專利名稱：利用異源啟動子控制大腸桿菌基因組n-乙酰基轉移酶表達重組菌及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種利用異源啟動子控制大腸桿菌基因組 N-乙酰基轉移酶表達重組菌及應用。
背景技術：
蛋白和多肽的N-末端乙酰化修飾是真核細胞中普遍存在的一種修飾，50%以上的真核細胞胞漿蛋白都有這種修飾。初步的功能研究表明N-末端乙酰化可通過改變N-端的電荷性，封閉N-端等方式，對許多蛋白和多肽的空間結構、配體識別、抗降解等特性產生重要影響。如小分子GIPaes-Arl3P蛋白的N-末端乙酰化修飾促進了其與膜受體Syslp/ hSysl的識別，并使其定位到膜上。胎兒血紅蛋白的N-末端乙酰化可以使其四聚體的解聚能力提高30倍。胸腺素α 1 (thymosin α 1, T α 1)的Ν_末端乙酰化對其在血漿中的穩定性具有重要作用。除了 Τα 1外，還有如黑色素細胞刺激素(Melanocyte-Mimulating Hormones, a -MSH)、胸腺素β 4 (Thymosin β 4，T β 4)等一批在臨床上具有重要應用的多肽也需要N-末端乙酰化修飾。與真核生物中的普遍存在現象明顯不同的是，原核生物的N-末端乙酰化修飾非常罕見。在大腸桿菌內源蛋白中已知發生N-末端乙酰化修飾的只有核糖體亞基L7、S5、 S18、延長因子EF-Tu和伴侶蛋白kcB等為數不多的幾種蛋白。大腸桿菌中已經發現的參與蛋白和多肽的N-末端乙酰化修飾的乙酰基轉移酶只有負責核糖體亞基S5乙酰化修飾的 RimI，核糖體亞基S18乙酰化修飾的RimJ，和核糖體亞基L7乙酰化修飾的RimL。這些乙酰基轉移酶有很強的底物專一性。除上述每個酶對應的特異性底物外，未知其能修飾大腸桿菌的其它蛋白或多肽。胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫調節多肽，它們包括胸腺素 α原、胸腺素a 1、胸腺素a 11及其各種融合蛋白等。胸腺素a 1和胸腺素a 11是胸腺素 α原在體內降解的產物，它們分別包括了胸腺素α原的化端觀和35個氨基酸。不同物種的胸腺素α具有很高的保守性。胸腺素α的氨基酸序列上某些位點存在多態性，如其 N-端第13位氨基酸殘基，有的是蘇氨酸，有的是異亮氨酸，它們具有相同或相似的功能。胸腺肽是一類動物胸腺中提取的包含各種胸腺素α及其它胸腺來源肽類的免疫制劑，已廣泛用于病毒性肝炎、腫瘤等的治療。但動物提取的胸腺肽存在成分復雜，純度低， 其中混有動物來源的污染物，易產生過敏反應等問題。化學合成的N-乙酰化胸腺素al， 是一種采用多肽化學合成方法制備的N-乙酰化胸腺素a 1，此種方法獲得的T a 1純度高、 活性高、沒有明顯的副反應，如kiClone公司的“日達仙”，已被包括我國在內的多個國家批準用于病毒性肝炎的治療獲作為免疫調節藥物；但化學合成N-乙酰化胸腺素a 1這樣一個觀個氨基酸的多肽，合成和純化工藝復雜，得率較低，因此制品價格高，限制了該藥的廣泛應用。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種重組菌。本發明提供的一種重組菌，為將胸腺素α的編碼基因導入重組菌A中得到的重組菌；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個氨基酸殘基與序列表中序列 3的N末端的觀個氨基酸相同或其N末端的觀個氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的28個氨基酸至少具有90%同源性；所述重組菌A為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙酰基轉移酶編碼基因的上游，用于啟動所述乙酰基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。所述胸腺素α的編碼基因通過重組載體導入所述的重組菌A;所述重組載體為將所述胸腺素α編碼基因插入表達載體中，得到表達胸腺素α 的重組載體；所述的誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體Τ7、P。Pk啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、；所述乙酰基轉移酶為RimL或RimJ，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。所述胸腺素α編碼基因為一種多核苷酸，其核苷酸序列為序列表中的序列4或與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5’末端起84 位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子；所述表達載體優選為pBV220或ρΕΤ2^。所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導型啟動子為噬菌體Τ7啟動子或啟動子，所述噬菌體T7啟動子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述I\PK啟動子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第2100-2411位核苷酸。本發明的另一個目的是提供一種重組菌。本發明提供的重組菌，為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙酰基轉移酶編碼基因的上游，用于啟動所述乙酰基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。所述誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體Τ7、PL, Pe啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJV
