專利名稱：：一株海洋枯草芽孢桿菌及其分離和防治黃瓜枯萎病制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及黃瓜枯萎病的防治，具體地說是一株海洋枯草芽孢桿菌及其對黃瓜枯萎病菌的防治。
背景技術：
：黃瓜枯萎病(CwcMm6w/ksan'MmWilt)又稱萎蔫病、蔓割病，是一種世界性的植物維管束病害。該病由尖孢鐮刀菌CPw^n'MWox^/wnw7)引起，是一類主要經(jīng)土壤傳播的維管束病害，在我國瓜類種植區(qū)普遍發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計，每年黃瓜枯萎病的發(fā)病率可達20%，甚至高達80-90%，導致了黃瓜的嚴重減產(chǎn)。目前防治此類病害主要是化學農(nóng)藥，但長期大量使用化學農(nóng)藥，不但嚴重污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡、威脅人類健康，而且導致病原菌的抗藥性越來越強，使病害越來越難以防治。生物防治能克服化學農(nóng)藥帶來的弊端，目前對于黃瓜枯萎病的生物防治方法主要有采用抗病品種、輪作和嫁接。現(xiàn)有的黃瓜品種，僅少數(shù)品種具有一定的抗、耐病能力(如中農(nóng)5號、津春5號等)，即使栽培這些品種，病害還是年年發(fā)生；輪作的栽培方式可以降低枯萎病的發(fā)病程度，但不能從根本上解決病害的發(fā)生；嫁接技術雖能有效地防除枯萎病，但是，在生產(chǎn)上難以大面積推廣。因此，通過尋求新型的防病、治病手段，達到有效地控制黃瓜枯萎病的危害，已成為生產(chǎn)實踐中迫切需要解決的課題。基于生物農(nóng)藥的高效、安全、環(huán)保等優(yōu)點以及人們對黃瓜這種可以生食蔬菜的綠色要求，對黃瓜枯萎病的生物防治己經(jīng)成為人們關注的焦點。在用于植物病害防治的菌中，枯草芽抱桿菌WW^的研究很多，不僅有防病作用，而且有明顯的促生增產(chǎn)效果。已成為人們認同的具有抑制病菌防治病害的一類生防細菌。但該類細菌用于黃瓜枯萎病的生物防治研究報道的較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及黃瓜枯萎病防治及海洋微生物應用技術，具體的說是一種黃瓜枯萎病生物防治用海洋枯草芽孢桿菌制劑制造方法。本發(fā)明所提供的海洋枯草芽孢桿菌，是枯草芽孢桿菌^^///w3512A，己經(jīng)于2007年4月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo.M207051。所述黃瓜枯萎病生物防治用海洋枯草芽孢桿菌制劑的制造方法為l)菌株初篩枯草芽孢桿菌S""7/MHMto7&3512A，是從南海柳珊瑚中分離得到。具體方法如下在南海柳珊瑚生長區(qū)域，直接選取健康的、活的柳珊瑚有機體，在無菌條件下清洗，取其生長點部位，切成0.51.0cm長小塊，裝入無菌采樣小瓶內(nèi)，放置在水瓶(或液氮罐)中，帶回實驗室，以樣品無菌水=1:1研磨，獲得新鮮柳珊瑚細胞提取液；對新鮮柳珊瑚細胞提取液，采用平板稀釋法(培養(yǎng)基中涂有0.0010.01%柳珊瑚)，分離海洋芽孢細菌，在盛有上述專用培養(yǎng)基的平皿上，涂刮平板，然后放入到保溫箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)35天后，對平皿上長出的單菌落純的微生物經(jīng)再劃線純化后，挑典型單菌落移至斜面保藏。本發(fā)明操作簡單，結果理想，能得到所需要的菌株。2)菌株復篩將上述初篩得到的單菌落斜面試管菌株進行平皿活化，28°C48小時，采用平皿拮抗試驗方法，以黃瓜枯萎病菌為靶子菌，按常規(guī)方法在平皿上進行對峙的拮抗試驗，在2528"保溫箱中保溫培養(yǎng)4884小時，取出對峙拮抗試驗平皿，檢測各個柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌菌株對黃瓜枯萎病靶子菌的抑菌圈大小，抑菌直徑達到18mm或18腿以上為合格，選擇編號保存。