?；毎?在CO2存在下培育?；瘧腋∫翰⒈３肿阋允辜毎纬砂毎奂w的三維肺部模型組織的時間，-任選分析模型組織a)肺組織所特有的一種或一種以上上皮分化標記物的表達，且相較于例如本文所揭示的適合參考培養物，表達量增加被認為是指示形成三維肺部模型組織培養物；和/或b) 一種或一種以上促炎性細胞因子的表達，且相較于例如本文所揭示的任何適合參考培養物，表達量減少被認為是指示形成三維肺部模型組織培養物。容器優選為非組織培養物處理容器。多個等分試樣優選放于多個容器中。容器優選為例如96孔板或384孔板等板的孔。?；瘍炦x在200g到600g下進行1分鐘到20分鐘、優選2分鐘到10分鐘。細胞優選經供給報道分子，例如用生物相容性染料染色以報道如本文所揭示的細胞特征。容器可為V形底、平底或U形底容器，視其用于達成的目的而定。在制備混合懸浮液時，一種或一種以上類型的細胞在18小時內，優選16小時、14 小時、12小時、10小時、8小時、6小時內，更優選4小時、3小時、2小時內，極優選1小時或 0. 5小時內加入容器中。所用各種類型的細胞優選在以上界定的時期內加入。在一個優選實施例中，粒化懸浮液在CO2存在下培育不超過50小時、40小時、30小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時或10小時的時期。在一個優選實施例中，?；瘧腋∫涸?X)2存在下培育不少于2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、 12小時的時期。在本發明的一個實施例中，其它類型細胞加入細胞的混合懸浮液中。在本發明的一個實施例中，其它類型細胞至少為內皮細胞。在本發明的一個實施例中，其它類型細胞選自內皮細胞、平滑肌細胞、神經細胞、粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、T/B淋巴細胞、巨噬細胞。粒細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、T/B淋巴細胞和巨噬細胞可呈非活性或免疫活性狀態加入培養物中。根據本發明的方法任選包含在制備混合懸浮液前將一種或一種以上類型細胞去分化。根據本發明的方法任選包含在制備混合懸浮液前繁殖一種或一種以上類型細胞。 如果需要平行測試大量樣品，例如在HTS(高通量篩選)溶液中，那么此步驟尤其需要。篩選方法本發明也涉及針對藥物對肺組織的作用篩選藥物的方法，所述方法包含以下步驟-提供如本文所定義的工程化三維肺部模型組織培養物，-取所述模型組織培養物的至少一個測試樣品和參考樣品，-使測試樣品與藥物接觸，同時維持測試樣品和參考樣品在相同條件下，-與參考樣品進行比較，檢測測試樣品的任何變化或改變，其中如果檢測到測試樣品的任何變化或改變，那么認為是指示藥物的作用。在所述方法的某些變體中，僅僅觀測到變化或改變的方向，且未計算生理學值。在某些變體中，基于校準曲線，界定預定臨限值，且與此值進行比較。在一個優選實施例中，模型組織培養物為健康肺組織模型且測試藥物的不良作用，其中對測試樣品細胞有害的變化或改變被認為是所述藥物的有毒或不良作用。在一個優選實施例中，模型組織培養物為包含具有病理特征的受影響細胞的肺部疾病模型組織培養物，且測試藥物的有益作用，其中-對所述模型組織培養物提供測量或評估所述病理特征的分析以獲得疾病量度，-提供健康肺組織的參考樣品(健康參考樣品)和/或患病肺組織的參考樣品(患病參考樣品)，-在健康參考樣品和/或患病參考樣品中，以及在所述至少一種測試樣品中在其與藥物接觸前后，測量或評估病理特征，其中使測試樣品中疾病量度移向健康參考樣品中疾病量度和或遠離患病參考樣品中疾病量度的測試樣品中任何變化或改變被認為是所述藥物的有益作用。換句話說，與患病參考樣品相比，其更類似于健康參考樣品的狀態。在一個優選實施例中，應用從患者獲得的原代細胞。在一個優選實施例中，來自既定患者的原代細胞未去分化或僅僅部分去分化，且在從所述患者獲得后5天、4天、3天、2天或1天內或12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時內用來制備細胞的混合懸浮液。在用原代細胞制成的模型組織培養物中，可研究既定患者的疾病病況的特征并可測試治療藥物和/或方案。試劑盒本發明也涉及一種工程化三維肺部模型組織試劑盒，其包含具有容器陣列的測試板，其中至少兩個容器含有-一種或一種以上類型的如先前技術方案中任一技術方案中所定義的工程化三維肺部模型組織培養物的樣品，各樣品放入所述板的各別容器中，-供培養模型組織培養物的細胞的適當培養基。一個容器子集優選包含一種或一種以上對照樣品。對照樣品可為某些細胞類型的純培養物，例如僅僅上皮細胞和成纖維細胞的培養物和/或二維OD)培養物。在疾病模型中，對照可為健康細胞的培養物。工程化三維肺部模型組織試劑盒優選具有一種或一種以上下列特征-板為96孔板。-板為V形底板或平底板或包含V形底與平底孔的板。U形底板也可應用。-各容器中培養物樣品包含的細胞的量為至少IO3個，優選至少IO4個、更優選至少2X104個、3X104個、4X104個、5X104 個細胞，且至多IO6個，優選至多5X IO5個、4X IO5個、3X IO5個、2X IO5個或至多IO5個細胞。-容器各別或一起密封，且含有富集(X)2的適于肺組織培養物的環境或氣氛。-富集CO2的環境或氣氛包含至少2%、3%、4% CO2 環境，至多10%、9%、8%或 7% CO2 環境，極優選約5% CO2。在優選實施例中，樣品包含測試樣品和相應對照樣品。在優選實施例中，測試樣品存在于V形底板上或存在于板上的V形底孔中，且對照樣品存在于平底板上或存在于板上的平底孔中。定義
在本發明的上下文中，“人工組織骨架”的含義為一種固體支撐材料，其具有特別設計用于和適用于細胞附著和/或輔助組織或細胞培養物中細胞的結構三維布置的結構。 所述人工組織骨架優選在培養組織或細胞前制造且在培養所述組織或細胞前或在此期間與組織或細胞接觸。因此，人工組織骨架通常為通過影響至少一部分細胞相互作用(例如細胞-細胞相互作用)或細胞環境自身，促進例如組織或細胞培養物三維結構等結構形成的細胞生長支撐結構或材料。因此，如果組織骨架從組織或細胞培養物除去，那么組織或細胞培養物將瓦解或變混亂。然而，所屬領域的技術人員應了解，如果人工組織骨架用生物可降解材料制成且其逐漸降解，使得細胞-細胞相互作用形成，那么不認為此為除去組織骨架且此方法中組織或細胞培養物可能不會瓦解或變混亂。在一個型式中，人工組織骨架為三維基質，優選為三維凝膠基質或多孔三維基質， 所述基質優選具有細胞所處的微空間或孔。在一個型式中，人工組織骨架自身為細胞附著在表面上的支撐物，優選為多孔膜支撐物。在骨架的此型式中，其具有特別設計用于以及適用于細胞附著的結構，例如多孔或彎曲或鋸齒狀或槽形表面，細胞附著于此表面，從而促進三維結構的形成。人工組織骨架優選-具有界定的三維結構，-為多孔、優選高度多孔材料或基質，-為多孔膜，-為多孔三維基質，-用生物相容性材料制成，和/或-用聚合物制成?！叭斯そM織骨架”任選為基于多糖的基質，例如其為基于纖維素的基質，例如甲基纖維素基質?！叭斯そM織骨架”任選具有珠粒結構，例如其為賽德斯珠粒(cytodex bead)。在本文中，“不含任何人工組織骨架的三維組織培養物”應理解為具有三維結構的組織培養物，其中所述組織培養物的三維結構是通過內在的細胞-細胞相互作用形成或促成且未得到人工組織骨架幫助。因此，不含任何人工組織骨架的三維組織培養物在缺乏人工組織骨架的情況下未瓦解或變混亂，而是維持其三維結構。即使所述不含任何人工組織骨架的三維組織培養物在固體支撐材料上培養和形成，三維結構的形成也未得到此固體支撐材料幫助且并非歸因于細胞附著于此固體支撐材料，而且其可在不破壞三維結構的情況下分離。如本文所用的“細胞分離”是指組織或細胞培養物的至少兩種類型細胞的空間隔離，從而在此空間隔離(即分離)后，可界定或發現兩種類型細胞的比率不同于分離前培養物同一區域中相同類型細胞的比率和培養物其它區域中相同類型細胞的比率的培養物區域，例如(部分)體積或表面。優選至少兩種類型細胞的表面張力差異顯著促進其活體外分離。例如培養物的某一體積或部分體積或表面或部分表面等區域“富集”某一細胞類型應理解為此區域中某一細胞類型的比率高于參考區域(例如所述培養物的其它區域)中的現象。通常，培養物的區域“富集”為細胞分離的結果。
