專利名稱：源于白內障疾病模型小鼠的多潛能細胞、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物細胞領域，具體涉及一種來源于白內障疾病小鼠的多潛能細胞如胚胎干細胞(ES)其制備方法及其用途。
背景技術：
白內障是嚴重影響公眾健康的重大疾病。據世界衛生組織統計，全世界約有4500 萬人失明，其中有一半是由白內障導致的。白內障是由遺傳和環境危險因素等多種原因引起的以晶狀體混濁為主要癥狀的多因子失調眼科疾病(Mccarty C A, Taylor H R. The genetics of cataract [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001,42 (8) :1677-8.)。白內障的遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳。遺傳性白內障無論從臨床表現上還是遺傳特性上都很復雜，許多與晶狀體相關的基因突變都可導致白內障的形成。由于白內障疾病的復雜性，有效的方法就是研究遺傳性單純性白內障來進一步深入了解可導致和影響晶狀體病變的所有基因及發病機制。人們最早對白內障遺傳因素的認識是從動物模型開始的，主要是鼠模型(Graw J.Mouse models of cataract [J]. J Genet, 2009,88 (4) :469-86.)。這是由于晶狀體混池能相對容易地在鼠模型中檢測到，并且可同時觀察白內障的遺傳方式。疾病的動物模型是體外研究該疾病的發病機制、病理過程等的強有力的工具。鼠模型在白內障研究領域中發揮著重要的作用。迄今為止，國內外已發現的遺傳性白內障小鼠模型約有140多個，這些小鼠模型主要是通過自發突變、誘發突變、敲除突變或轉基因等方式獲得。利用小鼠動物模型，可以克服白內障發生發展緩慢、潛伏期長、發病原因多樣及經常伴有各種其它疾病等因素干擾的問題，可以通過單一的病因，在短時間內復制出典型的動物疾病模型，因此，白內障小鼠動物模型對于研究白內障的發生、發展規律和疾病診斷治療等是極為重要的手段和工具。隨著科學的發展，已經有20多個基因位點被證明與先天性白內障有關，其中17 個基因已經被完全克隆出來(He ff, Li S. Congenitalcataracts gene mapping [J]. Hum Genet, 2000,106 (I) : 1_13.)，人們對白內障的發生機制也逐漸有了一定的了解，但仍然還有許多家庭受到未知基因突變引起的白內障的影響。已發現的白內障小鼠突變系中，也還有部分突變基因在其分子水平尚未明確定義，即使是那些已知與白內障有關的基因，其確切的機制也還沒有完全弄清楚。雖然隨著醫療技術的不斷進步，先天性白內障的診斷和治療已非難事，但目前診斷仍以癥狀學診斷為主，治療以手術為主，且手術治療后會有一定的并發癥。或許可以仿效其他遺傳性疾病的做法，通過對胎兒期疾病基因篩選等方法，將疾病診斷提前到胎兒期，為有效的治療提供時機及依據，再通過基因治療的手段，將遺傳性白內障控制在白內障尚未形成或尚未完全形成之前，以實現在基因水平對遺傳性白內障的防治。基因治療通常在細胞水平進行操作，而具有多能性的胚胎干細胞無疑是最佳選擇。胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)是從早期胚胎內細胞團中克隆出來的一類細胞，在理想的條件下培養，這類細胞能維持其無限自我更新增殖潛能，并可以分化為包括生殖細胞在內的多種類型子細胞，具有發育成完整生命個體的能力(Martin G R. Isolation of a pluripotentcell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned byteratocarcinoma stem cells [J].Proc Natl Acad Sci USA, 1981,78 (12) :7634-8 ；Mastui Y, Zsebo K, Hongan B L. Derivation ofpluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cellsin culture[J]· Cell,1992, 70(5) :841-7.)