3)海洋枯草芽孢桿菌在黃瓜根際的定殖試驗將海洋枯草芽孢桿菌試管斜面菌種，移接擴繁，然后在25-3(TC保溫培養(yǎng)36-60小時，此時海洋枯草芽孢桿菌菌苔已長得十分豐滿，可以用無菌水刮洗下來，制成菌懸液，使每毫升菌懸液中的菌體細胞數(shù)達到10億個CFU以上，即達到109濃度，可以與黃瓜盆栽土壤均勻混合，使每克土壤中的試驗測定的枯草芽孢桿菌的細胞數(shù)達105CFU以上，即每克土壤中達到IO萬個CFU細胞以上；土壤裝入盆內(nèi)，每盆播種20粒黃瓜種子，按盆栽試驗常規(guī)方法管理，每隔2周測定一次，接入土中6周后，海洋枯草芽孢桿菌細胞數(shù)穩(wěn)定在10eCFU/克-土水平的，說明得到的海洋枯草芽孢桿菌能在杉木根際土壤中定殖，此菌株為有效菌株，可供應用試驗或推廣應用。從土壤中分離出來的定殖的枯草芽孢桿菌對靶標菌的抑菌圈直徑不低于接種前實驗室測定的結果，即抑菌圈直徑^18mm。所述得到的對病原菌的抑制作用的海洋孢桿菌為枯草芽孢桿菌，用傳統(tǒng)的細菌學鑒定或16SrDNA序列檢測證明其為枯草芽孢桿菌(5a"'〃w5V/^7/力。4)海洋枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)方法(1)、克氏瓶種子培養(yǎng)，采用500ml容積克氏瓶，裝60ml培養(yǎng)基，121"C滅菌30分鐘，冷卻后放斜面，接種海洋枯草芽孢桿菌，而后將此克氏瓶放在2528。C保溫箱中保溫培養(yǎng)4872小時，取出即可作為種子用。克氏瓶種子培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為改良淀粉培養(yǎng)基；(2)、IOL發(fā)酵生物應器發(fā)酵，罐裝培養(yǎng)基為6L，培養(yǎng)基組成為改良淀粉培養(yǎng)基，121。C滅菌30分鐘，冷卻后，接種上述克氏瓶種子二瓶，下培養(yǎng)3648小時，即可放罐，此發(fā)酵液可用于制造微生物菌劑。(3)、抗黃瓜枯萎病海洋枯草芽孢桿菌微生物制劑的制造，按照權力要求3及4所述得到的柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液，在實驗室鏡檢菌體生長良好，每毫升發(fā)酵液菌體細胞達到2億個CFU以上，對黃瓜枯萎病的拮抗抑菌圈直徑在18mm以上，無雜菌，即為合格，可以制造微生物制劑①液體制劑將10L罐發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液直接罐裝在清潔的塑料筒中保存，含菌細胞數(shù)達2億個CFU/ml;②固體制劑將發(fā)酵液用無菌草炭粉混合拌勻，使含水量在1520%左右，含菌細胞數(shù)在0.5億個CFU/ml1億個CFU/ml;本發(fā)明具有如下的優(yōu)點1、所得到的海洋枯草芽孢桿菌3512A能夠對黃瓜枯萎病進行有效的防治，防病效率達70%以上，并且對人畜無害，不污染環(huán)境，避免大量應用化學農(nóng)藥帶來的弊端，滿足人們對黃瓜這種可生食蔬菜的綠色要求。別且能夠促進黃瓜的生長，增加黃瓜產(chǎn)量，可以認為是一優(yōu)良的生防菌株或PGPR菌株，具有開發(fā)為高質量的微生物生防制劑產(chǎn)品或PGPR產(chǎn)品的潛力。2、所得到的海洋枯草芽孢桿菌3512A，在黃瓜根際土壤中定殖能力強(進行黃瓜盆栽試驗，接種3512A菌后6周，測定其在黃瓜根際土壤中的定殖密度1(^CFU/克'土，從土壤中分離出來的定殖的3512A菌對靶標菌的抑菌圈直徑不低于實驗室測定的結果，抑菌圈直徑達18.00mm)，對黃瓜生長無抑制，并有促進生長的作用，有利于應用推廣。