“發炎”是例如感染和組織損傷等有害刺激物和情況引發的適應性反應。大量細胞因子因加速發炎而統稱為“促炎性細胞因子”，其也直接或通過其誘發某些細胞類型中的細胞粘著分子或其它細胞因子合成的能力調節發炎反應。負責早期反應的主要促炎性細胞因子為ILl-α、ILl-β、IL6和TNF-α。其它促炎性介體包括IFN-γ、 CNTF, TGF-β、IL12、IL17、IL18、IL8 (CXCL8)和多種化學引誘發炎細胞的其它趨化因子以及各種神經調節因子。發炎反應的實際結果是通過促炎性細胞因子與消炎細胞因子(例如 IL4、IL10 和 IL13、IL16、IFN-a、TGF-β、ILlra、G_CSF、針對 TNF 或 IL6 的可溶性受體)之間的均衡來確定。各種卡斯蛋白酶對ILl-β的活化在稱為發炎體的大型多蛋白復合物中進行。LIF、GM_CSF、IL11和OSM為影響發炎過程的其它細胞因子且其可能適用于制備本發明的疾病模型。相反，像ILlO等“消炎細胞因子”調節發炎過程，使其受到抑制或減輕。三維組織的“平均直徑”被視為通過上述方法產生的三維組織直徑的若干測量值的算術平均值。“典型直徑”(中值直徑)為標記既定沉淀物樣品(sediment sample)分成兩個相等重量份的直徑，一重量份含有大于此直徑的所有聚集體且另一重量份含有小于此直徑的所有聚集體。容器“陣列”應理解為布置多個具有相同尺寸、形狀和材料的容器。布置可為例如一連串容器，或容器的二維基質。病毒是感染細胞的專性細胞內病原體，常常對特定細胞類型具有巨大特異性。在 “重組病毒載體”中，病毒生命周期的復制階段所需要的基因缺失且相關基因加入病毒基因組中。重組病毒載體可轉導其通常將感染的細胞類型。為產生所述重組病毒載體，非必要基因經轉導(in trans)提供，整合到包裝細胞系的基因組中或質粒上。已經研發大量病毒， 主要關注4種類型；逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒和單純皰疹病毒1型?！鞍┌Y”是一組細胞顯示不受控制的生長、侵襲(侵入和破壞相鄰組織)且有時顯示轉移(通過淋巴或血液擴散到體內其它位置)的一類疾病。癌癥的這三種惡性特性將其與良性腫瘤區分開，良性腫瘤自我限定，不侵襲或轉移。95%的肺腫瘤為支氣管癌；也為支氣管類癌、間充質、混雜贅生物。“纖維化”是器官或組織中作為修復或反應過程的過量纖維結締組織形成或出現， 與作為器官或組織正常組分的纖維組織形成相反。肺部纖維化是嚴重的慢性疾病，其特征為彈性消失，且肺上皮細胞經間質成肌纖維細胞替換，且肺間質中細胞外基質蛋白沉積，導致肺部結構重塑。


圖1.三維兩種細胞類型微量培養物的結構。SAEC和NHLF細胞分別用CFSE或DiI 的活體染料染色。在M小時培育后?；兊幕蛘咭愿鞣N比率混合的細胞群體且形成聚集體，接著轉移到M孔細胞培養板中供成像。頂行相差顯微影像；中間行熒光顯微影像； 底行共焦影像。SAEC 綠色通道；NHLF 紅色通道。圖2. 50% SAEC和50% NHLF混合物的基于基質膠(Matrigel)的培養物。
圖3.含有不同比率SAEC和NHLF的?；⒘拷M織培養物。歸因于生理學熒光標記物，SAEC細胞在黑色和白色拷貝上為綠色或淡灰色，而NHLF細胞為紅色或暗灰色。圖4a.三維人類肺微量組織中TTF-I的mRNA含量。TTFl轉錄因子是肺泡上皮細胞的特征標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示TTFl表達，但TTFl存在于三維SAEC 單一培養物中且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用。TTl在三維SAEC/NHLF組織中達到最高表達量。圖4b.三維人類肺微量組織中AQP-3水轉運蛋白的mRNA含量。AQ3是肺中ATII 上皮細胞類型標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示AQ3表達，AQ3存在于三維SAEC 單一培養物中且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用，但在三維SAEC/NHLF組織培養物中仍然觀測到最高含量的AQ3。圖5. SAEC分化標記物的基因表達變化。圖A 二維和三維人類肺微量組織中AQP3 水轉運蛋白的相對mRNA含量?；旌霞毎囵B物中相對AQP3表達量相對于僅僅SAEC培養物增加，而二維與三維培養條件之間未檢測到差異。圖B 相較于僅僅SAEC培養物，混合細胞培養物中相對KRT7mRNA表達量增加。(獨立實驗n =幻圖C 二維和三維培養物中 SFTPAl和β -肌動蛋白表達的RT-PCR分析。僅僅在SAEC+NHLF共培養物中檢測到SFTPAl 表達。三維培養物中SFTPAl的表達一致高于二維培養物中。顯示3個獨立實驗的代表性影像。圖D 用NHLF細胞二維或三維共培養72小時后，檢驗FACS分選SAEC的基因表達變化。相較于二維共培養物，三維共培養中再純化的SAEC中分化標記物AQP3和TTF-I的含量顯著上調。所示數據是兩個獨立實驗的平均值。(用于所有實驗中的純化的原代肺細胞是源自隨機供體)。圖6.三維肺組織模型中的EMT標記物。圖A 二維和三維共培養物中S100A4的相對mRNA含量。相較于僅僅SAEC培養物，成纖維細胞的存在顯著減少SAEC-NHLF共培養物中S100A4的含量，而二維或三維培養條件未顯著改變S100A4表達。圖B =E-鈣粘蛋白 (E-cad)的相對mRNA含量在三維培養物中在NHLF存在下增加。圖C 二維和三維人類肺微量組織中N-鈣粘蛋白(N-cad)的相對mRNA含量。圖D 用NHLF細胞二維或三維共培養72 小時后，檢驗FACS分選SAEC的基因表達變化。相較于二維共培養物，分選的肺上皮細胞中 EMT標記物S100A4和E-cad的含量在三維兩種細胞共培養物中增加，而N-cad在三維混合培養物中的表達量低得多。用于實驗中的純化的原代肺細胞是源自隨機供體。所示數據是三個(圖A-圖C)或兩個(圖D)獨立實驗的平均值。用于所有實驗中的純化的原代肺細胞是源自隨機供體。圖7.人類原代肺細胞培養物中發炎性細胞因子和趨化因子的分泌。圖A 在細胞培養上清液中幾乎未檢測到二維和三維NHLF單一培養物的CXCL-8分泌。三維SAEC培養物仍產生CXCL8，不過程度低于二維SAEC培養物。二維共培養物未顯著改變CXCL-8的表達，表明成纖維細胞的存在不能影響細胞因子的表達。在純SAEC和SAEC-NHLF共培養物中CXCL-8表達量在三維組織系統中顯著降低。圖A和B 分別為人類原代肺細胞培養物中 IL-Ib和IL-6mRNA的表達量。相較于二維培養物，三維培養物中發炎性細胞因子IL-Ib和 IL-6的發炎性mRNA含量一致較低。在純成纖維細胞培養物中，未檢測到IL-Ib mRNA表達， 而IL-6含量低得多且表達變化也不太顯著。(另參見表幻圖D 類似于混合細胞培養物樣品，相較于二維培養物中，發炎性細胞因子IL-Ib和IL-6含量在從三維培養物純化的SAEC
16中也顯著減少。所示數據是三個(圖A-圖C)或兩個(圖D)獨立實驗的平均值。用于所有實驗中的純化的原代肺細胞是源自隨機供體。圖8.由SAEC、NHLF和HMVEC組成的三維三種細胞類型微量培養物的結構。SAEC、 NHLF和HMVEC分別用活體染料CFSE、DiI或DiD染色，接著聚集。M小時培育后，自發重排的兩種或三種細胞類型微量培養物小心轉移到M孔細胞培養板中供成像。圖A 兩種細胞類型培養物；圖B 三種細胞類型培養物。頂行相差顯微影像沖間行熒光顯微影像；底行共焦影像。SAEC 綠色通道；NHLF 紅色通道；HMVEC 藍色通道。圖9.三種細胞類型培養物的基因表達變化。圖A 相較于二維培養物，三維培養物中AQP3和KRT7的表達量增加，S100A4和N_cad的表達量減少。圖B 三維SAEC-NHLF兩種細胞類型培養物和SAEC-NHLF-HMVEC三種細胞類型培養物中分子標記物的表達變化的比較。AQP3和E-cad mRNA含量增加，S100A4和N-cad減少，表明三種細胞類型模型中維持組織分化。用于所有實驗中的純化的原代肺細胞是源自隨機供體。圖10. 96孔板中傳遞的測試備用肺組織試劑盒的制備流程圖。圖11 兩種細胞類型模型中腺病毒基因傳遞到SAEC中。圖A =SAEC由于GFP表達而在三維組織模型的表面中呈現綠色。成纖維細胞在聚集前預先用生理學染料染成紅色。圖B =RT-PCR反應證實GFP基因有效傳遞到模型中?？稍谙俨《巨D導的模型培養物中檢測到GFP。
具體實施例方式本發明者建立一種簡單的工程化三維肺部模型組織培養物，其適用作肺組織模型且備用于各種測試方法中。在產生所述模型期間，考慮組織特征的若干方面，包括肺組織類型的主要特征、胚胎肺發育期間細胞類型的相互作用和組織工程化的技術進步。基于骨架的系統和無骨架的系統如本文所述加以測試。對肺組織特異性標記物的分析意外地展示三維無骨架系統顯示與天然肺組織驚人的相似性。在現有技術中，成纖維細胞過度生長在嘗試在模型組織中利用這些類型細胞期間常碰到(US2008/0112890)。按照本文所呈現的結果，可假定所述過度生長的原因為缺乏聚集體的形成。從聚集體離開的細胞可能附著于容器表面，開始繁殖，直到通過其實現接觸性抑制。迄今發展的肺組織模型使用特殊骨架材料且長期地保持培養[尼克爾斯 (Nichols，J.E.)和柯蒂拉(Cortiella J.) 2008]。相比之下，本文所呈現的模型容易處理， 使用簡單的實驗裝置和相對較短的培養時間。此外，無需特別的實驗室設備。本發明的系統適用于人類細胞，包括人類原代細胞和未轉化人類細胞。應了解，在某些系統中，例如基質等骨架是生物可降解的。然而，因為且如果骨架影響或界定組織培養物的結構或形狀，所以且那么這些系統即使在骨架降解后也不應被認為是無骨架系統。此外，在活體外系統中，如本發明中，一般未預期可降解膜會溶解。此外，生物可降解骨架的溶解需要很長時間，遠長于本發明組織培養物的制備和使用時間。不為去分化細胞的細胞也可應用在本發明中，然而細胞數目應很小。因此，此實施例主要適用于少量細胞足夠用于計劃測試，例如測試足夠敏感的情況下。在快速測試中，可從純化的分化細胞開始制備本發明的模型組織培養物。所述細胞可從個體新鮮制得。此型式的方法尤其適用于例如藥物或化合物的患者特異性測試，或活性劑的作用有待在特定疾病背景(例如針對潛在制造商)中測試的情況。原代細胞也可從商業來源獲得。