專利名稱：：一種篩選腫瘤遺傳分子標記物的方法
技術領域：
：本發明屬腫瘤分子遺傳學領域，尤其涉及腫瘤遺傳分子標記物的篩選。技術背景人體局部組織發生癌變后，在其組織形態學逐步改變的過程中，癌變細胞中會有不同的基因(或基因群)及其表達產物隨之產生變化，如果能檢測到這些分子構成方面的變化，篩選出與腫瘤遺傳相關的分子標記物，則無疑能對腫瘤的早期診斷、預后判斷、療效監測提供巨大幫助。在不同的腫瘤組織中篩選出一些起關鍵作用的基因或基因群，篩選出用于腫瘤早期診斷、分子分類、療效檢測、預后判斷等方面的分子標記物，正是當前腫瘤遺傳學上積極探索的問題。
發明內容本發明的目的在于提供一種篩選腫瘤遺傳分子標記物的方法。本發明通過以下詳細技術方案實現(1)對腫瘤組織標本和非腫瘤組織標本進行顯微切割；(2)純化組織標本，提取純化組織標本中的RNA;(3)體外轉錄、線性擴增合成aRNA，aRNA再經逆轉錄、二輪體外線性擴增制備生物素標記cRNA探針；(4)探針經片段化后與人類全基因組表達譜芯片雜交，信號掃描，輸出數據，構建腫瘤純化組織的基因表達譜；(5)運用weightedvoting算法，使用leave-one-outcross-validation對數據歸一化處理，篩選與腫瘤發生、發展過程相關的分子標記物。本發明結合使用基因芯片、顯微切割、線性擴增技術，構建并研究不同病理類型、不同臨床分期的腫瘤組織中腫瘤基因表達譜，為篩選出不同用途的腫瘤分子標記物和潛在的腫瘤藥物作用靶點提供了一種新的方法。同時本發明結合RNA保護以克服組織中RNA降解，采用顯微切割以獲得純凈的癌細胞，利用線性擴增技術解決了RNA量少問題。并且，結合現代生物信息學技術和統計學分析，從海量信息中去偽存真，通過信息分析、比對，從多種病理類型、不同臨床發展階段腫瘤組織中篩選出起關鍵作用的基因。圖1:本發明的流程示意圖。具體實施方式下面以鼻咽癌遺傳相關分子標記物的篩選為例，詳細說明本發明的具體實施。實施例l:篩選鼻咽癌分子標記物(1)收集、保存、顯微切割、純化鼻咽部組織標本①組織標本的收集保存過程門診收集鼻咽癌標本和鼻咽炎性上皮組織標本34例。組織標本分為2份，一份固定于10%甲醛溶液中送病理科獲得病理診斷書；一份保存于RNAlaterRNAStabilizationReagent。忙存于-20。C用于顯微切割、組織RNA提取。具體RNAlaterRNAStabilizationReagent存儲組織標本程序為普通1.5ml塑料試管經滅活RNA酶處理，每管預置l~1.5mlRNAlaterRNAStabilizationReagent-20°<:凍存備用，鼻咽部活檢組織標本離體后，立刻以生理鹽水沖洗血跡，lOmin內浸入到RNAlaterRNAStabilizationReagent中，-20。C凍存。②組織標本的顯微切割與純化過程普通載玻片和染色盒經自來水清洗，雙蒸水沖洗后放入0.1%DEPC水中浸泡8小時，隨后18(TC干烤3小時，置-2(TC凍存備用。將LeicaCM1800冰凍切片機預冷至-2(TC，RNAlaterRNAStabilizationReagent-20'C凍存組織標本及RNA酶滅活載玻片以冰盒轉至冰凍切片機箱。組織塊上柱，調整切片刀，將切片控制在1518^im之間，直接貼敷在預制的載玻片上。根據組織切片的大小，每載玻片可以粘貼4~8切片不等。將粘貼好組織切片的載玻片放在位于冰凍切片機箱的預制染色缸中，冰盒轉移至實驗臺，進入下一步組織切片固定、染色試驗階段。無水乙醇中加入DEPC水配制梯度酒精，濃度分別70%、95%和100%。冰盒中取出切片，切片染色順序如下70%酒精5min—95%酒精2min—無水酒精2min—蘇木素染色5min—DEPC水洗3min—70%酒精5min—0.5%伊紅酒精溶液染色30s—70%酒精2min—95%酒精2min—無水酒精保存。改良ONO-121ErgonomicJoystickMicromanipulator系統，無菌注射針頭作為顯微切割刀具，借助移動架協助固定，倒置正像顯微鏡下首先分辨出癌巢或粘膜柱狀上皮區，鏡下移動針頭，將目標組織塊切下，置于無水乙醇中立即轉入RNA提取。(2)腫瘤組織標本的RNA提取純化按照AbsolutelyRNAMicroprepKit說明操作，操作步驟如下顯微切割后純凈的組織細胞中，加入0.7P1的0-ME加入到100P1的LysisBuffer,100ul70。/。乙醇，搖勻。加入RNA離心管中，10，000Xg離心3060sec，棄去離心管中液體，加入600u1Low-SaltWashBuffer,lO，OOOXg30~60sec，棄去離心管中液體，離心2min;加入5"1DNaseI，37°C孵育15min;加入500y1High-SaltWashBuffer,10,000Xg離心30-60sec,棄去管中液體；加入600u1Low-SaltWashBuffer,10,000Xg離心30-60see,棄去管中液體；加入300u1Low-SaltWashBuffer,10,000Xg離心2min;取出離心管芯，放入1.5ml新收集管，力Q30u1ElutionBuffer,室溫孵育2min;10,000Xg離心lmin，RNA即收集于管中。(3)線性擴增RNA，構建基因表達譜①RNA線性擴增，獲得aRNA具體步驟如下RNA與T7Oligo(dT)Primer混合，加水至12ul，70°C10min，加入8ulReverseTranscriptionMasterMix，42。C孵育2h;加入cDNA第二鏈合成混合試劑，16。