本發(fā)明中所涉及的Bac/〃w3512A，已經(jīng)于2007年4月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo.M207051。圖1為海洋細菌3512A(即為本發(fā)明中涉及的^7c/〃M"Mto7^3512A)和相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。具體實施例方式本發(fā)明采用常規(guī)的平皿相互拮抗篩選模型和定向篩選相結合的方法，其具體步驟(1)在海洋珊瑚生長區(qū)域，直接選取健康的、活的柳珊瑚有機體，在無菌條件下清洗，取其生長點部位，切成0.51.0cm長小塊，裝入無菌采樣小瓶內(nèi)，放置在水瓶(或液氮罐)中，帶回實驗室，以樣品無菌水=1:1研磨，獲得新鮮柳珊瑚細胞提取液；(2)對新鮮柳珊瑚細胞提取液，采用專用培養(yǎng)基平板稀釋法(培養(yǎng)基為加麥芽汁牛肉膏蛋白胨牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，麥芽汁1%，瓊脂2%，pH7.0-7.2。121°C，滅菌20分鐘)中涂有0.001~0.01%柳珊瑚)，分離海洋芽孢細菌，在盛有上述培養(yǎng)基的平皿上，涂刮平板，然后放入到保溫箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)35天后，對平皿上長出的單菌落純的微生物經(jīng)再劃線純化后，挑典型單菌落移至斜面保藏；(4)以已經(jīng)分離得到黃瓜根際土壤中主要致害真菌為靶標菌株，與已經(jīng)分離純化得到海洋芽孢桿菌3512A菌株之間進行拮抗試驗，檢測其對黃瓜枯萎病菌的抑制作用。具體為以黃瓜枯萎病菌為靶子菌，按常規(guī)方法在平皿上進行對峙的拮抗試驗，在25-30。C保溫36-60小時，取出平皿，檢測3512A菌株對靶子菌的抑菌圈大小。(5)通過盆栽試驗篩選出具有高效拮抗活性且能在黃瓜根際土壤中定殖的，在原位土壤中測定有明顯抑制黃瓜根際土壤中致害真菌(尖孢鐮刀菌萎蔫專化型)作用的拮抗菌株，此菌株同時要對黃瓜生長無抑制作用，或略有促進生長作用，進行挑選，經(jīng)16SrDNA分析確定其為枯草芽孢桿菌，所得到的菌株，即為高效菌株3512A。用于防治黃瓜枯萎病的海洋枯草芽孢桿菌3512A已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCCNo,M207051。海洋枯草芽孢桿菌3512A具有典型枯草芽孢桿菌特征，芽孢柱狀、中生、不膨大。菌體為桿狀或短桿狀，革蘭氏染色陽性，菌落呈淡黃色、不透明、干燥、表面粗糙，邊緣不規(guī)則。水解淀粉，接觸酶陽性，利用擰檬酸鹽，能在7XNaCl和45"C生長，分子生物學鑒定3512A菌株的16SrDNA序列與枯草芽孢桿菌的序列相似性最高為99.4%。3512A菌株能在黃瓜根際土壤中高密度定殖(〉106CFU/gD，對黃瓜枯萎病有很好的防治效果(抑菌率〉60%，防效達70%以上);通過本發(fā)明制造出來的防治黃瓜枯萎病的海洋枯草芽孢桿菌制劑，是一種高效、無毒、安全、無殘留、能促進黃瓜綠色生態(tài)體系發(fā)展的微生物制劑，有發(fā)展前途。用本發(fā)明篩選方法得到的海洋枯草芽孢桿菌(^ac///^^M叫3512A，具有高效防治黃瓜枯萎病的作用，并對黃瓜生長無抑制作用且具有很好的促生長效果，對環(huán)境友好。防治黃;iy古萎病的海洋枯草芽孢桿菌制劑的制造方法步驟如下-1、樣品采集枯草芽孢桿菌Bac///^3512A，是從南海柳珊瑚中分離得到。具體方法如下在南海柳珊瑚生長區(qū)域，直接選取健康的、活的柳珊瑚有機體，在無菌條件下清洗，取其生長點部位，切成0.51.0cm長小塊，裝入無菌采樣小瓶內(nèi)，放置在水瓶(或液氮罐)中，帶回實驗室，待分離篩選目的菌所用。