所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導型啟動子為噬菌體T7啟動子或啟動子，所述噬菌體T7啟動子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述I\PK啟動子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第2100-2411位核苷酸；所述乙酰基轉移酶為RimL或RimJ，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。上述另一個目的提供的重組菌按照如下方法制備1)將pKD46質粒導入宿主菌中，得到重組菌1 ；2)將含有T7啟動子的DNA分子或含有啟動子DNA分子導入步驟1)得到的重組菌1中，得到重組菌2;3)將步驟2、得到的重組菌2分別在含氯霉素的培養基和含氨芐青霉素的培養基中培養，若能在含氯霉素的培養基上生長，但不在含氨芐青霉素的培養基生長的即為重組菌；所述含有T7啟動子的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列5或序列表中的序列6 ；所述含有啟動子DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列9。上述重組菌在制備N-乙酰化胸腺素中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的第三個目的是提供一種制備N-乙酰化胸腺素α的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟發酵所述的重組菌，收集發酵產物，即得到N-乙酰化胸腺素α。所述發酵的溫度為42°C，所述發酵時間為12h。本發明的實驗證明，本發明構建了 N-乙酰基轉移酶和胸腺素α的編碼基因進行共表達得到的重組菌，發酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙酰化胸腺素α，不僅可以提高N-乙酰化胸腺素α的產率，而且可以通過減少非乙酰化胸腺素α的比例，方便 N-乙酰化胸腺素α的分離，具有明顯的應用前景。


圖1為red同源DNA分子1結構示意2為大腸桿菌中T7誘導表達rimL對α乙酰化水平的影響(橫坐標表示保留時間(min)，縱坐標代表紫外吸收值(mAU))
圖3為red同源DNA分子2結構示意4為大腸桿菌中T7誘導表達rimj對α乙酰化水平的影響(橫坐標表示保留時間(min)，縱坐標代表紫外吸收值(mAU))圖5為red同源DNA分子3結構示意6為大腸桿菌中ΡΛ誘導表達rimj對α乙酰化水平的影響(橫坐標表示保留時間(min)，縱坐標代表紫外吸收值(mAU))
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述的序列均可人工合成。實施例1、利用T7啟動子的乙酰基轉移酶rimL和胸腺素α原共表達的重組菌采用Red重組技術，將帶有乳糖操縱子的T7啟動子(來源于PET22b質粒，該質粒購自Novagen公司)插入到大腸桿菌BL21 (DE3)的N-乙酰基轉移酶rimL基因開放閱讀框 (ORF)的上游，該菌基因組中帶有的受乳糖啟動子控制的T7RNA聚合酶基因。當培養基中加入乳糖或其類似物，如IPTG時，乳糖啟動子控制的T7RNA聚合酶基因表達，合成的T7RNA聚合酶與人為插入到rimL基因開放閱讀框(ORF)的上游的T7啟動子結合，同時T7啟動子下游的乳糖操縱子去阻遏，控制N-乙酰基轉移酶rimL基因的高效轉錄，從而實現N-乙酰基轉移酶rimL的過表達。具體方法包括一、兩端帶有rimLORF上游同源臂和ORF起始區同源臂及FRT位點的氯霉素抗性基因的擴增1、氯霉素抗性基因的PCR擴增。合成引物5Cm AgCgATTgTgTAggCTggAg3Cm TAATTAACggCTgACATgggAATTAg提取BW25141/pKD3 (購自耶魯大學的CGSC，CGSC#7631)的質粒pKD3為模板，以 5Cm和3Cm為引物進行PCR擴增，得到105^pPCR產物，經測序為序列5的自5’末端第 41-1095位核苷酸，將該PCR產物命名為Cm。2、帶有乳糖操縱子的T7啟動子DNA片斷的PCR擴增合成引物3Cm5T7 cTAATTcccATGTcAGccGTTAATTAtcgagatctcgatcccgcga3T7catatgtatatctccttcttaaag其中3Cm5T7引物帶有氯霉素抗性基因3’序列和T7啟動子的5’序列。以PET2^質粒為模板，以3T7和3Cm5T7為模板進行PCR擴增，得到的HObpPCR 產物，經過測序，其中T7啟動子為序列表中序列5的第1119-1135位核苷酸，將該PCR產物命名為T7。3、帶有rimLORF上游同源臂和ORF起始區同源臂的Red重組用DNA的PCR擴增合成引物