例如小勒尚工業園龍沙韋爾維耶有限公司(Lonza Verviers, S. p. r. 1. Pare Industriel de Petit-Rechain),比禾Ij時(Belgium)韋爾維耳口 B-4800 ；生物中心有限公司(Biocenter Ltd.)，塞格德(Szeged)塔梅斯瓦利(Temesvari krt.) 62H-6726，英杰公司(Invitrogen Corporation)(生命技術公司(Life Technologies Corporation)(美國(USA)加利福尼亞(California)卡爾斯巴德(Carlsbad)范艾倫路 (Van Allen Way) 5791,92008)的一部分)。如果需要大量樣品，那么細胞有待在制備模型組織培養物樣品前繁殖。在此過程期間，可能出現去分化。此為篩選(例如HTS)應用中的情況。在患者特異性測試中，較少量的樣品即足夠。當細胞在聚集體中分化時，繁殖減慢或停止，此后聚集體未顯著增加。如果少量樣品即足夠，那么無需預先繁殖。通常，這種情況可能發生在針對幾種藥物的患者樣品測試中或有待觀測例如信號傳導過程等某些現象的情況下。然而，在篩選過程中，需要大量樣品并應在制備模型組織培養物前繁殖細胞。在本發明的優選實施例中，使用成人去分化上皮細胞。所屬領域中并不知道在成纖維細胞存在下簡單共培養的成人去分化上皮細胞能夠實現分化，而此情況在三維條件下，尤其在適于形成三維聚集體的條件下進一步增加。因此，在一個優選實施例中，模型組織培養物制備從去分化細胞開始。保持在例如二維組織培養物等培養物中的原代細胞將顯示某些去分化標記物。因此，所述細胞也可應用在本發明中。去分化標記物包括S100A4、N-鈣粘蛋白和發炎標記物。 從而可應用較大量的細胞。在加入組織組分和/或因子后，可使多能或未分化細胞能夠分化。肺組織內的細胞相互作用細胞去分化和再分化干細胞與組織特異性祖細胞可進行組織特異性分化的定向步驟，因此代表產生器官特異性組織培養材料的理想來源。遺憾的是，這兩種細胞類型在分化組織中只可以有限數目使用。因為組織模型需要根據實驗和/或測試要求定期建立，所以組織特異性分化細胞代表更好的原材料來源，這只是因為其更多。本發明的模型系統至少部分利用分化細胞在二維培養條件下可去分化且使用適當的培養條件可迫使其再分化的現象。細胞相互作用肺發育以及上皮損傷修復通過似乎共同調節肺中干細胞和成人祖細胞的功能的刺激基因與抑制基因之間的精密平衡來緊密協調。舉例來說，FGF受體酪氨酸激酶信號傳導對呼吸器官形成來說不可或缺，且通過誘導性FGF路徑抑制劑家族反向調節(張ahang)， 斯塔彭貝克(Mappenbeck)等人，200 。另外，FGF信號傳導為形成新的肺泡、保護肺泡上皮細胞免受損傷以及肺修復期間假定肺泡干細胞/祖細胞遷移和增殖所需。反之，通過Smad 2、3和4的TGF β受體絲氨酸-蘇氨酸激酶信號傳導抑制肺形態形成，且可抑制出生后肺泡發育，而通過Smad3的過度TGF β信號傳導則會引起間質性纖維化。因此，需要具有間充質細胞與上皮細胞之間的相互作用的更復雜的交互系統。本發明者假設基本肺模型可通過使用純化的肺泡上皮細胞與成纖維細胞的混合物產生。因此，最初僅僅使用兩種細胞類型原代人類成纖維細胞(NHLF)和小氣道上皮細胞(具有ATII特征的SAEC)，兩者都可購得(龍沙公司(Lonza))。意外地發現此兩種細胞類型足夠提供形成三維肺組織模型的必需因子。所屬領域的技術人員應了解，通過加入其它細胞類型，例如本文中列出的細胞類型，可進一步發展此模型?；旌吓囵B物中細胞類型的分離(分選)顯微鏡檢查證明，自發的組織改組-“分選”-發生在三維肺原代細胞培養物中。本發明者在本文中使用簡單的離心方法使細胞聚集，類似于制備胎胸腺器官培養物的方法。 [海耳(Hare，K. J.)等人(1999)]本文提供的證據證明，原代肺部上皮細胞與成纖維細胞的三維共培養比二維或三維活體外單一培養物中更有利于SAEC維持更多分化的狀態。包括NHLF不僅促進上皮細胞分化，而且相較于僅僅SAEC (圖幻或SAEC_HMVEC(圖8a)培養物，三維微量組織的粘著和結構堅固致密得多。由人類小氣道上皮細胞(SAEC)和正常人類肺成纖維細胞(NHLF)組成的本發明兩種細胞類型共培養物系統無需存在外部加入的ECM來形成和維持三維結構(圖3)。?；瘑渭毎愋秃透鞣N比率的細胞混合物的SAEC和NHLF細胞懸浮液顯示，建立肺部微量組織需要存在成纖維細胞來維持致密穩定的三維結構(圖3)。三維微量組織的形態學檢查顯示，混合培養物中兩種細胞類型的分離是三維微量組織的特征，成纖維細胞形成內部核心部分，而上皮細胞覆蓋外層(圖幻。分離或“分選”現象是基于細胞類型的不同粘著能量特征且先前并未針對原代人類肺組織描述。自發細胞“分選”是基于不同細胞類型之間粘合力的差異肺部微量組織的最粘合核心或中心區域由NHLF群體形成，NHLF群體被不太粘合的SAEC圍繞。尤其關注原代分化的人類肺組織中的分離過程，因為此想法的基礎為即使分化的人類成人細胞也維持其主動探究其自身微環境的能力。三維共培養物中的細胞能夠與相鄰的細胞交換位置，因此在結構上使組織改組。此過程也需要細胞外基質的改組。對三維微量組織模型中各種SAEC/NHLF比率的模型的研究顯示，1 1比率足以使上皮細胞覆蓋成纖維細胞的內部核心，因此使用1 1設置進一步分析此模型。然而，模型可按其它上皮細胞-間充質細胞比率使用。足以完全覆蓋的比率可在某種程度上視細胞類型而變化。不受理論束縛，本發明者認為本發明模型中細胞的分離是歸因于細胞類型的粘合性不同，其中其表面張力的差異起重要作用。任何細胞都會主動探究其自身的微環境，其能夠與相鄰的細胞交換位置或改組其附近的細胞外基質。已知后一過程涉及機械牽引力與基質金屬蛋白酶(MMP)的酶活性?；诓煌恼持芰刻卣?，實驗上已知混合細胞類型的某些細胞組合物可呈聚集體形式分
1 O在懸滴培養物的分離的細胞聚集體中，最粘合的群體占據中心區域，被不太粘合的群體圍繞。組織粘合性的量度是細胞的表面張力。因此，作為在實驗上可檢測的量，表面張力可預測分選層次。因此，所屬領域中早期嘗試通過此分選層次可在一定程度上預測是否包含新的細胞類型(內亞古(Neagu)，2006)。
然而，并不知道人類肺的特定細胞類型的表面張力因子?，F有技術完全沒有提到組織分選的現象是發生在其它培養物中還是僅僅發生在懸滴培養物中。本發明者通過實驗確定，在本文中首次顯示意外地，上皮細胞與成纖維細胞的分離發生在?；幕旌戏闻萆掀ぜ毎统衫w維細胞培養物中。微聚集體的尺寸和結構本發明者意外地發現，即使非常小也具有結構的聚集體顯示組織特征，因此適于研究相互作用且測試化合物或環境影響。小聚集體具有若干優點，例如，無需特別的反應容器，其尺寸和不同細胞類型的比率可再現，從而更易于控制相互作用。在小聚集體中，幾乎不可能發生組織聚集體的內部部分壞死。此外，可實現驚人均勻的粒度分布，此使其非常適于平行測試。因此，優選地，根據本發明，聚集體的尺寸應保持為小的，只要呈現組織特征，從而可檢驗相互作用即可。如果聚集體過小，那么如本文所揭示的正確形態可能不能成形，且聚集體可能不具有類組織特征。如果聚集體過大，那么其尺寸可能基本上偏離平均值。此外，壞死可能發生在聚集體內部，原因是培養時間較長且聚集體灌注較少。在缺乏特定添加劑，例如只接收細胞培養基的情況下，聚集體的生長通過細胞的接觸性抑制來控制。然而，尺寸取決于聚集體中的細胞數目。所屬領域的技術人員應了解，聚集體的尺寸和細胞數目可在本文給出的界限內變化，只要符合上述要求即可。已經發現加入內皮細胞不顯著改變聚集體的尺寸。適用于本發明的細胞類型成纖維細胞成纖維細胞是結締組織細胞家族中最萬能的細胞，且其實際上是最普遍存在的細胞類型。成纖維細胞是組織完整性的重要結構成分。其參與包括肺在內幾乎每個人類組織和器官的修復和再生過程。其主要功能是分泌向例如上皮細胞遷移等正常修復事件提供組織骨架的細胞外基質(ECM)蛋白。成纖維細胞或其不同亞群執行作為免疫調節細胞的組織特異性功能，分泌能夠通過吸引發炎細胞和免疫細胞引發免疫反應的趨化因子和細胞因子。來自不同解剖位置的成纖維細胞顯示一系列常見表型屬性。然而，不同解剖位置的成纖維細胞顯示不同表型。成纖維細胞生長因子和受體的特征表達也是肺部成纖維細胞的特征[莫勒魯斯(De Moerlooze)，斯潘塞·迪恩(Spencer-Dene)等人 Q000)]。本發明者發現，可依賴于成纖維細胞生理學，建立無人工組織骨架的組織系統來模擬遠端肺組織的一些方面，且基于人工基質的模型未必為建立三維肺部培養物的必由之路。不受理論束縛，本發明者假定肺中成纖維細胞分泌ECM的事實有助于實現此結果。肺部上皮細胞(肺細胞)肺細胞(肺部或肺泡上皮細胞或AEC)是襯在正常肺泡基底膜(即肺遠端氣道內的周圍氣體交換區)內的上皮細胞。肺細胞或AEC可再分成I型和II型肺細胞。兩種肺泡上皮細胞類型的特征標記物容易追蹤，且可在實驗期間，例如使用 RT-PCR反應或免疫組織化學監測。