2、菌株初篩樣品無菌水=1:1研磨，獲得新鮮柳珊瑚細胞提取液；對新鮮柳珊瑚細胞提取液，采用平板稀釋法(培養(yǎng)基中涂有0.0010.01%柳珊瑚)，分離海洋芽孢細菌，在盛有上述專用培養(yǎng)基的平皿上，涂刮平板，然后放入到保溫箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)35天后，對平皿上長出的單菌落純的微生物經(jīng)再劃線純化后，挑典型單菌落移至斜面保藏3、菌株復篩將上述初篩得到的單菌落斜面試管菌株進行平皿活化，28t:培養(yǎng)48小時，采用平皿拮抗試驗方法，以黃瓜枯萎病菌為靶子菌，按常規(guī)方法在平皿上進行對峙的拮抗試驗，在2528。C保溫箱中保溫培養(yǎng)4884小時，取出對峙拮抗試驗平皿，檢測各個柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌菌株對黃瓜枯萎病耙子菌的抑菌圈大小，抑菌直徑達到18mm或18ram以上為合格，選擇編號保存。4、定殖試驗將海洋枯草芽孢桿菌試管斜面菌種，移接擴繁，然后在25-3(TC保溫培養(yǎng)36-60小時，此時海洋枯草芽孢桿菌菌苔己長得十分豐滿，可以用無菌水刮洗下來，制成菌懸液，使每毫升菌懸液中的菌體細胞數(shù)達到10億個CFU以上，即達到109濃度，可以與黃瓜盆栽土壤均勻混合，使每克土壤中的試驗測定的枯草芽孢桿菌的細胞數(shù)達105CFU以上，即每克土壤中達到IO萬個CFU細胞以上；土壤裝入盆內(nèi)，每盆播種20粒黃瓜種子，按盆栽試驗常規(guī)方法管理，接入土中6周后，海洋枯草芽孢桿菌細胞數(shù)穩(wěn)定在1(^CFU/克，土水平的，說明得到的海洋枯草芽孢桿菌能在黃瓜根際土壤中定殖，此菌株為有效菌株，經(jīng)測量對黃瓜的生長無抑制作用，而卻有一定促進生長的效果(株高、葉綠素含量、結果重量都較不接菌的對照有所增加，試驗與對照盆栽各4盆，盆栽試驗時間不短于三個月)。葉綠素含量測定采用丙酮提取法，分別在幼苗期和開花結果期各測一次，取黃瓜植株已全部展開的第2片葉(功能葉)測定葉綠素含量。經(jīng)測定，接種海洋枯草芽孢桿菌后黃瓜葉片的葉綠素含量較對照高5%，差異達到顯著水平。從土壤中分離出來的已定殖的枯草芽孢桿菌對耙標菌的抑菌圈直徑不低于接種前實驗室測定的結果，抑菌圈直徑》18mm。經(jīng)檢測，此海洋枯草芽孢桿菌能夠在無機磷培養(yǎng)基上生長且產(chǎn)生明顯的透明圈，說明其有解磷的作用，即能夠促使土壤中難溶性的磷變成可溶性的磷，進而促進黃瓜對磷元素的吸收。另外其無菌發(fā)酵濾液稀釋IOOO倍后能夠顯著促進水培黃瓜幼苗根系的生長，說明有一定的生長刺激作用。海洋枯草芽孢桿菌3512A在黃瓜根際定殖試驗和它對黃瓜生長的促進及增產(chǎn)的結果表明，此菌株可供為進一步的推廣應用進行擴大試驗。5、海洋枯草芽孢桿菌發(fā)酵(1)、克氏瓶種子培養(yǎng)，采用500ml容積克氏瓶，裝60ml培養(yǎng)基，12rC滅菌30分鐘，冷卻后放斜面，接種海洋枯草芽孢桿菌，而后將此克氏瓶放在2528"C保溫箱中保溫培養(yǎng)4872小時，取出即可作為種子用。克氏瓶種子培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為改良淀粉培養(yǎng)基，其組成為可溶性淀粉2%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%,NaC10.5%，pH自然。'(2)、10L發(fā)酵生物反應器發(fā)酵，罐裝培養(yǎng)基為6L，培養(yǎng)基組成為改良淀粉培養(yǎng)基，即可溶性淀粉2%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，NaC10.5%，其余為水，pH自然。121。C滅菌30分鐘，冷卻后，接種上述克氏瓶種子二瓶，種子用200ml無菌水洗下后，應用無菌技術接種至10L容積生物反應器中，發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件為罐壓0.05Mpa，罐溫28。