5rimLCm AGCCAGGCGGCTTTTTTAACAACTGCATGGATTGACTGGAAgCgATTgTgTAggCTggArimL0RF5pt7 GTMTTCMGTGATTCGCTTACTTTTATCGTTTCAGTCATatgtatatctccttctta其中5rimLCm含有rimLORF上游同源臂(劃線部分)和氯霉素抗性基因5’序列， rimL0RF5pt7為rimLORF起始區同源臂(劃線部分)和T7啟動子5’序列的反向互補序列。以上述獲得的制備的DNA片段Cm和DNA片段T7各Iul為模板，以5rimLCm和 rimL0RF5pt7為引物，進行PCR擴增，得到lM6bpPCR產物，經過測序，核苷酸序列為序列5， 命名為Red重組DNAl，結構示意圖如圖1所示。因擴增的DNA片段中可能混有質粒PKD3，可能造成假陽性現象，所以將回收的DNA 片段用Dpn I 37°C恒溫水浴處理lh，以消除質粒pKD3。4、同源重組陽性克隆BL21 (DE3) /T7rimL的獲得1)大腸桿菌 BL21 (DE3) /pKD46 的制備將pKD46 質粒(genbank AY048746，其構建方法見 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可從各種保藏中心獲得，如耶魯大學的CGSC，該中心的帶有pKD46質粒的大腸桿菌BW25141/pKD46的保藏號為7634。抗氨芐青霉素。該質粒含有RED重組酶。) 轉化BL21(DE3)(購自北京博大泰克生物基因技術有限公司，產品目錄號CD601)涂布含氨芐青霉素的LB平板，30°C過夜培養，次日挑取單克隆，提取質粒，送去測序即為pKD46質粒， 將含有該質粒的重組菌命名為BL21 (DE!3)/pKD46。2)兩端帶有rimLORF上游同源臂和ORF起始區同源臂及FRT位點的氯霉素抗性基因的DNA片段的電轉化將上述獲得的BL21 (DE3) /pKD46接種于LB培養基中30°C培養至OD6tltlnm約為0. 2， 加入終濃度為0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)誘導約Ih (OD600nm小于0. 6)，將細胞置冰中迅速冷卻lOmin，以4000rpm于4°C離心lOmin，用冰冷的10%甘油將細胞洗三次，最后將細胞用冰冷的10%甘油濃縮至原菌液體積的1/200，100 μ 1/管分裝，-70°C保存備用。每100 μ L感受態細胞加入0. 2-1 μ g上述制備的Red重組DNA，混勻后轉至0. Icm電擊杯中，用Bio-Iab 電擊儀作電擊轉化。電擊后立即加入600 μ 1 LB培養基，150rpm，30°C培養lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C過夜培養，pKD46在37°C培養過程中不穩定，可自發丟失，次日挑取單克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上劃線培養分離單菌落，即為獲得Red重組DNAl 的單克隆。將獲得Red重組DNAl的單克隆分別接種含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37°C過夜培養，能在Cm平板上生長，但不能在Amp平板生長的即為丟失PKD46質粒的克隆。提取丟失pKD46質粒的克隆的質粒，用合成的鑒定引物5rimLPout和3rimLpout 進行PCR鑒定，5rimLPout GCGTCAAAGAGGTGTAAACT3rimLpout GATAAAGAGGTTTGACGTGA將PCR產物經瓊脂糖電泳分析，得到1Kb的為帶有Cm基因的T7啟動子插入大腸桿菌rimL基因ORF上游的陽性質粒，得到IOObp的為陰性克隆不含有Cm基因的T7啟動子，將含有陽性質粒的克隆命名為BL21 (DE3) /T7rimL。5、重組菌 BL21 (DE3)/T7rimL 表達 rimL
將BL21(DE3)/T7rimL用濃度為ImM的IPTG (異丙基-D-硫代半乳糖苷，購自上海生工生物工程技術服務有限公司)誘導(37°c培養培養池后，誘導他)，收集上清，進行 SDS-PAGE電泳，得到20KD的片段，說明表達出rimL。二、利用插入基因組中的T7啟動子構建含有表達N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重組菌pBV220-proT α (Thr13)按照如下方法制備將ProT α (Thr13)基因(一種胸腺素 α，其核苷酸序列為序列4，其氨基酸序列為序列幻插入pBV220載體(購自上海閃晶分子生物科技有限公司。)的BamHI和EcoRI位點，得到的載體，proT α基因由pBV220載體上的PJ3k啟動子控制。將上述獲得的質粒pBV220-proTa (Thr13)電擊轉化入上述一得到的BL21 (DE3)/ T7rimL中，得到轉化子，提取質粒，經過測序，為pBV220-prOT a (Thr13)，將含有該質粒的菌命名為 BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))。用同樣方法，將pBV220-proT a (Thr13)電擊轉化BL21 (DE3)中，得到轉化子，提取質粒，結果為pBV220-proT a (Thr13)，將含有該質粒的菌命名為BL21 (DE3) (proT a (Thr13))。實施例2、BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))制備 N-乙酰化胸腺素 α 原1、蛋白粗提液將BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))和對照菌 BL21 (DE3) (proT a (Thr13))分別接種于50ml LB液體培養基中，37°C搖床培養過夜，然后轉接至含500ml培養基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM)的3L搖瓶中，37 °C培養培養 2h后，加入1. 