1型肺細胞1型肺細胞[肺泡1型肺細胞、1型肺泡細胞、肺泡1型細胞(縮寫ATI細胞)，也稱為小肺泡細胞、鱗狀肺泡細胞、膜肺細胞或1型肺泡上皮細胞]是具有多個表示肺泡中氣體交換表面的細胞質板的復合分支細胞。這些細胞具有代謝活性且具有針對多種物質，包括細胞外基質(ECM)蛋白、生長因子和細胞因子的細胞表面受體。約95%肺泡表面被I型肺細胞覆蓋。2型肺細胞2型肺細胞(肺泡2型肺細胞、肺泡2型細胞；縮寫ATII細胞、T2P)為立方形上皮細胞，也稱為2型肺泡上皮細胞(縮寫AEC，也稱為EPII細胞)、2型顆粒狀肺細胞、2型細胞、2型肺泡細胞、隔細胞或大肺泡細胞(great alveolar cell)、大型肺泡細胞(large alveolar cell)或顆粒狀肺細胞。這些細胞由未成熟的上皮細胞祖細胞產生。肺泡2型肺細胞被認為是肺泡上皮細胞的祖細胞。其能夠自我更新并分化成鱗狀1型肺細胞。II型細胞為立方形細胞，其僅僅占肺泡表面積的4%，但構成肺泡上皮細胞的60%和所有肺細胞的 10% -15% (克拉波(Crapo)等人，1982)。3型肺泡上皮細胞3型肺泡上皮細胞與扁平1型細胞和立方形2型細胞的不同之處在于其存在微絨毛頂束且缺乏薄片型分泌顆粒。這些細胞也稱為肺泡刷細胞。內皮細胞內皮細胞為呈單一鱗片狀上皮細胞層，襯在所有血管管腔內的長方形細胞。其來源于血管母細胞和成血管細胞。巨噬細胞巨噬細胞是來源于骨髓源性單核細胞的細胞(骨髓源性巨噬細胞)，其最終遷入組織中。巨噬細胞從骨髓中單能和雙能祖細胞的分化受多種細胞因子控制。其它分化發生在組織中且所得巨噬細胞群體稱為定居巨噬細胞。肥大細胞肥大細胞由骨髓中的多能CD34⑴前驅細胞產生(中幡(Nakahata)和徹 (Toru) 2002 ；奧斯丁(Austen)和博伊斯(Boyce)，2001)。未成熟的肥大細胞在遷入組織中時采取其典型的顆粒形態。這些細胞也表達Fc- ε Rl且停止表達⑶34和Fc- y R2。肺和腸粘膜中大部分肥大細胞僅僅產生類胰蛋白酶(稱為MCT)或僅僅產生胃促胰酶。肥大細胞在速發型過敏反應中通過釋放有效的介體起著重要作用。平滑肌細胞平滑肌細胞是高度專化的多功能可收縮細胞，其短暫(可逆收縮)或長期(歸因于纖維化和肌肉過度生長)調節中空器官的管腔。平滑肌細胞在血管發生中起重要作用， 且使血管壁成形并維持血管緊張度。其它細胞下的觀測加入內皮細胞可產生包含分化細胞的穩定聚集體。如基于表達的標記物所發現， 如果內皮細胞包括在模型組織培養物內，那么分化度不會降低。似乎這些聚集體維持一種層狀結構，其中內皮細胞位于內部。實施例
制備三維模型組織培養物在本發明的方法中，使用至少肺部上皮細胞和間充質細胞，優選成纖維細胞。細胞各別培養，以獲得活的培養物，接著以適當比率混合，且在(X)2存在下在如基于本發明和所屬領域方法所了解的適當條件下共培養。通過設定細胞比率和選擇條件，可避免一種細胞類型相對于另一種細胞類型過度生長。在一個優選實施例中，所述細胞從人類個體作為原代細胞獲得，且去分化或立即使用。去分化可例如通過已知方法(傳代、除去其它細胞類型、加入生長因子)進行。如果細胞能夠匯合，那么認為其去分化。?；才囵B的細胞混合物是建立細胞-細胞接觸且使細胞之間存在適當距離的重要步驟。?；毎淖畋憷绞绞菓秒x心。所屬領域的技術人員基于本文提供的教示， 能夠選擇合適的?；椒?。在本發明的模型中，原則上，可使用任何上文所列的細胞，獲得接近天然肺組織的肺模型組織。所應用的每一種細胞類型必須能夠在適用于獲得如本文所揭示的三維模型組織的條件下生長且能夠與模型的其它細胞類型結合。這些因子應在初步實驗中測試。最初宜應用相對較小比率的其它細胞，接著其它細胞類型的比率可增加，通常直到比率類似于活體內比率。在優選實施例中，可包括在模型內的其它細胞類型為例如內皮細胞和平滑肌細胞。疾病模型基于以上模型且使用各種基因傳遞方法以及可變靶基因，以上系統容易適于研究肺部疾病期間的基因變化，從而可鑒別新的藥物靶和發展新的療法其中疾病包含發炎，受影響細胞、優選上皮細胞表達發炎性細胞因子(超過正常含量)，且模型為發炎模型，其中疾病為腫瘤，細胞為轉化、例如惡性轉化或永生細胞，且模型為腫瘤模型，其中疾病包含纖維化，且模型為纖維化模型，其中疾病包含組織損傷，且模型為再生模型。疾病模型可用于藥物測試。從患者獲得的細胞在一個實施例中，肺部細胞從患者獲得，且根據本發明培養。在此實施例中，優選未去分化或僅僅部分去分化。此后，以迅速制備方法，形成三維模型組織培養物，且測試提議用于治療所述患者的藥物，或可測試計劃的治療方案。此實施例的優點尤其為可制備具有均一組成和尺寸的純且平行的樣品培養物。所述樣品也不含任何病原體且可按需要純化。從健康細胞制備的模型在一個優選實施例中，疾病模型從健康細胞開始來制備，隨后加入實現細胞中疾病特征(癥狀)的因子。舉例來說，腫瘤模型由健康細胞制備，且加入實現惡性轉化的因子，和/或在其中表達引起惡性轉化的基因。觀測到在肺部腫瘤組織中例如Wnt5等Wnt蛋白質的含量增加。 因此，預期腫瘤模型可通過加入如EGF(上皮生長因子)、IGF(胰島素樣生長因子)、胰島素、
22Wnt因子(例如Wnt5)或其混合物等致瘤因子到本發明的細胞混合物或培養物中來制備。在此方法的一個替代性方法中，腫瘤細胞加入培養基中，所述培養基中存在根據本發明的模型培養物，但其通過半透膜分離。從而腫瘤細胞產生的因子誘發本發明培養細胞的腫瘤(惡性)轉變。用肺腫瘤細胞系制成的肺腫瘤模型肺腫瘤模型可由肺腫瘤細胞系制備。所述細胞系容易在美國模式培養物保藏所 (American Type Culture Collection) (ATCC ；馬里蘭州羅克維爾市(Rockville，MD))在搜尋腫瘤細胞系時獲得。明智地，進行尋找適于培養細胞的條件且最佳化細胞混合物中所用細胞類型的比率的實驗。發炎模型對于發炎模型，優選在制備過程期間，單核細胞和/或巨噬細胞可加入本發明的模型培養物中。在此模型中，宜用LPS或WNT5A預處理?；罨木奘杉毎募毎蜃拥漠a生以及如Wnt5等其它因子的產生影響組織培養物且賦予發炎模型能力。如果欲檢驗發炎模型系統，那么可提供在適當腔室中通過膜與肺部聚集體分離的中性粒細胞。在此情況下，也可測量中性粒細胞的遷移和MMP的產生。在一個替代性實施例中，疾病模型肺部細胞系根據本發明培養。在此實施例中，可測試藥物針對所述疾病的效率。在所述疾病模型中，應避免使用過度表達基因，更確切些說，應使用誘導型啟動子。來自天然三維肺部細胞聚集體的發炎模型為模擬發炎病狀，天然三維肺部細胞聚集體可用引起發炎反應的各種物質處理。所述物質為例如引起急性發炎的化學物質，例如血管活性胺、類二十烷酸等。促炎性多肽，例如生長因子、水解酶等?；钚匝?，促炎性細胞因子，例如IFN-Y和其它細胞因子，細菌細胞壁提取物。發炎病狀通過例如用生物化學分析、免疫學分析(例如ELISA)、基于PCR的方法 (例如實時PCR)或表達分析(例如應用基因芯片)檢測細胞因子表達來測試。原代細胞的遺傳修飾上皮細胞與間充質細胞可使用重組病毒傳遞載體(重組腺病毒和重組慢病毒載體)進行遺傳修飾，這些基因傳遞方法不損害細胞聚集的能力。發炎、腫瘤、纖維化和再生的特征基因可組成性或誘導性過度表達或沉默，且可在三維微環境中研究組織形態、細胞反應、基因和蛋白質表達變化。舉例來說，已知促進腫瘤形成的一種或一種以上基因可引入肺部細胞系，例如肺泡I型或II型細胞系，優選II型細胞系中，或引入成纖維細胞系中。此類基因可例如為例如ras基因等致癌基因或例如C0X-2基因等代表腫瘤表達模式的基因或一組基因?？赡軉为歳as基因表達不足以轉化細胞，優選永生細胞，但增殖可能增加[王(Wang，XQ)，李(Li， H)等人O009)]，此結果可提供模型的一個疾病特征。使用經遺傳修飾且經亞致死照射的細胞系改變原代細胞聚集體中分泌因子組成在此實施例中，所有細胞類型均未感染，因此基因表達與任何既定三維肺組織模型中一樣正常。然而，聚集體的細胞組成含有經亞致死照射的細胞(聚集體全部細胞數目的5-10% )_成纖維細胞(WI-38)或肺泡上皮細胞(AM9)系或兩者，這些細胞經遺傳修飾且產生改變聚集體內細胞微環境的分泌因子(Wnt-s、骨形態形成蛋白(BMP)-s、發炎性和促炎性細胞因子、生長因子等)。亞致死照射可減少細胞繁殖并防止一種細胞類型相對于其它細胞類型過度生長。產品本發明也提供一種包含三維模型組織培養物的多個樣品的試劑盒。容器優選為例如96孔板或384孔板等板的孔。三維模型組織可為健康組織模型或疾病模型(疾病模型試劑盒)。板宜包含容器或孔的陣列，其中多個容器含有一種或一種以上類型工程化三維肺部模型組織培養物的樣品于適當培養基中。容器可為例如平底、U形底或優選V形底容器，在允許平行測試多個樣品的板上。容器優選為未經組織培養物處理的容器，以避免細胞粘到容器壁。在一個優選實施例中，每一容器包含單一聚集體。在一個優選實施例中，每一容器中的培養物樣品包含如發明內容中所界定的量的細胞。優選地，容器各別或一起密封，且含有如發明內容中所界定的富集CO2的適于肺組織培養物的環境或氣氛。疾病模型通常需要相同環境。細胞優選用適于報道一種或一種以上下列細胞特征的生物相容性染料染色細胞狀態，例如細胞分裂時相(cell phase)、細胞活力、細胞的凋亡或瀕死狀態；細胞類型；細胞位置；惡性轉化；發炎。對照作為對照樣品，試劑盒含有僅僅上皮細胞和成纖維細胞的培養物。在板上，優選存在至少3個-3個孔對照(分別是上皮細胞和成纖維細胞)。作為二維肺組織的另一對照優選用以鑒別或評估三維組織特異性特征。因此，需要時，可包括二維對照板(優選平底粘著組織培養板)伴隨三維組織?；蛘?，板也可含有作為對照的二維肺組織的孔，所述組織優選在平底孔中。因此，在本發明的一個實施例中，使用含有用于三維組織的V形底孔與用于二維組織的平底或U形底孔的板。實例實例1-材料與方法原代SAEC、NHLF和肺部HMVEC細胞從龍沙公司(Lonza)購得。所有細胞類型都是從不同性別和年齡的多個隨機供體的肺分離。如制造商所建議，分別使用SAGM、FGM或 EGM-2培養基進行SAEC、NHLF或肺部HMVEC的初始擴增。所有類型的細胞培養物都在含有5% CO2的氣氛中于37°C下培育。對于二維和三維培養，純或混合細胞群體在SAGM(小氣道生長培養基，龍沙公司(Lonza))與完全DMEM的50%-50%混合物中培養。