C士rC，通風量為6L/min，攪拌速度為200rpm。在此條件下培養(yǎng)3648小時，即可放罐，此發(fā)酵液可用于制造微生物菌劑。(3)、抗黃瓜枯萎病海洋枯草芽孢桿菌微生物制劑的制造，上述得到的柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液，在實驗室鏡檢菌體生長良好，每ml發(fā)酵液菌體細胞達到2億個CFU以上，對黃瓜枯萎病的拮抗抑菌圈直徑在18mm以上，無雜菌，即為合格，可以制造微生物制劑-①液體制劑將10L罐發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液直接罐裝在清潔的塑料筒中保存，含菌細胞數(shù)達2億個CFU/ml;②固體制劑將草炭粉12rC滅菌30min，涼干后與發(fā)酵液混合拌勻，1520%左右，含菌細胞數(shù)在0.5億個CFU/ml1億個CRJ/ml;用本發(fā)明獲得用于防治黃瓜枯萎病的海洋枯草芽孢桿菌3512A有效菌株，經(jīng)測定具有如下特征(1)菌體的形態(tài)特征海洋細菌3512A具有典型的芽孢菌特征，菌體短桿狀，革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，有芽孢，芽孢橢圓、中生、不膨大。菌落淡土黃色、不透明、表面粗糙、邊緣不規(guī)則。(2)生理生化特征淀粉水解、鹽耐受以及碳源利用，測定結果見表2。海洋細菌3512A接觸酶陽性，45。C可以生長，7%NaCl生長，能夠水解淀粉；利用葡萄糖、棉子糖、木糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖、果糖、木聚糖、糊精、淀粉、丙二酸鹽、纖維二糖、明膠；能夠利用檸檬酸鹽，不能利用半乳糖、肌醇、山梨糖、鼠李糖、菊糖、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽。(3)分子生物學鑒定海洋細菌3728的16SrDNA序列與枯草芽孢桿菌(Bac///^的序列相似性最高為99.5%，在系統(tǒng)發(fā)育樹(進化樹)中也與枯草芽孢桿菌(5ac/〃^5W^7^)處于同一分枝上，見附圖。(4)海洋細菌3512A對黃瓜枯萎病菌的抑制作用海洋細菌3512A對Fw^n'i/w具有很強的抑菌活性，抑菌圈直徑達到18.3mm，無菌發(fā)酵液稀釋10倍，其抑菌率達到70.83%。應用例將上述篩選得到的海洋枯草芽孢桿菌3512A試管斜面菌種，移接擴繁，然后在28"C保溫培養(yǎng)48h，此時菌苔已長得十分豐滿，可以用無菌水刮洗下來，制成菌懸液，使每毫升菌懸液中的菌體細胞數(shù)達到10億個CFU以上，即達到109濃度，可以與黃瓜盆栽土壤(潮棕壤)均勻混合，使每克土壤中的試驗測定的枯草芽孢桿菌的細胞數(shù)達105CFU以上，即每克土壤中達到IO萬個CFU細胞以上；土壤裝入盆內(nèi)，每盆播種20粒黃瓜種子，按盆栽試驗常規(guī)方法管理，每周定期測定在土壤中定殖的海洋細菌數(shù)目。定殖測定采用稀釋平板法，取黃瓜根際土壤少許，用無菌水進行稀釋，在牛肉膏蛋白胨加麥芽汁瓊脂平板上涂布，28'C保溫培養(yǎng)48h。挑選與所接3512A形態(tài)一致的典型菌落進行計數(shù)，同時抽查對黃瓜枯萎病菌的抗菌活性，應達到90%以上的菌落具有抗菌活性。結果證明此分離自柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌菌株3512A，可在黃瓜根際土壤中定殖，接種6周后，測定細胞數(shù)能穩(wěn)定在106CFU/克土的水平，10周后細胞數(shù)穩(wěn)定在10510fiCFU/克土的水平，說明為有效菌株。