。胚胎干細胞的用途很多，在生命科學及醫學的各個領域都有很重要而深遠的影響。胚胎干細胞的全能性、可遺傳操作性和無限擴增能力，使其成為細胞和分子水平上研究個體發育過程中極早期事件的良好材料和方法。隨著人類基因組學研究基因芯片、基因誘捕等生物技術的應用，比較ES細胞及不同發育階段的細胞和分化細胞的基因轉錄和表達，可確定胚胎發育及細胞分化的分子機制、發現新基因。結合基因打靶技術，可發現不同基因在生命活動中的功能等。胚胎干細胞還提供了新藥物的藥理藥效、毒理及藥物代謝等研究的細胞水平的研究手段，可大大減少藥物實驗所需實驗動物的數量，ES細胞還可用來研究動物和人類疾病的發生機制和發展，過程以便找到有效和持久的治療方法。此外通過ES細胞和基因治療技術，還有可能矯正缺陷基因。1981年，Evans等采用STO細胞作為飼養層，在添加了血清的培養液中成功從囊胚 ICM 中培養了小鼠 ES 細胞(Evans M J, Kaufman M H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature,1981,292(5819) :154-156.)。 Martin GR以免疫外科法剝得囊胚內細胞團(ICM)并將其置于STO細胞飼養層上，并用小鼠PSA21-ES細胞條件培養基培養，得到小鼠ES細胞(Marin G R. Isolation of apluripotent cell line from early mouse embryos cultured in mediumconditioned by teratocarcinoma stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(12) :7634-8.)。 Dhhaise等將8-細胞小鼠胚胎消化成單個分裂球并培養于小鼠原代成纖維細胞飼養層上， 以添加了胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，建立了一個ES細胞系MSBl，該細胞系細胞具有形成嵌合鼠的能力。上述研究者都是應用經典的飼養層加血清培養體系培養獲得小鼠 ES細胞。雖然科學家用這個體系成功建立了多種小鼠品系的ES細胞系，但是這種培養體系仍存在很多不足。如飼養層細胞不具耐藥性，因此無法用于轉染外源性基因的胚胎干細胞篩選，且死亡的飼養層細胞可能會導致ES細胞的突變及影響正常核型的保持(Suemori H, Nakatsuji N. Establishment of the Embryo-derived Stem(ES)Cell Linesfrom mouse blastocysts effects of the feeder cell layers[J]. DevelopmentGrowth & Differentiation, 1987，29 (2) :133-9.)。最重要的是飼養層和血清都具有動物源性，且成分復雜，作用機制不清，具有不確定性和不可控性，因而限制了更多胚胎干細胞系的成功建立。2003年，Ying等人發現，血清中起作用的成分為BMP4，并利用LIF+BMP4的無血清無飼養層培養體系成功建立了小鼠ES細胞系(YingQ L,Nichols J, Chambers I, et al.BMP induction of Id proteinssuppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3[J]. Cell,2003,115(3) :281-92.) 