25ml 0. 2mol/L的IPTG (0. 5mM)誘導，繼續培養6h，發酵液離心，收集菌體。將收集的菌體用水重懸(每克菌加IOml水)，超聲波破壁，離心收集上清，在上清液中加入冰乙酸調節PH至4. 5，靜置30分鐘，離心收集上清液，即為蛋白粗提液。2、純化1)SP FFOl. 6 X 20cm柱純化(陽離子交換層析)將上述獲得的上清液(蛋白粗提液)用SP FFcm.6X20cm柱(介質購自美國GE 公司，空柱購自華美實驗儀器廠)進行純化。具體條件為A液QOmM乙酸鈉和乙酸組成的緩沖液，PH4. 5)，B液(A液+IM NaCl)，SP FF柱先用A液平衡，然后從A通道將上述含有 N-乙酰化胸腺素α的粗提液上樣至SP FF柱中，再用A液洗去未結合的蛋白，最后在0 — 30 分鐘Α從100%— 0% ;Β從100%線性梯度洗脫，分段收集洗脫液。將收集到的各級份洗脫液取樣作SDS-PAGE分析和HPLC分析，合并含胸腺素α原的洗脫液(30% -60% B洗脫液中)，獲得N-乙酰化胸腺素α原的粗制品。2) RP-HPLC 層析取樣進行RP-HPLC層析，采用ΗΡ1090高壓液相色譜儀，C18柱6 X 250mm，中科院大連化學物理所)，A液為含0. 1%TFA(體積百分含量)的純水；B液為含0. 1%TFA(體積百分含量)的色譜純乙腈，梯度洗脫0min，A 100%, B 0% ；5min，A 82%,B18% ；25min A 78%, B 22% ；28min A0%, B 100% ；30min A0%, B 100% ；31min A 100%, B0%, 214nm 紫外檢測，流速為lmL/min，分別收集保留時間為9. 9min的洗脫液，得到A峰樣品，收集保留時間為10. Imin的洗脫液，得到B峰樣品。
作圖如圖2所示，圖左對照菌BL21 (DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α原 (Thr13)；圖右:BL21(DE3) (T7rimL/proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 原(Thr13)。分別將對照菌和實驗菌收集的A峰樣品和B峰樣品分別用質譜檢測，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma二Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，質譜測定A、B兩個組分之間分子量相差42Da，B組分的分子量比A組分大42 (乙酰基的分子量)。質量肽譜確定這種分子量的增加發生在N-端肽段， 用串聯質譜對該肽段進行測序發現該肽段為N-端乙酰化修飾的胸腺素α原N-端肽段，發現乙酰化修飾發生在N端第一個氨基酸——絲氨酸殘基上。上述結果表明，峰A樣品為非乙酰化修飾的胸腺素α原，峰B樣品為乙酰化修飾的胸腺素α原。可以看出，A峰樣品為非乙酰化胸腺素α原(Thr13) ；B峰樣品為N-乙酰化胸腺素 α原(Thr13)，結合圖2所示，從圖中可以發現，對照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為41% (B峰)，而BL21 (DE3) (T7rimL/proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為82% (B峰)，這種N-乙酰化修飾率的提高，為提高產率提供了基礎，因此具有良好的應用前景。實施例3、利用Τ7啟動子的乙酰基轉移酶rimj和胸腺素α原共表達的重組菌本實施例與實施例1方法類似，也采用Red重組技術，將帶有乳糖操縱子的T7啟動子(來源于PET22b質粒，該質粒購自Novagen公司)插入到大腸桿菌BL21 (DE3)的N-乙酰基轉移酶rimj基因開放閱讀框(ORF)的上游，該菌基因組中帶有的受乳糖啟動子控制的 T7RNA聚合酶基因。當培養基中加入乳糖或其類似物，如IPTG時，乳糖啟動子控制的T7RNA 聚合酶基因表達，合成的T7RNA聚合酶與人為插入到rimj基因開放閱讀框(ORF)的上游的 T7啟動子結合，同時T7啟動子下游的乳糖操縱子去阻遏，控制N-乙酰基轉移酶rimj基因的高效轉錄，從而實現N-乙酰基轉移酶rimj的過表達。具體方法包括一、兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區同源臂及FRT位點的氯霉素抗性基因的擴增1、氯霉素抗性基因的PCR擴增，與實施例1中一的1相同，得到1055bp Cm，測序為序列6的自5，末端第41-1095位核苷酸；2、帶有乳糖操縱子的T7啟動子DNA片斷的PCR擴增，與實施例1中一的2相同， 得到140bp含T7啟動子的片段，測序，T7啟動子為序列6的自5’末端第1118-1138位核