海洋枯草芽孢桿菌3512A發(fā)酵(1)、克氏瓶種子培養(yǎng)，采用500ml容積克氏瓶，裝60ml培養(yǎng)基，12rC滅菌30分鐘，冷卻后放斜面，接種海洋枯草芽孢桿菌，而后將此克氏瓶放在2528'C保溫箱中保溫培養(yǎng)4872小時，取出即可作為種子用。克氏瓶種子培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為改良淀粉培養(yǎng)基，其組成為可溶性淀粉2%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，NaC10.5%，pH自然。(2)、10L發(fā)酵生物反應器發(fā)酵，罐裝培養(yǎng)基為6L，培養(yǎng)基組成為改良淀粉培養(yǎng)基，即可溶性淀粉2%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，NaC10.5%，其余為水，pH自然。12rC滅菌30分鐘，冷卻后，接種上述克氏瓶種子二瓶，種子用200ml無菌水洗下后，應用無菌技術接種至10L容積生物反應器中，發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件為罐壓0.05Mpa，罐溫28。C士rC，通風量為6L/min，攪拌速度為200rpm。在此條件下培養(yǎng)3648小時，即可放罐，此發(fā)酵液可用于制造微生物菌劑。(3)、抗黃瓜枯萎病海洋枯草芽孢桿菌微生物制劑的制造，上述得到的柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液，在實驗室鏡檢菌體生長良好，每ml發(fā)酵液菌體細胞達到2億個CFU以上，對黃瓜枯萎病的拮抗抑菌圈直徑在18mm以上，無雜菌，即為合格，可以制造微生物制劑①液體制劑將10L罐發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液直接罐裝在清潔的塑料筒中保存，含菌細胞數(shù)達2億個CFU/ral;②固體制劑將草炭粉12rC滅菌30min，涼干后與發(fā)酵液混合拌勻，1520%左右，含菌細胞數(shù)在0.5億個CFU/ml1億個CFU/ml。經(jīng)測定對黃瓜有一定促進生長的效果(株高、葉綠素含量、結果重量都較不接菌的對照有所增加，試驗與對照盆栽各4盆，盆栽試驗時間不短于三個月)。葉綠素含量測定采用丙酮提取法，分別在幼苗期和開花結果期各測一次，取黃瓜植株已全部展開的第2片葉(功能葉)測定葉綠素含量。接種海洋枯草芽孢桿菌3512A后黃瓜葉片的葉綠素含量較對照高5%，差異達到顯著水平。經(jīng)檢測，此海洋枯草芽孢桿菌能夠在無機磷培養(yǎng)基上生長且產(chǎn)生明顯的透明圈，說明其有解磷的作用，即能夠促使土壤中難溶性的磷變成可溶性的磷，進而促進黃瓜對磷元素的吸收。另外其無菌發(fā)酵濾液稀釋1000倍后能夠顯著促進水培黃瓜幼苗根系的生長，說明有一定的生長刺激作用。表13512A對開花結果期黃瓜枯萎病的防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1.一株海洋枯草芽孢桿菌，其特征在于其為與柳珊瑚共棲的海洋枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis3512A，已經(jīng)于2007年4月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCCNo.M207051。