專利名稱：用于檢測甲基化dna的試劑盒和方法
用于檢測甲基化DNA的試劑盒和方法 本申請是申請日為2005年11月觀日、發明名稱為“用于檢測甲基化DNA的試劑盒和方法”的中國專利申請200580047184. 6 (國際申請號PCT/EP2005/012705)的分案申請。本發明涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與含有甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結合。在優選實施方案中，所述方法還包括步驟(d)通過測序分析所檢測的甲基化DNA。本發明的另一方面是用于根據本發明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。產生所有活的生物的細胞的信息包含在它們的DNA中。DNA由簡寫為G、A、T和C 的四種堿基組成并且像非常長的梯子一樣構造，這些字母對組成梯子的每個“橫檔”。字母 G與C配對，A與T配對。這些對的字符串將信息像編碼的信息一樣儲存，組成分組為區域的特定分子的信息稱作基因。二倍體動物的每個細胞含有每個基因的兩個拷貝，每個基因的一個拷貝來自母親并且一個拷貝來自父親。(該規則的唯一例外是染色體上決定生物發育成“雄性”還是“雌性”的基因)。DNA甲基化和基因調節除了“拼出”我們的基因組的四種堿基-腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶之外， 還存在第五種堿基，其通過復制后DNA的修飾產生。DNA甲基轉移酶(DNMTs)可以催化甲基從甲基供體S-腺苷甲硫氨酸向胞嘧啶環的轉移，并從而產生堿基5-甲基胞嘧啶。特定胞嘧啶殘基在哺乳動物中被修飾，所述胞嘧啶殘基在DNA序列中鳥嘌呤殘基之前(CpG 二核苷酸)(Singal，Blood 93 (1999)，4059-4070) ；Robertson, Nat. Rev. Genet. 1 (2000)， 11-19 ；Ng, Curr· Opin. Genet. Dev. (2000)，158-163 ；Razin, EMBOJ. 17(1998)，4905-4908)。 CpG 二核苷酸的甲基化通常與穩定的轉錄抑制相關并且可能導致大部分非編碼基因組和潛在可能的序列如轉座子、重復或者病毒插入片段不轉錄這一事實。有趣的是CpG 二核苷酸在基因組中分布非常不均(Singal (1999)，在上述引文中，Robertson(2000)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，RaZin(1998)，在上述引文中)。基因組的大部分含有比統計預期的少得多的CpG。這可能是由于5-甲基胞嘧啶比較容易地脫氨成胸苷，其在進化過程中導致CpG 二核苷酸的數目相對減少。然而，再次，有更多數目的CpG分布在基因組中，即所稱作的CpG島。這些區域通常含有轉錄起始點和基因啟動子并且通常不甲基化，相比之下，CpG不與CpG島有關。在正常細胞中，CpG島的甲基化僅在罕見的病例中觀察到，如雌性細胞的χ染色體的第二個拷貝和親本印記基因組的失活(Singal (1999)，在上述引文中， Robertson (2000)，在上述弓丨文中，Ng (2000)，在上述引文中，Razin (1998)，在上述弓丨文中)。DNA甲基化的調節僅僅部分理解DNA甲基化模式怎樣在胚胎發生過程中建立起來和CpG甲基化怎樣在基因組中保持和受到調節(Singal (1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中， Razin (1998)，在上述引文中)。在哺乳動物物種中，已知有三種DNA甲基轉移酶(DNMTl、3a和3b)，其催化DNA甲基化過程。然而，必須澄清每種DNMT對于CpG甲基化的維持和調節所做貢獻的對應份額。然而，所有三種酶顯然對于胚胎發生都是必需的，對應的敲除小鼠在子宮內(in utero)死亡或者出生后不久死亡(Bestor,Hum. Mol. Genet. 9 (2000), 2395-2402 ； El Osta, Bioessays 25 (2003), 1071-1084) 同時已經幾次顯示了 DNA甲基化、染色質結構的修飾和某些組蛋白修飾之間的聯系。DNA的甲基化多數與組蛋白脫乙酰作用和組蛋白 H3 的賴氨酸 9 殘基的甲基化相關(Sims，Trends Genet. 19 (2003), 629-639, Fahrner, Cancer Res. 62 (2002)，7213-7218)。因此，DNMT與組蛋白乙酰基轉移酶(HDACs)或者攜阻抑物復合體有關。還幾乎不知道甲基是怎樣從CpG殘基除去的。在增殖細胞中，DNA甲基化還可能在復制期間被動地發生。然而，也有在有絲分裂后細胞中DNA甲基化的實例，其可以通過存在活性的迄今還未知的脫甲基酶來解釋(Wolffe，Proc. Natl. Acad. Sci. 96(1999)， 5894-5896)。CpG甲基化和基因沉默啟動子(但不是非調節序列)的甲基化與穩定的轉錄阻抑相關(Singal (1999)，在上述引文中，Ng(2000)，在上述引文中，RaZin(1998)，在上述引文中)。5-甲基胞嘧啶的阻抑性質可以通過兩種機制介導。首先，DNA甲基化可以直接損害轉錄因子的結合。第二種可能性(其可能造成最大部分的阻抑)是甲基-CpG-結合蛋白(MBPs)的募集(Ballestar， Eur. J. Biochem. 268 (2001)，1-6)。MBP 如 MECP2 或 MBD2 (MeCPl 復合體的組分)伴隨著協阻抑物復合體和HDAC，其具有阻抑效果并且負責轉錄因子不能接近的稠密染色質結構(異染色質)的形成(BallestaH2001)，在上述引文中)。