2007 年，Ying等更在含有MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體拮抗劑的無血清培養基中獲得多能細胞(包括小鼠ES細胞)，并在其中保持自我更新狀態(專利申請號200780011232. 5)。該培養體系的優點在于不添加來自飼養層和血清中任一刺激更新維持ES細胞不分化狀態的成份，越來越多小鼠品系的胚胎干細胞系利用該培養體系得以建成，如NOD小鼠ES 系、C57BL/6N小鼠ES系和非肥胖型糖尿病小鼠ES細胞系等(Ohta H，Ohinata Y，Ikawa M, et al. Male germline and embryonic stem cell linesfrom NOD mice !efficient derivation of Gscells from a nonpermissivestrain for ES cell derivation[J]. Biology of reproduction,2009,81(6) :1147 ；Kiyonari H,Kaneko M,Abe S,et al. Three inhibitors ofFGF receptor, ERK, and GSK3establishes germline-competentembryonic stem cells of C57BL/6N mouse strain with high efficiencyand stability. Genesis, 48(5) :317-27 ；Nichols J, Jone K, Phillips J, et al. Validated germline-competent embryonic stem cell lines from nonobesediabetic mice. Nature medicine,2009, 15(7) :814-8.)。但目前為止，國內外尚沒有關于成功獲得來源于白內障動物模型的胚胎干細胞的報道。同時本領域急需獲得白內障小鼠的胚胎干細胞，在細胞水平上為研究白內障疾病，如發病機制研究、藥物篩選及基因治療等提供新的材料和方法。與動物模型相比，胚胎干細胞的優勢在于可以更為方便的進行大規模的遺傳操作、篩選。

發明內容
為此，本發明人進行多方面的研究，終于以白內障小鼠為原材料，成功地從白內障小鼠的早期胚胎中培養獲得了白內障小鼠的胚胎干細胞、并驗證了以白內障小鼠為來源可以成功獲得具有白內障遺傳信息的胚胎干細胞的方法是可行的。具體地，本發明包括以下幾項本發明的第一方面涉及一種多潛能細胞，其分離自白內障疾病模型小鼠，優選地，所述的模型小鼠為遺傳性白內障疾病模型小鼠，優選地，所述的遺傳性白內障疾病模型小鼠選自a :遺傳性BALB/cCat/Cat白內障小鼠；b:Philly 小鼠;c =Crybal基因突變小鼠；d :顯性白內障小鼠Hif ;進一步優選為遺傳性BALB/cGat/Gat白內障小鼠；優選地，所述的多潛能細胞為胚胎干細胞。本發明第一方面所述的多潛能細胞，其分離自白內障疾病模型小鼠的早期胚胎。本發明第一方面所述的多潛能細胞，其表達堿性磷酸酶、SSEAl基因和/或選自 0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；優選地,該多潛能細胞表達0ct4、Nanog和Sox2 ；更優選地,該多潛能細胞表達0ct4、Nanog、Sox2和Eras ；進一步優選地,該多潛能細胞同時表達堿性磷酸酶、SSEAl以及選自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utf I、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；更進一步優選地，該多潛能細胞同時表達堿性磷酸酶、SSEAU 0ct4、Nanog和 Sox2。