對于含有HMVEC 細胞的兩種細胞和三種細胞培養物，HMVEC細胞的適當生長因子補充物加入SAGM與DMEM 的50%-50%混合物中。細胞培養基的組合物根據制造商的說明書制備。對于二維和三維培養，細胞以所指示的比率混合并分別分配到平底6孔板或96孔V形底板(薩爾施泰特 (Sarstedt))上。V形底板在細胞接種后于室溫下以600Xg立即離心10分鐘。SAEC和NHLF用下列熒光生理學染料染色Dil [霍尼格(Honig，Μ. G.)和休姆 (R. I. Hume) (1989)]和 CFSE [王(Wang，X. Q.)，段(X. M. Duan)等人(2005)]，其能夠跟蹤培養過程中細胞的運動。有或者沒有基質膠的細胞吸移入未經組織培養物處理的V形底96 孔板中，并在CO2培育箱中于37°C下培育1小時。培育后，細胞在室溫下以2000rpm?；? 分鐘，接著所得細胞團培育過夜(5% CO2, 370C )。1972年，杰勒德(D. J. Giard)等人(1973)通過對來自58歲男子的肺癌組織進行外植體培養，首創A549細胞系。A549細胞是腺癌人類肺泡基底上皮細胞。A549細胞歸入上皮細胞的鱗狀分支。在以上培養基中以2X IO4個細胞/平方厘米的濃度接種的細胞將在5天內100%匯合。A549細胞可從美國模式培養物保藏所(ATCC ；馬里蘭州羅克維爾市(Rockville， MD))作為CCL-185獲得，并可生長在具有10%胎牛血清(FCS ；吉布公司(GIBCO BRL))的漢姆F-12培養基(Ham' s F-12medium)(吉布公司(GIBCO BRL)，紐約州格蘭德島市(Grand Island, NY))中或根據供應商的建議生長。1962年，從取自約3個月胎齡的治療性流產胎兒的肺組織發展WI-38細胞系。胰蛋白酶消化肺組織所釋放的細胞用于原代培養物。細胞形態類似于成纖維細胞。染色體組型為46，XX;正常二倍體女性。從瑞普斯托庫(Itepository)獲得此培養物的最大壽命為50 群體倍增次數。回收后獲得86%的胸苷標記指數。G6PD為B型同功酶。WI-38的此培養物從獲自呈送者的第9代冷凍細胞擴增?？蓮拿绹Ｊ脚囵B物保藏所(ATCC;馬里蘭州羅克維爾市(Rockville，MD)) http//www. atcc. org/ATCCAdvancedCatalogSearch/tabid/112/Default.aspx 作為 CCL-75獲得的WI-38細胞根據供應商的建議生長。CL13或CL30細胞(沃德洛(Wardlaw)等人，2002)在含有5%胎牛血清和25% 微克/毫升慶大霉素(gentamicin)的杜爾貝科改良伊格爾/F12培養基(Dulbecco’ s modified Eagles/F12medium)中培養。人類細胞優選維持在37°C下按需要含有(X)2的潮濕空氣中。熒光和共焦顯微術二維和三維培養前，SAEC, NHLF和HMVEC分別用熒光生理學染料CFSE、DiI和 DiD (都從分子探針公司(Molecular Probes)獲得)染色。細胞在PBS中洗滌兩次，并在 37°C下以0. 5 μ g/ml的濃度與CFSE, DiI或DiD 一起培育10分鐘。通過用DMEM+10% FCS 洗滌細胞來除去過量的染料。二維和三維培養物使用熒光標記的細胞，如先前所指示來制備。培育過夜后，小心地從V形底板除去三維細胞培養物，并轉移到底部為蓋玻片的盤子 (馬泰克(MatTek))中。通過熒光顯微術(奧林帕斯(Olympus)IX-Sl顯微鏡)或共焦顯微術(奧林帕斯(01ympUS)FV1000共焦成像系統)研究肺組織微量培養物。
細胞分選根據制造商的說明書(分子探針公司(Molecular probes))，SAEC和NHLF用CFSE 和DiI染色?；旌霞毎⒃诙S和三維系統中培養72小時。染色細胞通過輕度胰蛋白酶處理， 接著PBS+EDTA處理來解離。解離的細胞使用BD FACSVantage細胞分選儀分選到具有用于制備mRNA的裂解緩沖液的管(美天旎生物科技(Miltenyi Biotech))中。cDNA 合成和定量 RT-PCR總RNA是從二維和三維細胞培養物通過使用紐斯潘(NucIeoSpin)RNAII試劑盒 (麥歇瑞-納吉爾(Machery-Nagel))進行柱上脫氧核糖核酸酶消化來制備。信使RNA是從分選的SAEC樣品使用μ MACS mRNA分離系統(美天旎生物技術(Miltenyi Biotech))制備。cDNA是從RNA樣品使用MMuLV逆轉錄酶試劑盒(賽默飛科技(Thermo Scientific)) 制備。實時定量PCR檢查是使用ABsolute QPCR SYBR Green Low ROX母混合物(阿吉英 (ABGene))和應用生物系統 7500 熱循環系統(Applied Biosystems 7500thermal cycler system)進行。引物列于表1中。重組腺病毒載體完全相關基因或僅僅GFP序列通過PCR反應，使用正向(5' ) 5' 一3'、反向 (3' ) 5' -3'引物序列擴增，并克隆到穿梭載體中，接著通過同源重組克隆到腺病毒載體中。腺病毒通過使用脂染胺2000(LipOfectamine 2000)(英杰(Invitrogen))轉染線性化質粒DNA到四3包裝細胞系(美國模式培養物保藏所，馬里蘭州羅克維爾市(Rockville， MD))中來產生。所得菌斑擴大，使用腺病毒純化試劑盒(BD生物科學(BD Biosciences)純化和濃縮腺病毒。上皮細胞的腺病毒感染含有GFP或相關基因-GFP的腺病毒加入二維或三維中的SAEC中。在37°C下 1 X IO6個細胞再懸浮于250 μ 1細胞培養基和50 μ 1病毒中并保持90分鐘。表 1
縮寫寄存編號產物長度官方基因名稱正向引物序列反向引物序列AQP3智人水通道蛋P 3004925AGCCCCTTCAGGATTTCCAGACCCAAATTCCGGTTCCA86AQP4智人水通道蛋白4001650GCGAGGACAGCTCCTATGATACTGGTGCCAGCATGAATC110AQP5智人水通道蛋白5001651CCTTGCGGTGGTCATGAATGGGGCCCTACCCAGAAAAC61E-cad智人鈣粘蛋白1004360GACCGGTGCAATCTTCAAATTG ACGCCG AG AG CTACAC93IL-Ib智人白細胞間介素ip000576TCAGCCAATCTTCATTGCTCAATGGCGAGCTCAGGTACTTCTG62IL-6智人白細胞間介素6000600AGGGCTCTTCGGCAAATGTAGAAGGAATGCCCATTAACAACAA62KRT7智人角蛋白7005556CCACCCACAATCACAAGAAGATTTCACTTTCCAGACTGTCTCACTGTCT78N-cad智人鈣粘蛋白2001792AGCTTCTCACGGC ATACACCGTGCATGAAGGACAGCCTCT133S100A4智人S100鈣結合蛋白A4002961TGGAGAAGGCCCTGCCCTCTTTGCCCGAGTACTTG58SFTPAl智人表面活性蛋白Al005411CCCCTTGTCTGCAGGATTTATCCCTGGAGAGTGTGGAGA128SFTPB智人表面活性蛋白BNM198843GCACTTTAAAGGACGGTGTCTTGATGCCCACACCACCTG128SFTPC智人表面活性蛋白CNM_003018AAAGTCCACAACTTCCAGATGGACCTGGCCCAGCTTAGACGTA73TTF-I智人NK2同源框1 (NKX2.1)NM_003317CATGTCGATGAGTCCAAAGCAGCCCACTTTCTTGTAGCTTTCC85CXCL-8 分析法二維和三維細胞培養物上清液的CXCL-8 (IL_8)含量用奎因(Quantikine) CXCL-8/IL-8ELISA試劑盒(安迪生物(R&D Systems))測量。夾心ELISA分析法根據制造商的說明書進行。簡單地說，同等稀釋的細胞培養物上清液樣品和CXCL-8標準品分配到預先涂有抗CXCL-8單克隆抗體的孔上。在室溫下培育2小時后，用所提供的洗滌緩沖液洗滌板4次。接著加入HRPO結合的多克隆抗CXCL-8抗體，保持1小時。最后洗滌步驟后，TMB底物溶液加入孔中。光學密度用iEMS讀數器MF(熱電雷勃(Thermo Labsystems))在450nm 和570nm下測定，并使用阿森特軟件(Ascent software)分析數據。數據定量定量實時RT-PCR數據通過如應用生物系統公司(Applied Biosystems)所提出的 δ Ct(dCt)和相對量(RQ)方法，使用7500系統SDS軟件來分析。所有樣品都建立一式兩份。簡單地說，使用通過7500系統SDS軟件測定的自動閾值水平(threshold level)，測定各樣品的Ct值。SCt(dCt)值根據下式確定dCt (靶基因)=Ct (靶基因)-Ct (管家基因)?；虮磉_的變化顯示為RQ值，所述值使用下式計算RQ = 2_ddct，其中 ddCt 值按 ddCt = dCt (樣品)-dCt (參考樣品)計算。通過比較OD與由7種在31.2-2000pg/ml CXCL-8范圍內的不同濃度計算的標準曲線，確定細胞培養物上清液的CXCL-8含量。樣品分配一式兩份且平均值用于進一步數據分析。