腫瘤發生中的外遺傳改變正越來越清楚的是腫瘤的形成不僅受到遺傳損傷(例如，突變或者易位)而且受到外遺傳改變的支持。異常的染色質結構或者DNA甲基化可以影響癌基因或者腫瘤抑制基因的轉錄狀態并且可以促進腫瘤生長。DNA甲基化的改變包括正常甲基化序列中甲基化的損失(低甲基化)或者正常的未甲基化序列的甲基化(超甲基化)(ROberStOn(2000)，在上述弓丨文中，Herman, N. Engl. J. Med. 349 (2003)，2042-2054 ；Momparler, Oncogene 22 (2003)， 6479-6483 ；Esteller, Science 297(2002)，1807-1808 ；Plass, Hum. Mol. Genetl1(2002), 2479-2488)。低甲基化已經對幾乎所有類型的腫瘤描述了總體DNA低甲基化。在腫瘤組織中，5-甲基胞嘧啶的含量與正常組織相比降低，甲基化事件的主要份額在染色體的重復衛星序列或者著絲粒區域中發現。然而，在單個情況中，還已經描述了原癌基因如bcl-2或c-myc的去甲基化和活化(Costello, J. Med. Genet. 38 (2001)，285-303)。超甲基化或者CpG島CpG島通常發揮基因調節功能。這是為什么甲基化狀態的改變最直接地與有關基因座的轉錄活性的改變相關的原因(Robertson(1999) ；Herman(2003) ；Esteller(2002)； Momparler (2003) ；Plass (2002)，所有都在上述引文中)。多數CpG島以未甲基化形式存在于正常細胞中。然而，在一些情況下，CpG島也可以在基因調節事件中被甲基化。雌性細胞的失活的X染色體的CpG島的多數是例如甲基化的(Goto，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1998)，362-378)。CpG島還可以在正常的衰老過程中被甲基化(Issa，Clin.Immunol. 109(2003)，103-108)。尤其在腫瘤中，通常不甲基化的CpG島可以以超甲基化形式存在。在許多情況中， 受到超甲基化影響的基因編碼抵消腫瘤的生長的蛋白質，如腫瘤抑制基因。下表列出了基因的實例，可以表明這些基因在腫瘤中通過超甲基化的外遺傳的機制被失活。表腫瘤中超甲基化基因(實例)
權利要求
1.一種檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)將能夠結合甲基化DNA的多肽附著到固相支持體；(b)將所述多肽與包含甲基化和/或未甲基化的DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結合。
2.權利要求1的方法，其中步驟(c)包括限制酶消化、亞硫酸氫鹽測序、焦磷酸測序、 DNA印跡或者PCR。
3.權利要求1或2的方法，其中步驟(c)包括PCR。
4.權利要求1到3任一項的方法，其還包括步驟(d)分析甲基化的DNA。
5.權利要求4的方法，其中所述分析所述甲基化的DNA包括測序。
6.權利要求1到5任一項的方法，其中所述多肽選自(a)屬于甲基-DNA結合蛋白(MBD)家族的多肽；(b)(a)的多肽的片段，其中所述片段能夠結合甲基化DNA ；(c)(a)的多肽或者(b)的片段的變體，其中與(a)的多肽或者(b)的片段相比，在所述變體中，一個或多個殘基被替代，并且其中所述變體能夠結合甲基化DNA ；(d)多肽，其是抗甲基化DNA抗體或者其片段；和(e)多肽，其與(a)到(c)任一項的多肽至少70%同一并且能夠結合甲基化DNA。
7.權利要求1到6任一項的方法，其中所述多肽融合到異源多肽。
8.權利要求7的方法，其中所述異源多肽選自HA-標簽、myc6-標簽、FLAG-標簽、 STREP-標簽、STREP II-標簽、TAP-標簽、HAT-標簽、殼多糖結合結構域(CBD)、麥芽糖-結合蛋白、His6-標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)標簽、Intein-標簽、鏈霉抗生物素蛋白-結合蛋白(SBP)標簽和抗體的Fc部分。
9.權利要求6的方法，其中所述抗甲基化DNA抗體是抗-5-甲基胞嘧啶抗體或者其 Fab、F(ab，)2、Fv 或 scFv 片段。
10.權利要求1的方法，其中所述固相支持體用所述多肽直接或者間接附著。
11.權利要求1的方法，其中所述樣品來自受試者。
12.權利要求11的方法，其中所述受試者被懷疑具有低和/或超甲基化基因座。
13.權利要求12的方法，其中所述低和/或超甲基化基因座表明癌、腫瘤或者腫瘤轉移。
14.用于根據權利要求1到13任一項的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽附著的固相支持體；和(c)附著所述固相支持體的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。
全文摘要
本發明涉及檢測甲基化DNA的體外方法，其包括(a)用能夠結合甲基化DNA的多肽包被容器；(b)將所述多肽與含有甲基化和/或未甲基化DNA的樣品接觸；和(c)檢測所述多肽與甲基化DNA的結合。在優選實施方案中，所述方法還包括步驟(d)通過測序分析所檢測的甲基化DNA。本發明的另一方面是用于根據本發明的方法檢測甲基化DNA的試劑盒，其包含(a)能夠結合甲基化DNA的多肽；(b)可以用所述多肽包被的容器；(c)包被所述容器的手段；和(d)檢測甲基化DNA的手段。
文檔編號C12Q1/68GK102220412SQ201110052338
公開日2011年10月19日 申請日期2005年11月28日 優先權日2004年11月29日
發明者M·雷里 申請人:塞昆納姆股份有限公司