本發明第一方面所述的多潛能細胞，其可形成畸胎瘤或畸胎癌，優選地，所形成的畸胎瘤或畸胎癌中含有源于外胚層、中胚層和內胚層三個胚層的分化細胞。本發明第一方面所述的多潛能細胞，其在培養基中可作為單個細胞生長和/或增殖。本發明第一方面所述的多潛能細胞，其可形成嵌合體；優選地，所述嵌合體中的所有細胞與所述多潛能細胞源于同一親本；進一步優選地，所述的嵌合體為嵌合鼠； 更進一步優選地，所述的嵌合鼠患有白內障疾病。本發明的第二方面涉及一種多潛能細胞，其是保藏號為CCTCCC201217、于2012年 2月15日保藏在地址是中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心的遺傳性BALB/ceat/eat白內障小鼠的胚胎干細胞系。本發明的第三方面涉及一種嵌合鼠，由前述任一項的多潛能細胞與受體胚胎聚合后，培育獲得。本發明的第四方面涉及一種多潛能細胞群，其包含前述任一項所述的多潛能細胞；優選地，其包含至少95%的所述的多潛能細胞。本發明的第五方面涉及一種分離多潛能細胞的方法，該方法從白內障疾病模型小鼠中分離獲得多潛能細胞，優選地，從白內障疾病模型小鼠的早期胚胎中分離獲得多潛能細胞。優選地，該方法包括以下步驟(I)使白內障小鼠母鼠與白內障小鼠公鼠交配，使母鼠受孕；(2)從受孕母鼠的子宮中獲得囊胚；(3)從步驟⑵的囊胚獲得內細胞團(ICM, inner cell mass :哺乳類囊胚中位于囊胚腔一側的具有全能性的細胞團)；(4)任選地，從步驟(3)的內細胞團分選一個或多個細胞培養成集落；優選將內細胞團用胰酶消化后傳代培養；(5)任選地，從步驟⑷的集落獲得單克隆，進行傳代培養。在一個具體的實施例中，所述的方法包括以下步驟選擇6周齡以上性成熟的所述的白內障小鼠母鼠與成年公鼠交配使母鼠受孕；從受孕的白內障疾病模型小鼠子宮中沖取囊胚，用培養液培養得到內細胞團，解離出內細胞團，消化成單細胞后，傳代培養，獲得所述的能無限傳代的多潛能細胞；優選地，所述的受孕的白內障疾病模型小鼠為受孕3. 5dpc的小鼠；優選地，所述的培養液為添加了 GSK3抑制劑CHIR99021和蛋白激酶抑制劑 PD0325901 的 N2B27 培養液；優選地，所述的培養液中GSK3抑制劑CHIR99021的終濃度為I 5 μ M，優選為2 4 μ Μ，更優選為3 μ Μ，蛋白激酶抑制劑Η)0325901的終濃度為O. 5 3. 5 μ M，優選為I 3 μ Μ，更優選為2 μ M ;優選地，消化時使用的是胰蛋白酶，濃度為0. 25%，37°C消化I 2min。本發明的第六方面涉及前述任一項的多潛能細胞或嵌合鼠或多潛能細胞群的使用方法，其包括在藥物篩選、白內障機理研究、基因治療細胞、動物模型中在合適的條件下使用所述多潛能細胞或嵌合鼠或多潛能細胞群；優選地，所述使用包括與藥物接觸、作為對照以及基因導入靶點。優選地，所述的藥物為治療白內障疾病的藥物。本發明的第七方面涉及前述任一項的多潛能細胞或嵌合鼠或多潛能細胞群，用于篩選藥物的用途，或者用于制備基因治療藥物的用途；優選地，所述的藥物為治療白內障疾病的藥物。綜上所述，本發明涉及的白內障小鼠多潛能細胞，具有胚胎干細胞特性，其堿性磷酸酶表達呈陽性；胚胎時期細胞表面特異性抗原SSEA-I表達陽性；表達0ct4、Nanog、和 Sox2等多種與多潛能相關的基因；特別的具有產生含有三個原胚層(外胚層、內胚層和中胚層)分化細胞的畸胎瘤的能力以及助于形成嵌合體的能力。在一個具體的實施方案中，所述的來自遺傳性白內障小鼠的多潛能細胞，其主要特征是(I)同時表達堿性磷酸酶、SSEAl 以及 0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、 Cripto、Rexl、Gdf3等多潛能相關的基因，這些基因的表達證明該細胞株處于未分化狀態；(2)可以在無血清無飼養層的培養液內培養；(3)可在體外長期傳代和擴增；(4)自然分化形成擬胚體后,外胚層Nestin (+),原始外胚層GATA4(+)、Soxl7 (+), 內胚層標志基因AFP (+)，中胚層Flkl (+)；(5)注入裸鼠后形成畸胎瘤，畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內胚層的所有分化細胞；(6)能形成嵌合鼠，且嵌合鼠患有白內障疾病。本發明提供了體外培養白內障動物模型胚胎干細胞的思路，所獲得的多潛能細胞可用于白內障發病機制的研究、治療白內障藥物的篩選及提供基因治療手段的研究載體， 為白內障疾病研究提供了的新的材料和方法。