苷酸；3、帶有rimj ORF上游同源臂和ORF起始區同源臂的Red重組用DNA的PCR擴增合成引物5rimJPcat CATTTTGGACTTTTCACAGGGTCTGGTTGCGCAGGTATAGArCrATTrTrTArrCTrrA3rimJPcat GTTAAGCGCACTTTTGGCACGTTACTGCGATAGCCAAACATatRtatatctccttctta其中5rimJPCat含有rimJORF上游同源臂(劃線部分)和氯霉素抗性基因5’序列，3rimJPcat為rimJORF起始區同源臂(劃線部分)和T7啟動子5’序列的反向互補序列。以上述制備的DNA片段Cm和DNA片段T7各Iul為模板，5rimJPcat和3rimJPcat為引物，進行PCR擴增，得到1247bpPCR產物，經過測序，核苷酸序列為序列6，命名為Red重組DNA2，結構圖如圖3所示。4、同源重組陽性克隆BL21 (DE3)/T7rimJ的獲得將pKD46 質粒(genbank AY048746，其構建方法見 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可從各種保藏中心獲得，如耶魯大學的CGSC，該中心的帶有pKD46質粒的大腸桿菌BW25141/pKD46的保藏號為7634。抗氨芐青霉素。)轉化BL21 (DE3)(購自北京博大泰克生物基因技術有限公司)涂布含氨芐青霉素的LB平板，30°C過夜培養，次日挑取單克隆，提取質粒，送去測序即為PKD46質粒，將含有該質粒的重組菌命名為BL21 (DE3)/ pKD46。2)兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區同源臂及FRT位點的氯霉素抗性基因的DNA片段的電轉化將上述獲得的BL21 (DE3) /pKD46接種于LB培養基中30°C培養至OD6tltlnm約為0. 2， 加入終濃度為0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)誘導約Ih (OD600nm小于0. 6)，將細胞置冰中迅速冷卻lOmin，以4000rpm于4°C離心lOmin，用冰冷的10%甘油將細胞洗三次，最后將細胞用冰冷的10%甘油濃縮至原菌液體積的1/200，100 μ 1/管分裝，-70°C保存備用。每100 μ L感受態細胞加入0. 2-1 μ g上述制備的Red重組DNA2，混勻后轉至0. Icm電擊杯中，用Bio-Iab 電擊儀作電擊轉化。電擊后立即加入600 μ 1 LB培養基，150rpm，30°C培養lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C過夜培養，pKD46在37°C培養過程中不穩定，可自發丟失，次日挑取單克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上劃線培養分離單菌落，即為獲得Red重組DNA2 的單克隆。將獲得Red重組DNA2的單克降分別接種含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37°C過夜培養，能在Cm平板上生長，但不能在Amp平板生長的即為丟失PKD46質粒的克隆。提取丟失pKD46質粒的克隆的質粒，用合成的鑒定引物5rimJPout和3rimJpout 進行PCR鑒定，5rimJPout ACGTCGCTTTGATAGAGAG3rimJpout ACCAGACGCACGACCAGT經瓊脂糖電泳分析，得到1Kb的為帶有Cm基因的T7啟動子插入大腸桿菌rimj 基因ORF上游的陽性質粒，得到IOObp的為陰性克隆不含有Cm基因的T7啟動子，將含有陽性質粒的克隆命名為BL21 (DE3)/T7rimJ。5、重組菌 BL21 (DE3) /T7rimJ 表達 rimj與實施例1的一的5方法相同，得到18KD的片段，證明表達出rimj。二、利用插入基因組中的T7啟動子構建含有表達N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重組菌與實施例1 的二相同，不同的是將 pBV220-proTa (Thr13)轉入 BL21 (DE3)/T7rimJ 中，得到 BL21 (DE3) (T7rimJ/proT a (Thr13))。用同樣方法，將pBV220-proT a (Thr13)電擊轉化BL21 (DE3)中，得到轉化子，提取質粒，結果為pBV220-proT a (Thr13)，將含有該質粒的菌命名為BL21 (DE3) (proT a (Thr13))。
實施例4、BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備 N-乙酰化胸腺素 α 原1、蛋白粗提液，與實施例3方法相同；2、純化1)SP FFOl. 6X20cm柱純化，與實施例3方法相同;2) RP-HPLC層析，與實施例3方法相同；分別收集保留時間為9. 9min的洗脫液，得到A峰樣品，收集保留時間為10. Imin的洗脫液，得到B峰樣品。作圖如圖4所示，圖左對照菌BL21 (DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α原 (Thr13)；圖右:BL21(DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 原(Thr13)。分別將對照菌和實驗菌收集的A峰樣品和B峰樣品分別用質譜檢測，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma二Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，質譜測定A、B兩個組分之間分子量相差42Da，B組分的分子量比A組分大42 (乙酰基的分子量)。質量肽譜確定這種分子量的增加發生在N-端肽段， 用串聯質譜對該肽段進行測序發現該肽段為N-端乙酰化修飾的胸腺素α原N-端肽段，發現乙酰化修飾發生在N端第一個氨基酸——絲氨酸殘基上。上述結果表明，峰A樣品為非乙酰化修飾的胸腺素α原，峰B樣品為乙酰化修飾的胸腺素α原。可以看出，A峰樣品為非乙酰化胸腺素α原(Thr13) ；B峰樣品為N-乙酰化胸腺素 α原(Thr13)，結合圖4所示，從圖中可以發現，對照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為40% (B峰)，而BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為82% (B峰)，這種N-乙酰化修飾率的提高，為提高產率提供了基礎，因此具有良好的應用前景。