實例2-發展三維肺組織樽型的實騎懸滴模型為模擬人類肺結構，從100000個細胞的三維細胞聚集體開始，這些細胞含有大致等量的不同成纖維細胞(NHLF)和小氣道上皮細胞群體(SAEC)，隨機互相混合。在以懸滴分析法培育的一天內，細胞產生稀疏的組織結構。圖1顯示50% SAEC與50% NHLF混合物的懸滴培養物。然而，這一形成不穩定，并且不能在對組織結構不造成無法挽救的損害的情況下將產生的微量組織從初始培養條件轉移到另一個測試板。含有基質膠的?；Ｐ蜑楦倪M混合的肺微量組織的穩定性，?；? 1比率的SAEC與NHLF并使其在基質膠存在下生長。許多三維肺和其它組織模型使用基質膠來建立可使各種細胞類型生長并彼此相互作用的三維結構。SAEC和NHLF用能夠跟蹤培養過程中細胞運動的熒光生理學染料 Dil (霍尼格(Honig)和休姆(Hume), 1989)和 CFSE (王(Wang)，段(Duan)等人，2005)染色。細胞和基質膠吸移入未經組織培養物處理的V形底96孔板中，并置于37°C下(X)2培育箱中1小時。培育后，細胞在室溫下以2000rpm粒化5分鐘，接著所得細胞團培育過夜(5% CO2, 370C )。圖2顯示50% SAEC與50% NHLF混合物的基于基質膠的培養物。很明顯，盡管存在基質膠，SAEC和NHLF還是不能形成穩定的三維結構。此外，似乎主要含有上皮細胞的小球形組織結構離開組織/基質膠塊狀物。實例3-無人工組織骨架的?；Ｐ妥鳛槟M人類肺的三維培養條件的下一步，在無基質膠的情況下分兩個階段粒化同等數目的上皮細胞(SAEC)與成纖維細胞(NHLF)的隨機混合物。細胞吸移入未經組織培養物處理的V形底96孔板中，并置于37°C下CO2培育箱中1小時。培育后，細胞在室溫下以2000rpm粒化5分鐘，接著所得細胞團培育過夜(5% CO2, 37°C )。混合培養前的細胞使用生理學螢光染料Dil (DMS0中lmg/ml原液)和CFSE (DMS0中lmg/ml原液)在PBS (磷酸鹽緩沖生理鹽水，PH 7. 2)中的1 1000稀釋液染色。在這些培養條件下，細胞形成穩定聚集體，其中最粘的成纖維細胞(紅色或暗灰色)被不太粘的上皮細胞類型細胞(綠色或淡灰色)圍繞(圖3)。聚集體直徑為約200 μ m。在另一個實驗中，有組織地改變SAEC與NHLF細胞的比率，并分別使用下列 SAEC NHLF 比率制備培養物0%/100%;25%/75%、50%/50%、75%/25%、100%/0%， 其它方面如上所述。圖3顯示含有不同比率的SAEC與NHLF的粒化微量組織培養物。如圖所證明，當應用等量的上皮細胞與成纖維細胞時，形成具有表面上皮細胞襯里的最顯著三維結構聚集體，在25% /75%的比率下聚集體具有清楚的上皮細胞襯里，不過略小且形態不太令人信服，而在SAEC細胞過量時，即當細胞上皮細胞與成纖維細胞的比率為75% /25% 時，形成平坦得多的上皮細胞襯里。純培養物不形成三維結構的聚集體(上皮細胞)或者聚集體尺寸小得多(成纖維細胞)。輔丨丨4- f碰爾ΦΜ胞肩Ξ細市_卿白分化標記物模型的分子表征是使用實時PCR分析，基于上皮細胞分化標記物。mRNA從細胞聚集體純化并產生cDNA。使用TTFl (圖如)、AQ3 (圖4b)和AQ5特異性引物，相對于作為內部對照的肌動蛋白分析結果。圖4a.指示三維人類肺微量組織中TTF-I的mRNA含量。TTFl轉錄因子是肺泡上皮細胞的特征標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示TTFl表達，但TTFl存在于三維 SAEC單一培養物中且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用。TTl 在三維SAEC/NHLF組織中達到最高表達量。圖4b.顯示三維人類肺微量組織中AQP-3水轉運蛋白的mRNA含量。AQ3是肺中 ATII上皮細胞類型標記物。雖然三維成纖維細胞培養物未顯示AQ3表達，AQ3存在于三維 SAEC單一培養物中且在二維SAEC/NHLF共培養物中增加，表明成纖維細胞的有益作用，但在三維SAEC/NHLF組織培養物中仍然觀測到最高含量的AQ3。因此，以上標記物表明ATII型分化的誘導性增加，此增加可由ATI型標記物表達未增加進一步證實。用于實驗中的純化的分化細胞類型從商業來源獲得。雖然這些細胞類型來源于分化組織，但其一旦純化并保持在二維培養條件下，則如S100A4含量增加所指示，細胞幾乎立即顯示去分化跡象(圖6和表2)。一旦SAEC與 NHLF共培養，則S100A4和N-鈣粘蛋白含量顯著減少，而E-鈣粘蛋白含量增加?！扳}粘蛋白轉換”[茲斯伯格(Zeisberg M)和尼爾森(E. G. Neilson) (2009)]在三維培養條件中比在二維培養條件中顯著(圖6)，表明除了存在NHLF，三維結構也需要減少SAEC去分化。這些變化也是上皮細胞-間充質細胞轉變(EMT)的特征，表征上皮細胞去分化過程。促炎性細胞因子的表達如肺部感染或肺泡上皮細胞損傷(連續上皮細胞層破壞)所引發，促炎性細胞因子由肺泡上皮產生以吸引包括中性粒細胞在內的發炎細胞。為測試CXCL-8促炎性細胞因子的表達，由二維單一培養物和共培養物以及三維組織共培養物(設置可見于圖3 中)的細胞上清液測試CXCL-8蛋白含量。使用市售ELISA測試試劑盒(安迪實驗室 (R&DLaboratories))，顯而易見相較于常規二維組織培養物，CXCL-8表達量在三維組織系統中顯著降低(圖7. a)，且在上皮細胞比率最高的情況下檢測到最低含量，表明通過上皮細胞層的中斷引發CXCL-8表達。在圖7. a的圖式上，顯示人類活體外三維肺模型中的CXCL-8分泌。發現成纖維細胞的三維單一培養物不分泌CXCL-8，而三維SAEC仍產生細胞因子(不過比二維SAEC培養物的程度低-數據未示)。二維共培養物未顯著改變CXCL-8的表達，表明成纖維細胞的存在無法影響細胞因子表達。CXCL-8的表達量在上皮細胞-成纖維細胞比率為75% /25% 的三維組織系統中顯著降低，在所述系統中上皮細胞基本上完全覆蓋成纖維細胞球，表明 CXCL-8表達可通過肺泡上皮細胞層的中斷來引發。所述CXCL-8表達的降低在50% /50% 和25% /75%的比率下有點不太顯著。發炎性細胞因子IL-I β和IL_6mRNA含量也使用定量實時RT-PCR分析來研究。當對SAEC-NHLF mRNA的混合物進行PCR時，在三維培養物中，相較于各別二維培養物，IL-I β 和IL-6mRNA含量顯著下調(分別為圖7B和7C)。一旦SAEC細胞從二維和三維NHLF共培養物中分選出，則在三維條件下培養的SAEC中IL-I β和IL-6的表達減少顯著得多(圖 7D)。實例5-具有上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞組分的三種細胞類型模型為進一步改進肺組織培養物模型的復雜性，原代人類肺源性微血管內皮細胞 (HMVEC)加入SAEC和NHLF細胞中，并類似于SAEC和NHLF共培養物建立二維和三維組織微
量培養物。通過熒光和共焦顯微術對微量組織的形態學檢查顯示，HMVEC可成功地在三維條件下與SAEC和NHLF細胞兩者共培養(圖8. a)。有趣地，在與SAEC或NHLF的共培養物中， HMVEC形成微量培養物的內部致密核心。當三種細胞類型(1 1 1) 一起在三維條件下培養時，其粘在一起并形成明顯致密穩定的三維結構(圖8. b)。三種細胞培養物的分子表征顯示，相較于在二維培養條件下所測量，AQP3和KRT7 的表達量在三維培養物中明顯增加(圖9. a和表2、。當細胞保持在二維培養物中時，EMT 標記物S100A4和N-cad的含量增加，但在三維培養物中穩定。三維培養物中E-cad的輕微減少小于二維培養條件下所檢測到的減少(圖9. a和表2)。然而，當對三種細胞類型的混合mRNA進行定量RT-PCR時，需要進一步分析三種細胞類型三維培養物，以發現有助于從純化的組織分子進行組織構造的三種細胞類型的最佳比例。表2顯示人類原代肺細胞培養物的基因表達變化。數目為RQ值，根據式RQ = 2-ddct 計算，其中ddCt值按ddCt = dCt (樣品)-dCt (參考樣品)計算。除了分選的SAEC:其中數據以dCt值呈現，計算如下dCt = Ct (靶基因)-Ct (管家基因)。在建立各種培養物前一部分收集的細胞始終用作參考樣品。SCt(dCt)值計算如下dCt (靶基因)=Ct(靶基因)-Ct (管家基因)。18S核糖體RNA用作管家基因，除了分選的SAECf*樣品的情況，其中