圖I是白內障小鼠內細胞團從透明帶中孵化出來貼壁后的形態。圖2是白內障小鼠ES經多次傳代后的細胞形態。圖3是白內障小鼠ES堿性磷酸酶活性檢測結果。圖4是Reverse Transcription-PCR檢測白內障小鼠ES未分化marker表達情況的電泳圖，從左到右泳道依次是陽性對照46CES細胞、129小鼠尾巴成纖維細胞、白內障小鼠ES細胞株4、白內障小鼠ES細胞株5、白內障小鼠ES細胞株6。圖5是免疫熒光染色檢測白內障小鼠ES干細胞相關marker表達情況，其中A為 SSEAl染色結果，B為0ct4染色結果，C為Nanog染色結果，D為Sox2染色結果。圖6是Reverse Transcription-PCR檢測白內障小鼠ES在體外向三個胚層的分化潛能，從左到右泳道依次是白內障小鼠ES細胞，5天的擬胚體，10天后自然分化的擬胚體。圖7是白內障小鼠ES畸胎瘤形成情況，其中A為神經組織(外胚層)，B為肌肉組織(中胚層)，C為上皮組織(內胚層)。
圖8是白內障小鼠ES參與形成的具有白內障疾病的嵌合鼠。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。以下實施例中，用到的培養基有胚胎干細胞培養基為2i培養基，具體組成為49% DMEM/F12 (購自GIBCO公司)， 49 % Neurobasal Medium (購自 GIBCO 公司)，O. 5 X L-谷氨酰胺(購自 GIBCO 公司)、 IX 巰基乙醇(購自GIBCO公司)、1ΧΝ2(購自GIBCO公司)、1ΧΒ27(購自GIBCO公司)、3 μ M CHIR99021 (購自 Stemgent 公司)、2 μ M PD0325901 (購自 Stemgent 公司)。此培養基用于獲取并維持源于白內障小鼠的ES細胞。擬胚體培養基具體成分為79% DMEM/F12(購自GIBCO公司)，20% FBS(購自 PAA公司)，1%非必須氨基酸(購自GIBCO公司)，O. 5 X L-谷氨酰胺(購自GIBCO公司)， IX β-巰基乙醇(購自GIBCO公司)。實施例I、白內障小鼠囊胚的獲取取6-8周齡的遺傳性BALB/ceat/eat白內障母鼠(購自中國科學院上海實驗動物中心)，于14:00左右，腹腔注射PMSG(孕馬血清促性腺激素，Pregnant Mare Serum Gonadotrophin) (10IU/ 只),48h 后注射 HCG(人絨毛膜促性腺激素，human chorionic gonadotrophin) (10IU/只)，挑選有交配經驗的同品系白內障公鼠(購自中國科學院上海實驗動物中心)，按公鼠母鼠2 I比例合籠。次日早上見栓記為懷孕0.5d。見栓第4 天(懷孕3. 5d)，斷頸處死母鼠，75%乙醇消毒；在無菌環境下暴露子宮，用鑷子取出子宮置于無菌培養皿中。用Iml無菌注射器吸入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, PAA公司)的DMEM/F12(GIBC0公司)作為沖卵液，從子宮角端進針進行沖胚(具體步驟請參見 安德拉斯，瑪麗娜，克里斯蒂娜，等.小鼠胚胎實驗操作手冊[M].孫青原，陳大元主譯.北京化學工業出版社，2005.)。在立體解剖顯微鏡下尋找處于囊胚期的胚胎，用取卵針(商購，也可自制，只要針口孔徑大小較胚胎大小稍大，可吸取胚胎即可)收集。在沖胚前一天,將經絲裂霉素C滅活的MEF (mouse embryof ibroblast,小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養物，第3代)以300個細胞/孔鋪在96孔培養板中制備飼養細胞。