實施例5、利用PUR啟動子的乙酰基轉移酶rimj和胸腺素α原共表達的重組菌本實施例與實施例1方法類似，也采用Red重組技術，將帶有Ι\ΡΚ啟動子(來源于PBV220質粒，購自上海閃晶分子生物科技有限公司公司)插入到大腸桿菌BL21(DE3)的 N-乙酰基轉移酶rimj基因開放閱讀框(ORF)的上游。當培養基溫度上升至42°C時，PlPe 啟動子控制N-乙酰基轉移酶rimj基因的高效轉錄，從而實現N-乙酰基轉移酶rimj的過表達。具體方法包括一、兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區同源臂及FRT位點的氯霉素抗性基因的擴增1、氯霉素抗性基因的PCR擴增，與實施例1中一的1相同，得到1055bp Cm，序列9 的自5，末端第41-1095位核苷酸；2、啟動子DNA片斷的PCR擴增，方法與實施例1中一的2相同，合成引物3Cm5PLCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAATTAAGAGCGCCCTTATCTTTCCCTTTAT3PL CCTCCTTAATTTTTAACCAATGCTT以PET22b質粒為模板，以3PL和3Cm5PL為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物， 經過測序，為1342bp，經測序啟動子為序列9的自5，末端第2100-M11位核苷酸，將該PCR產物命名為PJV3、帶有rimj ORF上游同源臂和ORF起始區同源臂的Red重組用DNA的PCR擴增合成引物5rimJPcat CATTTTGGACTTTTCACAGGGTCTGGTTGCGCAGGTATAGAgCgATTgTgTAggCTggA3rimJPcat GTTAAGCGCACTTTTGGCACGTTACTGCGATAGCCAAACATcctccttaatttttaacc aatgctt其中5rimJPcat含有rimJORF上游同源臂(劃線部分)和氯霉素抗性基因5’序列，3rimJPcat為rimJORF起始區同源臂(劃線部分)和PJ3k啟動子5’序列的反向互補序列。以上述制備的DNA片段Cm和DNA片段PlPk各Iul為模板，5rimJPcat和3rimJPcat 為引物，進行PCR擴增，得到M52bpPCR產物，經過測序，核苷酸序列為序列7，命名為Red重組DNA3，結構圖如圖5所示。4、同源重組陽性克隆BL21 (DE3)/PLPErimJ的獲得將pKD46 質粒(genbank AY048746，其構建方法見 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可從各種保藏中心獲得，如耶魯大學的CGSC，該中心的帶有pKD46質粒的大腸桿菌BW25141/pKD46的保藏號為7634。抗氨芐青霉素。)轉化BL21 (DE3)(購自北京博大泰克生物基因技術有限公司)涂布含氨芐青霉素的LB平板，30°C過夜培養，次日挑取單克隆，提取質粒，送去測序即為PKD46質粒，將含有該質粒的重組菌命名為BL21 (DE3)/ pKD46。2)兩端帶有rimJORF上游同源臂和ORF起始區同源臂及FRT位點的氯霉素抗性基因的DNA片段的電轉化將上述獲得的BL21 (DE3) /pKD46接種于LB培養基中30°C培養至OD6tltlnm約為0. 2， 加入終濃度為0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)誘導約Ih (OD600nm小于0. 6)，將細胞置冰中迅速冷卻lOmin，以4000rpm于4°C離心lOmin，用冰冷的10%甘油將細胞洗三次，最后將細胞用冰冷的10%甘油濃縮至原菌液體積的1/200，100 μ 1/管分裝，-70°C保存備用。每100 μ L感受態細胞加入0. 2-1 μ g上述制備的Red重組DNA3，混勻后轉至0. Icm電擊杯中，用Bio-Iab 電擊儀作電擊轉化。電擊后立即加入600 μ 1 LB培養基，150rpm，30°C培養lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C過夜培養，pKD46在37°C培養過程中不穩定，可自發丟失，次日挑取單克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上劃線培養分離單菌落，即為獲得Red重組DNA3 的單克隆。將獲得Red重組DNA3的單克隆分別接種含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37°C過夜培養，能在Cm平板上生長，但不能在Amp平板生長的即為丟失PKD46質粒的克隆。提取丟失pKD46質粒的克隆的質粒，用合成的鑒定引物5rimJPout和3rimJpout 進行PCR鑒定，5rimJPout ACGTCGCTTTGATAGAGAG3rimJpout ACCAGACGCACGACCAGT經瓊脂糖電泳分析，得到2Kb的為帶有Cm基因的I\PK啟動子插入大腸桿菌 rimj基因ORF上游的陽性質粒，得到11Λ的為陰性克隆不含有Cm基因的啟動子，將含有陽性質粒的克隆命名為BL21 (DE3)/PLPKrimJ。5、重組菌 BL21 (DE3) /PLrimJ 表達 rimj與實施例1的一的5方法相同，得到20KD的片段，證明表達出rimj。