肌動蛋白用作管家基因。基因二維培養物三維培養物僅 SAECSAEC-NHLFSAEC-NHLF-HMVEC僅 NHLF分選的 SAEC**僅 SAECSAEC-NHL FSAEC-NHL F-HMVEC僅 NHLF分選的 SAEC**AQP36,89018207711,404878030,2716027510,6742740639,7719335,7845617213.312558963,628005562,8542116758,571433AQP4N.D.N.D.N.A.N.D.N.C.N.C.N. C.N.A.N.D.N.C.AQP5N.C.N.C.Ν.Λ.N.C.N.C.N.C.N. C.Ν.Λ.N. C.N.C.E-cad2,4096572671,7722614360.215508996N.D.7,9760,6441382293.0164915780,296617715N.D.6,4226ILlb5,72800685429,60546927N.A.N.D.4,63460,6676159322,016755678N.A.N.D.5,7802IL-65,18902601628,09596712N.A.0,8072855487,4258670,1144041358,323721329N.A.0,49808994310,67543KRT74,8510983367,4629343622,181196885N.D.-1,460751,342351233,6848484663,765852951N.D.0,4287N-cad0,5275208421,1113012869,3746836020,1329310476,179550,055832540,0956825731,2448109590,05625596911,4096S100A42,5360123770,4216349051,8608606190,3808366648,9298332,033534630,4152104651,0505731850,1571827386,653067SFTPAlN.D產低*N.D.*N.D,N.A.N.D.*髙*N.D.*N.D.*N.A.SFTPBN.D.N.C.N.D.N.D.N.A.N.C.N. C.N.D.N.D.N.A.SFTPCN.D.N.C.N.D.N.D.N.A.N.C.N. C.N.D.N.D.N.A.TTF-I1,0233457220,863026227N.A.N.D.10,3510,9264263551,059201358N.A.N.D.8,034067縮寫N.A.數據不可用，表達量未測定。N.D.用實時QPCR未檢測出特定PCR產物。N.D. * 用常規PCR未檢測出特定PCR產物。N. C.使用實時QPCR，平行孔或樣品中特定表達量未隨之測到。低* 通過常規PCR檢測出相對較低表達量。高用常規PCR檢測出相對較高表達量。細胞分泌的細胞標記物和因子的結果概沭此處，提供證據證明，原代肺部上皮細胞與成纖維細胞的三維共培養比二維或三維活體外單一培養物中更有利于SAEC維持更多分化的狀態。包括NHLF不僅促進上皮細胞分化，而且相較于僅僅SAEC (圖幻或SAEC-HMVEC (圖8. a)培養物，三維微量組織的粘著和結構堅固致密得多。TTFl轉錄因子是胚胎發育期間和出生后ATII細胞中肺泡上皮細胞的特征性通用標記物。細胞角蛋白是細胞骨架的中間絲的組分，且其表達模式在細胞譜系鑒別中是重要的。在實驗中，肺上皮細胞標記物TTF-I和細胞角蛋白7KRT7顯示在三維共培養物中表達
量升高。II型肺細胞促進水的經上皮運動(通過水通道蛋白(AQP)家族成員)。ATII標記物水通道蛋白3顯示在成纖維細胞存在下含量升高(圖幻。分泌表面活性蛋白是ATII肺上皮細胞的獨特特征。[杜布斯(Dobbs,L. G.) (1989)，艾爾肯(Alcorn, J. L.)等人(1997)] 在實驗中，單一培養物中的SAEC細胞未能表達表面活性蛋白，而表面活性蛋白AlmRNA因而在三維中表達，且量少于二維共培養物中(圖5. c)。然而，三維共培養物系統中未隨之檢測到表面活性蛋白B和C (數據未示)。也檢驗兩種細胞培養物和三種細胞培養物中ATI標記物水通道蛋白4和5的表達，但這些分子的表達未隨之檢測到，估計可能是因為本文所用的細胞(SAEC)是ATII型。此外，ATI分化需要大量時間(數據未示)。在稍微較長的培養時間期間，如果使用具有ATI型特征的細胞，那么將出現ATI標記物。因此，除SFPC外，分化標記物AQP3、KRT7、TTFl和SFPA在成纖維細胞存在下都上調。AQP3和SFTPA而非KRT7或TTFl分化標記物的含量在三維培養條件下進一步增加。S100A4是上皮細胞-間充質細胞轉化眾所周知的分子標記物，且其表達量常常在轉移癌[休爾貝特(Sherbet,G. V)等人，2009]以及肺纖維化[伽里諾(Guarino，M·)等人， 2009]中較高。S100A4和N-鈣粘蛋白上調以及E-鈣粘蛋白平行下調[茲斯伯格(kisberg M)和尼爾森(E.G. Neilson), (2009)，賽克(Seike, M.)等人(2009)]也是上皮細胞-間充質細胞轉化(EMT)的特征，其表征上皮細胞去分化過程且特征是喪失細胞粘著、E-鈣粘蛋白表達受抑制和細胞運動增加。去分化標記物S100A4和N-鈣粘蛋白出現在二維培養條件下純化的原代細胞中。
以上去分化標記物在成纖維細胞存在下減少且在三維條件下進一步減少。相較于二維培養物，可在三維培養物中觀測到包括ILlb、IL6和CXCL8在內的發炎性標記物減少。所述標記物在三維培養條件下顯著下調；例如二維培養物中僅僅存在成纖維細胞不足以減少其含量。在兩種細胞培養物中觀測到SFTPAl表達，但在三種細胞培養物中未觀測到(圖 5. c且數據未示)。實例6-疾病樽型來自肺腫瘤細胞系的肺腫瘤模型如實例3中所述，制備人工三維肺組織培養物，改變如下。代替上皮細胞(SAEC)，使用來源于經NNK W-(甲基亞硝氨基)(3_吡啶)丁酮]處理的A/J小鼠(肺腺癌模型[別林斯基(Belinsky)等人(1992)])的II型肺泡上皮細胞(AM9)與5%-20% CL13或CL30細胞(沃德洛(Wardlaw)等人，分子藥理學 (Molecular Pharmacology) ,62, 326-3332002)的組合。CL13 或 CL30 細胞攜帶有 Ki-ras 基因的突變。進行一系列實驗，尋找A549細胞與CL13或CL30細胞的適當比率。腫瘤自發形成時的比率用以制備用作肺腫瘤疾病模型的三維肺模型組織。在以上方法的一個替代性方法中，使用患者腫瘤細胞。使用經遺傳修飾且經亞致死照射的細胞系改變原代細胞聚集體中分泌因子的組成所有細胞類型均未感染，因此基因表達與任何既定三維肺組織模型中一樣正常。然而，聚集體的細胞組成含有經亞致死照射的細胞(聚集體全部細胞數目的 5% -10% )_成纖維細胞(WI-38)或肺泡上皮細胞(AM9)系，這些細胞經遺傳修飾且產生改變聚集體內細胞微環境的分泌因子(Wnt-s、骨形態形成蛋白(BMP)-s、發炎性和促炎性細胞因子、生長因子等)。天然三維肺部細胞聚集體為模擬發炎病狀，用各種濃度的細菌細胞壁提取物處理天然三維肺部細胞聚集體。使用細胞因子特異性ELISA技術從組織培養基測定細胞因子的產生，上皮細胞與成纖維細胞兩者的基因表達變化可通過實時PCR反應定量。實例7-三維肺組織試劑盒在本實例中，制備測試備用的具有下列特征的3C肺組織試劑盒1.測試備用的肺組織傳遞于96孔板中。2.備用于實驗或測試的肺模型組織小(80000個細胞/孔)樣品存在于孔中。3.每一組織都由人類原代肺泡上皮細胞與成纖維細胞的混合培養物(分別是 25%、50%和75%上皮細胞)組成。4.板含有3個-3個孔對照(僅僅上皮細胞和成纖維細胞)。5.板用透明、優選粘著的塑料薄膜，例如用薩拉納普(Saranrap)密封。組織的質量保用3天，包括傳遞在內。板自身為V形底96孔非粘著組織培養板。模型組織如實例3中所述制備。每一組織都浸在200 μ 1組織培養基中，對肺培養物，最佳是在5 % CO2環境中，密封，且在室溫下或在冰上傳遞。質量控制從每一孔取出一個組織并測試活力。通過實時PCR測試分化標記物。需要時，可包括二維對照板(組織在96孔平底粘著組織培養板中生長)伴隨三維組織。工業應用性在上文中，建立無組織骨架的ATII型肺模型的基本參數和培養條件，其中可研究細胞的自發自組裝和細胞的相互作用。在理論與應用研究中以及醫藥測試中，所述模型容易對復雜組織系統進行處理和基因操作。所述模型也容易通過包括用于血管形成的內皮細胞和甚至平滑肌細胞在內的其它細胞類型擴大，其中可研究其它交互組織和細胞的相互作用。在理論或應用研究中以及醫藥測試中，無骨架三維培養允許對簡單或更復雜組織系統進行無故障的基因操作。此肺部組織模型尤其適于研究細胞的自發自組裝和細胞相互作用。生物醫學研究與醫藥公司都需要活體外模型來提高臨床前階段中預測候選藥物分子的毒性或功效的有效性。[克萊默(Kramer J. A.)等人，2007]新設定的方針也強調要替換動物模型并催促發展新的臨床前測試方法。[創新醫學研究初步戰略研究議程 (Innovative Medicine Research Initiative Strategic Research Agenda) · 2008，歐洲技術平臺(European Technology Platform)。]基于以上模型且使用各種基因傳遞方法以及可變靶基因，三維人類肺部微量組織模型系統容易適于研究肺部疾病期間的基因變化，從而可鑒別新的藥物靶和發展新的療法。這些疾病模型可包括發炎模型、腫瘤模型、肺纖維化模型或再生模型?？色@得健康肺組織以及疾病組織的三維模型。根據本發明的產品可例如呈組織培養物、包含所述培養物的板或陣列、或試劑盒的形式出售。參考文獻
權利要求
1.一種工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述模型組織培養物a)不含人工組織骨架，其中所述人工組織骨架為多孔三維基質；三維凝膠基質或多孔膜支撐物，b)由培養細胞構成，c)包含至少肺部上皮細胞和間充質細胞，優選成纖維細胞，d)具有一個或一個以上細胞聚集體的形態，其中所述聚集體的表面富集所述肺部上皮細胞，和e)其中所述上皮細胞表達上皮分化標記物。