將收集的囊胚期胚胎置于上述飼養細胞上，每孔I個囊胚，加入100微升添加了 GSK3抑制劑CHIR99021 (Stemgent公司，終濃度3 μ M)和蛋白激酶抑制劑 PD0325901 (Stemgent公司，終濃度2 μ Μ)的Ν2Β27培養液，置于37°C>5% C02、飽和濕度的細胞培養箱中培養，2-3天更換一次培養液。實施例2、內細胞團自然孵化及胚胎干細胞的培養實施例I中獲得的囊胚期胚胎在所述的培養條件下培養I 2天后，內細胞團 (ICM)開始向透明帶外孵出，繼續培養2天后，孵出的內細胞團(ICM)呈克隆團狀貼壁生長(參見圖I)。吸去培養液，用0.25%的胰酶37°C消化I 2min，添加FBS (胎牛血清) 終止消化，用移液器輕輕吹打，使內細胞團解離成單個或小細胞團，IOOOrpm離心2min，棄上清，用添加了 GSK3抑制劑CHIR99021 (Stemgent公司，終濃度3 μ M)和蛋白激酶抑制劑 PD0325901 (Stemgent公司，終濃度2 μ Μ)的Ν2Β27培養液重懸，傳代至鋪有MEF飼養細胞的 96孔板中(原一個96孔的細胞，消化后仍然直接傳到一個96孔中培養)，37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。按上述方法胰酶消化傳代培養2 3代，此時細胞增殖很快，之后每三天即可傳一代(此時傳代比率視實際克隆數而定)。傳代后的細胞形態鏡檢結果如圖2所示，由圖可以看出，獲得的細胞生長形態類似胚胎干細胞，呈克隆狀生長，邊緣清晰，表面平滑，結構致密。實施例3、胚胎干細胞特性檢測3. I堿性磷酸酶表達取實施例2中獲得的干細胞，用4%多聚甲醛(PAF)固定lOmin，用PBS洗3次，每次所用時間分別為5min、10min、15min,盡可能的去除多聚甲醒。加入O. 5ml α -萘酹Tris base Fast red TR = I : 4 : 5混合染液，室溫孵育5 lOmin，吸去染液，用PBS漂洗終止反應。顯微鏡檢測，結果如圖3所示。由圖3可以看出，細胞被染成紅色，而紅色表示具有堿性磷酸酶活性，從而說明， 實施例2獲得的細胞具有很強的堿性磷酸酶活性，進一步的說，培養的細胞具有胚胎干細胞特性，即表達堿性磷酸酶。3. 2未分化狀態檢測3.2. IReverse Transcription-PCR方法檢測分析實施例2獲得的細胞未分化基因表達水平由于未分化的細胞會特異性表達以下基因，包括0ct4、Nanog、Sox2、Eras、Esgl、 Fgf4、UtfI、Cripto、Rexl、Gdf3，所以可以通過檢測這些基因的表達情況得知實施例2中所獲得的細胞的未分化狀態。未分化marker引物序列設計如表I所示，其中以Eif4g2作為內參,引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(其中F表不正向引物，R表不反向引物)。表I
權利要求
1.一種多潛能細胞，其分離自白內障疾病模型小鼠，優選地，所述的模型小鼠為遺傳性白內障疾病模型小鼠，優選地，所述的遺傳性白內障疾病模型小鼠選自 a :遺傳性BALB/cGat/Gat白內障小鼠； b Philly 小鼠； c =Crybal基因突變小鼠； d:顯性白內障小鼠Hif;進一步優選為遺傳性BALB/ceat/eat白內障小鼠；優選地，所述的多潛能細胞為胚胎干細胞。
2.權利要求I的多潛能細胞，其分離自白內障疾病模型小鼠的早期胚胎。