二、利用插入基因組中的I\PK啟動子構建含有表達N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重組菌與實施例1的二相同，不同的是將pBV220_proT α (Thr13)轉入BL21 (DE3) / PLPErimJ 中，得到 BL21 (DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))。用同樣方法，將pBV220-proT α (Thr13)電擊轉化BL21 (DE3)中，得到轉化子，提取質粒，結果為pBV220-proT α (Thr13)，將含有該質粒的菌命名為BL21 (DE3) (proT α (Thr13))。實施例6、BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制備 N-乙酰化胸腺素 α1、蛋白粗提液，與實施例3方法相同；2、純化1)SP FFOl. 6X20cm柱純化，與實施例3方法相同;2) RP-HPLC層析，與實施例3方法相同；分別收集保留時間為9. 9min的洗脫液，得到A峰樣品，收集保留時間為10. Imin的洗脫液，得到B峰樣品。作圖如圖6所示，圖左對照菌BL21(DE3)(proTa (Thr13))制備的胸腺素α原 (Thr13)；圖右:BL21(DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 原(Thr13)。分別將對照菌和實驗菌收集的A峰樣品和B峰樣品分別用質譜檢測，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma^Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，質譜測定A、B兩個組分之間分子量相差42Da，B組分的分子量比A組分大42 (乙酰基的分子量)。質量肽譜確定這種分子量的增加發生在N-端肽段， 用串聯質譜對該肽段進行測序發現該肽段為N-端乙酰化修飾的胸腺素α原N-端肽段，發現乙酰化修飾發生在N端第一個氨基酸——絲氨酸殘基上。上述結果表明，峰A樣品為非乙酰化修飾的胸腺素α原，峰B樣品為乙酰化修飾的胸腺素α原。可以看出，A峰樣品為非乙酰化胸腺素α原(Thr13) ；B峰樣品為N-乙酰化胸腺素 α原(Thr13)，結合圖6所示，從圖中可以發現，對照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制備的胸腺素 α 中 N-乙酰化胸腺素 α 為 40% (B 峰)，而 BL21 (DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))制備的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α為88% (B峰)，這種N-乙酰化修飾率的提高，為提高產率提供了基礎，因此具有良好的應用前景。實施例7、用BL 21 (DE3) /T7rimJ制備各種N-乙酰化胸腺素α采用實施例3的方法制備分別表達下述表1中的各種胸腺素α (各種胸腺素α 的氨基酸序列如下表1所示，這些氨基酸序列與序列表中的序列3的N端觀個氨基酸相同或者同源性在90%以上。)的重組菌，采用實施例4的方法進行發酵和檢測，結果如下表1 所示表1制備各種N-乙酰化胸腺素α的乙酰化率重組菌名稱胸腺索α名稱胸腺索α氨基酸序列氨基酸數目N-乙酰化胸腺素α原BL21(DE3) (T7rimJ/NproT )NproTSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAEN GRD APANGNANEENGEQEADNE VDEEE EEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAES ATGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD10982%BL21(DE3 (T7rimJ/ NproT(Ilel3))NproT(Ilel3)SDAAVDTSSEITIKDLKEKKE WEEAENG RD APANGNANEENGEQEADNE VDEEEE EGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAESA TGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD10983%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT -C)NproT-CMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANGNANEENGEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDDVD9986%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT -G36A,G43A )NproT-G36A,G43AMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANANANEENAEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD.10984%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT G36A,G43A-C)NproT G36A,G43A-CMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANANANEENAEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDD VD.9986% 從上表中可以看出，按照實施例3的方法制備的重組菌經過發酵均能獲得含量高的N-乙酰化胸腺素α。