2.根據權利要求1所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述一個或一個以上聚集體的尺寸或平均尺寸為至少80 μ m和至多600 μ m,優選所述聚集體的尺寸或平均尺寸在100 μ m與300 μ m之間，和/或所述一個或一個以上聚集體包含的細胞的量為至少2 X IO4個細胞，優選至少4X IO4個細胞，和至多5 X IO5個細胞，優選至多2 X IO5個或至多IO5個細胞。
3.根據權利要求1或2所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述模型組織培養物不含任何人工組織骨架和/或所述模型組織培養物進一步包含細胞外基質，其細胞外基質蛋白為所述組織培養物中所包含的至少一種細胞類型、優選為所述成纖維細胞所分泌，和/或上皮細胞在所述聚集體的表面的至少一部分上形成肺部上皮細胞襯里，優選所述肺部上皮細胞襯里至少部分覆蓋所述聚集體的表面。
4.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述模型組織培養物包含從個體獲得的培養的原代細胞，和/或所述模型組織培養物包含在培養前去分化且在培養時再分化的細胞，和/或所述模型組織培養物包含已確立細胞系的細胞。
5.根據前述權利要求中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其另外包含內皮細胞。
6.根據前述權利要求中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述肺部上皮細胞包含至少一種下列細胞類型I型肺細胞(ATI細胞)， II型肺細胞(ATII細胞)，其中所述工程化三維肺部模型組織的所述組織細胞所表達的所述上皮分化標記物優選選自下列群組ATII型分化標記物， ATI型分化標記物。
7.根據前述權利要求中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其中下列標記物的含量相對于包含非培養細胞、優選純化的原代細胞的對照增加TTF1、AQP3、SFTPA、SFTPC、KRT7,下列標記物的含量相對于包含非培養細胞的對照減少CXCL8ILlb、S100A4,下列標記物的含量相對于對照二維培養物增加AQP3、SFTPA，下列標記物的含量相對于對照二維培養物減少CXCL8、ILlb, IL6、S100A4、N-鈣粘蛋白。
8.根據前述權利要求中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物，其中所述培養細胞、優選所述肺部上皮細胞和/或間充質細胞包含具有患病肺組織的病理特征的受影響細胞，使得所述模型組織培養物為肺部疾病模型組織培養物， 優選其中所述疾病包含發炎，且所述受影響細胞表達超過正常含量的發炎性細胞因子，且所述模型為發炎模型，其中所述疾病為腫瘤，且所述細胞為轉化、例如惡性轉化或永生細胞，且所述模型為腫瘤模型，其中所述疾病包含纖維化，且所述模型為纖維化模型， 其中所述疾病包含所述組織的損傷，且所述模型為再生模型。
9.一種制備工程化三維肺部模型組織培養物的方法，所述方法包含以下步驟制備至少肺部上皮細胞與間充質細胞、優選成纖維細胞、更優選原代成纖維細胞的混合懸浮液，?；鰬腋∫旱募毎??；黾毎?，在(X)2存在下培育所述?；瘧腋∫翰⒈３肿阋允顾黾毎纬砂粋€或一個以上細胞聚集體的三維肺部模型組織的時間， 任選分析所述模型組織a)模型組織培養物所特有的一種或一種以上上皮分化標記物的表達，且相較于參考培養物，表達量增加被認為是指示形成三維肺部模型組織培養物；和/或b)一種或一種以上如上所定義的促炎性細胞因子的表達，且相較于適合參考培養物 (如上所定義)，表達量減少被認為是指示形成三維肺部模型組織培養物，c)所述一個或一個以上聚集體的尺寸和形態。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述細胞聚集體的平均尺寸為至少80 μ m和至多600 μ m,優選在100 μ m與300 μ m之間，和/或所述一個或一個以上聚集體包含的細胞的量為至少2 X IO4個細胞，優選至少4X IO4個細胞，和至多5 X IO5個細胞，優選至多2 X IO5個或至多IO5個細胞。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其中所述粒化懸浮液在(X)2存在下培育，保持不超過2周，優選不超過12天、10天、8天、7天、6天或5天的時期，和保持不少于 10小時，優選不少于12小時或14小時的時期。
12.根據權利要求9至11中任一權利要求所述的方法，其中在制備混合懸浮液時，一種或一種以上類型的細胞在18小時內，優選12小時內，更優選4小時內，極優選1小時內或同時加入容器中，極優選每一類型所用細胞都在所述時期內加入。
13.根據權利要求9至12中任一權利要求所述的方法， 其中所述容器為未經組織培養物處理的V形底容器，和/或其中?；?00g到600g下進行1分鐘到20分鐘，優選2分鐘到10分鐘，和/或其中所述細胞用適于報道一種或一種以上下列細胞特征的生物相容性染料染色細胞狀態，例如細胞分裂時相、細胞活力、細胞的凋亡或瀕死狀態；細胞類型；細胞位置；惡性轉化；發炎。
14.根據權利要求9至13中任一權利要求所述的方法，其中所述至少肺部上皮細胞與肺部間充質細胞的混合懸浮液包含從個體獲得的培養的原代細胞，和/或所述至少肺部上皮細胞與肺部間充質細胞的混合懸浮液包含在培養前去分化的細胞且所述細胞在培養時再分化，和/或所述至少肺部上皮細胞與肺部間充質細胞的混合懸浮液包含已確立細胞系的細胞。
15.根據權利要求9至14中任一權利要求所述的方法，其中所述培養細胞、優選所述肺部上皮細胞和/或間充質細胞包含具有患病肺組織的病理特征的受影響細胞，使得所述模型組織培養物為肺部疾病模型組織培養物。
16.優選根據權利要求1至7中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物， 其可通過根據權利要求9至15中任一權利要求所述的方法中的任一方法獲得。
17.—種針對藥物對肺組織的作用篩選藥物的方法，所述方法包含以下步驟 提供根據前述權利要求中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物， 取所述模型組織培養物的至少一個測試樣品和參考樣品，使所述測試樣品與藥物接觸，同時維持所述測試樣品和所述參考樣品在相同條件下， 與所述參考樣品進行比較，檢測所述測試樣品的任何變化或改變， 其中如果檢測到所述測試樣品的任何變化或改變，那么認為是指示所述藥物的作用。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述模型組織培養物為健康肺組織模型且測試藥物的不良作用，其中對所述測試樣品的細胞有害的變化或改變被認為是所述藥物的有毒或不良作用。
19.根據權利要求17所述的方法，其中所述模型組織培養物為包含具有病理特征的受影響細胞的肺部疾病模型組織培養物且測試藥物的有益作用，其中對所述模型組織培養物進行測量或評估所述病理特征的分析，以獲得疾病量度， 提供健康肺組織的參考樣品(健康參考樣品)和/或患病肺組織的參考樣品(患病參考樣品)，在所述健康參考樣品和/或所述患病參考樣品中，以及在所述至少一種測試樣品中在其與所述藥物接觸前后，測量或評估所述病理特征，其中使所述測試樣品中所述疾病量度移向所述健康參考樣品中所述疾病量度和或遠離所述患病參考樣品中所述疾病量度的所述測試樣品中的任何變化或改變被認為是所述藥物的有益作用。
20.一種工程化三維肺部模型組織試劑盒，其包含具有容器陣列的測試板，其中至少兩個容器含有一種或一種以上類型的根據前述權利要求中任一權利要求所述的工程化三維肺部模型組織培養物的樣品，各樣品放入所述板的各別容器中， 供培養所述模型組織培養物的細胞的適當培養基。
21.根據權利要求20所述的工程化三維肺部模型組織試劑盒，其具有一種或一種以上下列特征其中所述板為96孔板，其中所述板為V形底板，各容器中所述培養物樣品包含的細胞的量為至少IO3個，優選至少IO4個，更優選至少2X104個、3X104個、4X104個、5X104個細胞，和至多IO7個，優選至多IO6個，更優選至多5\105個、4\105個、3\105個、2父105個或至多IO5個細胞，其中所述容器各別或一起密封，且含有適于肺組織培養物的富集(X)2的環境或氣氛， 其中所述富集(X)2的環境或氣氛包含至少2%、3%、4% CO2環境， 至多10%、9%、8%或7% CO2環境， 極優選約5% C02。
22.一種根據權利要求1至7中任一權利要求所述的三維肺部模型組織培養物的用途， 其用于針對化合物對肺部組織的作用，平行篩選化合物，例如毒性測試、尋找候選化合物等， 針對化合物的治療潛力，對化合物進行患者特異性測試，只要所述模型組織培養物是從原代患者肺部細胞獲得即可，研究所述肺部組織中細胞的相互作用， 研究肺部疾病期間的基因變化等。
全文摘要
本發明提供無組織骨架的工程化三維肺部模型組織培養物，其不含任何人工骨架?？色@得健康肺組織以及疾病組織的三維模型。根據本發明的產品可例如呈組織培養物、包含所述培養物的板或陣列、或試劑盒的形式出售。本發明可應用于醫學和科學研究中，用于測試化合物對肺組織的影響，篩選、測試和/或評估藥物，以及在某些情況下診斷肺部疾病。
文檔編號C12N5/071GK102369277SQ201080020612
公開日2012年3月7日 申請日期2010年5月5日 優先權日2009年5月5日
發明者尤迪特·E·蓬格拉茨 申請人:佩奇大學