3.權利要求I的多潛能細胞，其表達堿性磷酸酶、SSEAl基因和/或選自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utfl、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；優選地，該多潛能細胞表達0ct4、Nanog和Sox2 ；更優選地，該多潛能細胞表達0ct4、Nanog、Sox2和Eras ；進一步優選地，該多潛能細胞同時表達堿性磷酸酶、SSEAl以及選自0ct4、Nanog、 Sox2、Eras、Esgl、Fgf4、Utf I、Cripto、Rexl、Gdf3 中的一種或多種基因；更進一步優選地，該多潛能細胞同時表達堿性磷酸酶、SSEA1、0ct4、Nanog和Sox2。
4.權利要求I的多潛能細胞，其可形成畸胎瘤或畸胎癌，優選地，所形成的畸胎瘤或畸胎癌中含有源于外胚層、中胚層和內胚層三個胚層的分化細胞。
5.權利要求I的多潛能細胞，其在培養基中可作為單個細胞生長和/或增殖。
6.權利要求I的多潛能細胞，其可形成嵌合體；優選地，所述嵌合體中的所有細胞與所述多潛能細胞源于同一親本；進一步優選地，所述的嵌合體為嵌合鼠；更進一步優選地，所述的嵌合鼠患有白內障疾病。
7.一種多潛能細胞，其是保藏號為CCTCC C201217、于2012年2月15日保藏在地址是中國武漢大學的中國典型培養物保藏中心的胚胎干細胞。
8.一種嵌合鼠，由權利要求I至7任一項的多潛能細胞與受體胚胎聚合后，培育獲得。
9.一種多潛能細胞群，其包含權利要求I至7任一項所述的多潛能細胞；優選地，其包含至少95%的權利要求I至7任一項所述的多潛能細胞。
10.一種分離多潛能細胞的方法，該方法從白內障疾病模型小鼠中分離獲得多潛能細胞，優選地，從白內障疾病模型小鼠的早期胚胎中分離獲得多潛能細胞；優選地，該方法包括以下步驟(1)使白內障小鼠母鼠與白內障小鼠公鼠交配，使母鼠受孕；(2)從受孕母鼠的子宮中獲得囊胚；(3)從步驟(2)的囊胚獲得內細胞團；(4)任選地，從步驟(3)的內細胞團分選一個或多個細胞培養成集落；優選將內細胞團用胰酶消化后傳代培養；(5)任選地，從步驟(4)的集落獲得單克隆，進行傳代培養。
11.權利要求10的方法，包括以下步驟選擇6周齡以上性成熟的權利要求I所述的白內障小鼠母鼠與成年公鼠交配使母鼠受孕；從受孕的白內障疾病模型小鼠子宮中沖取囊胚，用培養液培養得到內細胞團，解離出內細胞團，消化成單細胞后，傳代培養，獲得所述的能無限傳代的多潛能細胞；優選地，所述的受孕的白內障疾病模型小鼠為受孕3. 5dpc的小鼠；優選地，所述的培養液為添加了 GSK3抑制劑CHIR99021和蛋白激酶抑制劑Η)0325901 的Ν2Β27培養液；優選地，所述的培養液中GSK3抑制劑CHIR99021的終濃度為I 5 μ Μ，優選為2 4 μ Μ，更優選為3 μ Μ，蛋白激酶抑制劑Η)0325901的終濃度為O. 5 3. 5 μ M，優選為I 3 μ Μ，更優選為2 μ M ;優選地，消化時使用的是胰蛋白酶，濃度為0. 25%，37°C消化I 2min。
12.權利要求I至7任一項的多潛能細胞或權利要求8的嵌合鼠或權利要求9的多潛能細胞群的使用方法，其包括在藥物篩選、白內障機理研究、基因治療細胞、動物模型中在合適的條件下使用所述多潛能細胞或嵌合鼠或多潛能細胞群；優選地，所述使用包括與藥物接觸、作為對照以及基因導入靶點；優選地，所述的藥物為治療白內障疾病的藥物。
13.權利要求I至7任一項的多潛能細胞或權利要求8的嵌合鼠或權利要求9的多潛能細胞群，用于篩選藥物的用途，或者用于制備基因治療藥物的用途；優選地，所述的藥物為治療白內障疾病的藥物。
全文摘要
本發明涉及一種源于遺傳性白內障小鼠的多潛能細胞，本發明的多潛能細胞來源于白內障疾病模型小鼠，經檢測確定具有胚胎干細胞特性。本發明可用于白內障發病機制的研究、治療白內障藥物的篩選及提供基因治療手段的研究載體，為白內障疾病研究提供了的新的材料和方法。
文檔編號A61K48/00GK102586174SQ201210044230
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者劉韜, 周秀梅, 張麗青, 李林芳, 錢其軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院