2、—種權利要求1所述海洋枯草芽孢桿菌的分離篩選方法，其特征在于(1)菌株初篩從中國南海柳珊瑚生長區(qū)域，直接選取健康的活的柳珊瑚有機體生長點部位，切成0.51.0cm長的小塊，裝入無菌采樣小瓶內(nèi)，帶回實驗室，以體積比樣品無菌水=0.5-1:l研磨，獲得新鮮柳珊瑚細胞提取液；采用常規(guī)芽孢桿菌的篩選方法，以平皿相互拮抗篩選模型和定向篩選相結合的方法，即將柳珊瑚細胞提取液小瓶置于8(TC恒溫水浴中，熱處理1015分鐘，取出冷卻，用稀釋平板法涂平皿，進行初篩，初篩平皿放在2528t:保溫箱中保溫培養(yǎng)4872小時，以形態(tài)特征挑選菌落褶皺具典型枯草芽孢菌形態(tài)的單菌落，移接斜面保存，分別編號，以便復篩；(2)菌株復篩將上述初篩得到的單菌落斜面試管菌株進行平皿活化，28°C、24-60小時，采用平皿拮抗試驗方法，以黃瓜枯萎病菌為靶子菌，按常規(guī)方法在平皿上進行對峙的拮抗試驗，在2528。C保溫箱中保溫培養(yǎng)4884小時，取出對峙拮抗試驗平皿，檢測各個柳珊瑚海洋枯草芽孢桿菌菌株對黃瓜枯萎病靶子菌的抑菌圈大小，抑菌直徑達到18mm或18誦以上為合格，選擇編號保存。3、一種防治黃瓜枯萎病制劑，其特征在于以權利要求l所述海洋枯草芽孢桿菌Sac/Z/wsw^7/s3512A的發(fā)酵液為活性成份。4、按照權利要求3所述防治黃瓜枯萎病制劑，其特征在于所述發(fā)酵液的菌體在實驗室鏡檢菌體生長良好，每ml發(fā)酵液菌體細胞達到2億個CFU以上，對黃瓜枯萎病的拮抗抑菌圈直徑在18,或18腿以上，無雜菌，即為合格，可以制造微生物制劑；①液體制劑將發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵液直接罐裝在清潔的塑料瓶或桶中保存，含菌細胞數(shù)達2億個CFU/ml，即可直接作為液體制劑；②固體制劑將發(fā)酵液用無菌草炭粉混合拌勻，使含水量在1520%，含菌細胞數(shù)在0.51億個CFU/ml，即為固體制劑。5、按照權利要求3所述防治黃瓜枯萎病制劑，其特征在于所述海洋枯草芽孢桿菌6"c/〃mwto7^3512A的發(fā)酵流程為，1)、克氏瓶種子培養(yǎng)，采用500ml容積克氏瓶，裝60ml改良淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成可溶性淀粉1-2%，牛肉膏0.3-0.8%，酵母膏0.3-0.8%，NaCl0.3-0.8%，自然pH;121"滅菌15-30分鐘，冷卻后擺放斜面，接種海洋枯草芽孢桿菌，而后將此克氏瓶放在2528。C保溫箱中保溫培養(yǎng)4872小時，取出即可作為種子用；(2)、采用IOL發(fā)酵生物應器發(fā)酵，罐裝改良淀粉培養(yǎng)基為6L，121"C滅菌15-30分鐘，冷卻后，接種上述克氏瓶種子二瓶；發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件為罐壓0.05Mpa，罐溫28。C士rC，通風量為4-7L/min，攪拌速度為180-300rpm;在此條件下培養(yǎng)3648小時，即可放罐，此發(fā)酵液可用于制造微生物菌劑。全文摘要本發(fā)明涉及黃瓜枯萎病防治及海洋微生物應用，具體的說是一株海洋枯草芽孢桿菌及其分離和防治黃瓜枯萎病制劑，其為Bacillussubtilis3512A，保藏號為CCTCCNo.M207051，采用方法(1)從南海柳珊瑚生長區(qū)域，直接選取健康的活的柳珊瑚有機體生長點部位切成小塊，裝入無菌采樣小瓶內(nèi)，帶回實驗室，以樣品無菌水＝1∶1研磨，獲得新鮮柳珊瑚細胞提取液；(2)以平皿相互拮抗篩選模型和定向篩選相結合的方法，篩選出抗黃瓜枯萎病與柳珊瑚共棲的海洋枯草芽孢桿菌；(3)以此菌株為微生物種子，通過發(fā)酵，制成能有效防治黃瓜枯萎病的微生物制劑。本發(fā)明操作簡便，可推廣應用。文檔編號C12R1/125GK101575581SQ20081001134公開日2009年11月11日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權日2008年5月9日發(fā)明者麗劉,偉李,潘華奇,楠王,王書錦,胡江春,薛德林申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所