權利要求
1.一種重組菌，為將胸腺素α的編碼基因導入重組菌A中得到的重組菌；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個氨基酸殘基與序列表中序列3的 N末端的觀個氨基酸相同或其N末端的觀個氨基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個氨基酸至少具有90%同源性；所述重組菌A為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙酰基轉移酶編碼基因的上游，用于啟動所述乙酰基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。
2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于所述胸腺素α的編碼基因通過重組載體導入所述的重組菌A;所述重組載體為將所述胸腺素α編碼基因插入表達載體中，得到表達胸腺素α的重組載體；所述的誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體Τ7、ΡρΡκ啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJ\ ；所述乙酰基轉移酶為RimL或RimJ，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的重組菌，其特征在于所述胸腺素α編碼基因為一種多核苷酸，其核苷酸序列為序列表中的序列4或與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子；所述表達載體優選為PBV220或pET22b ；所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導型啟動子為噬菌體T7啟動子或啟動子，所述噬菌體T7啟動子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述動子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第 2100-2411位核苷酸。
4.一種重組菌，為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙酰基轉移酶編碼基因的上游， 用于啟動所述乙酰基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體17、&、&啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJV
6.根據權利要求4或5所述的重組菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導型啟動子為噬菌體T7啟動子或啟動子，所述噬菌體T7啟動子的核苷酸序列為序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述動子的核苷酸序列為序列表中序列9的自5’末端第 2100-2411位核苷酸；所述乙酰基轉移酶為RimL或RimJ， 所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白； 所述RimJ為如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(e)將序列表中序列8所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)與d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。
7.權利要求1-6中任一所述的重組菌在制備N-乙酰化胸腺素α中的應用。
8.一種制備N-乙酰化胸腺素α的方法，包括如下步驟發酵權利要求1-3中任一所述的重組菌，收集發酵產物，即得到N-乙酰化胸腺素α。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于 所述發酵的溫度為42°C，所述發酵時間為12h。
全文摘要
本發明公開了一種利用異源啟動子控制大腸桿菌基因組N-乙酰基轉移酶表達重組菌及應用。本發明提供的重組菌，為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙酰基轉移酶編碼基因的上游，用于啟動所述乙酰基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。本發明的實驗證明，本發明構建了N-乙酰基轉移酶和胸腺素α的編碼基因進行共表達得到的重組菌，發酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙酰化胸腺素α，具有明顯的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK102352337SQ20111022140
公開日2012年2月15日 申請日期2011年8月3日 優先權日2011年8月3日
發明者劉波, 吳軍, 唱韶紅, 鞏新, 馬清鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所