C孵育2h;加入250WcDNABindingBuffer,10W去核酸酶水洗提cDNA二次，加水使cDNA溶液總量達16W;室溫配制體外轉錄混合液至總容量40W，37。C孵育14h，加入2WDNaseI，37。C孵育30min，加入60WaRNA洗提溶液使總量達100W;250W乙醇中加入50W預熱50XaRNA洗提液10,000Xg離心，先后洗提二次，收集aRNA，取少量電泳、紫外分光光度計檢測，余-8(TC凍存。②二輪線性擴增，探針標記，探針與芯片雜交，經掃描后輸出數據具體步驟為(l)aRNA逆轉錄；(2)二輪體外線性擴增合成生物素標記cRNA探針；(3)基因探針片段化；(4)探針與上海博芯H80s芯片雜交，經掃描后GCOS扣除本底信號，計算并輸出芯片中全部基因表達數據。本實施例選用了上海博芯H80s芯片，該芯片8464點包含7945個人類已知基因，在同一玻璃片基上構建了上述顯微切割，線性擴增的34例樣本(1個重復樣本)的全基因組表達譜。(4)對數據進行統計學分析，利用weightedvotingclasspredictionmodel篩選鼻咽癌分子標志物。將34例樣本的全基因組表達譜數據，即每例樣本的7945個基因的表達值匯總成一個數據表，輸入GeneCluster軟件(2.0版，下載網址http:〃www.broad.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html)。禾U用該軟件提供的權重賦值(weightedvoting)算法，采用逐個剔除交叉驗證('leave-one-out，crossvalidation)的方法，篩選可以用于鼻咽癌和正常鼻咽上皮分類預測的分子標記。首先篩選出250個在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中表達差異最大的基因，然后用這250個基因的基因表達數據對34例樣本進行分類預測，再和34例樣本的實際分類情況(鼻咽癌或者正常鼻咽上皮)進行比較，判斷正確率和統計學P值，隨后在這250個基因中，逐個剔除鼻咽癌和正常上皮中表達差異最小的基因，每剔除一個，進行一次分類預測判斷，直至最后只剩1個基因。通過以上預測分析結果，發現利用6個基因預測得到的準確性最高，統計學P值最小，這6個基因是鼻咽癌上調基因RB1，STMN1，DSP和下調基因SERPINB6，AGTRL1，SYTL2(參見表1)。表1weightedvoting分類予細的6個基因基因基因信息GeneBankIDUp-regualatedinNPCRBIRetinoblastoma1(includingosteosarcoma)畫—000321ST畫1Stathmin1/oncoprotein18NM—005563DSPDesmoplakinNM—004415Down-regulatedinNPCSerine(orcysteine)proteinaseinhibitor,cladeBSERPINB6(ovalbumin),member6NM—004568AGTRL1AngiotensinIIreceptor-like1畫—005161SYTL2Synaptotagmin-like2NM—032943在這6個鼻咽癌候選的分子標志物中，RB1，STMN1和DSP1在鼻咽癌中表達上調，SERPINB6，AGTRL1和SYTL2在鼻咽癌中表達下調。實施例2:對本發明篩選到的鼻咽癌候選分子標志物加以驗證制作含448X2個點陣的鼻咽癌組織微陣列組織微陣列芯片，組織芯片的樣本數及組織點數見表2。用芯片，利用免疫組化方法檢測RBI蛋白的表達，用原位雜交方法檢測SERPINB6、AGTRL1的mRNA的表達。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>總計410(896)具體利用免疫組化檢測RBI基因在組織微陣列中的蛋白表達的具體過程為組織微陣列切片經實驗前處理后，脫蠟、水化。PBS先，5minX3。組織微陣歹iJ(TMAs)切片入3y。H202中，阻斷內源性過氧化物酶，室溫30min。PBS洗，5minX3。抗原修復根據所檢測蛋白的部位和抗體說明書推薦修復方法，使用微波或酶消化抗原修復。微波抗原修復時，TMAs切片置于0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，緩沖液沸騰后，調節至低火檔，修復切片20min。酶消化抗原修復時，滴加0.1%胰蛋白酶液于切片，37"C下消化25min。PBS洗，5minX3。滴加300j^1/TMAs片的正常山羊或兔血清封閉，室溫30min，甩去多余液體。滴加即用型或濃縮一抗(按抗體說明書按1:50或1:100、1:200不等的比例稀釋)300^d/TMAs，保持切片在密封的濕盒中，4T:冰箱內孵育過夜。PBS洗，5minX3。滴加即用型二抗，300|xl/TMAs片，室溫(25""C以上)lh。PBS洗，5minX3。DAB顯色520min，顯微鏡下控制染色程度。入雙蒸水中止反應，雙蒸水沖洗10min。蘇木素染復染2min，溫水分化。雙蒸水沖洗1015min。脫水、透明、TMAs切片膠帶轉移切片系統專用封片膠封片，膠帶轉移切片系統配制的紫外線燈下交聯lmin。原位雜交檢測SERPINB6、AGTRL1基因在組織微陣列中的mRNA表達的具體過程為(1)組織微陣列切片雜交前處理4'C保存的組織微陣列切片置于58'C烤片30min,熔化表面石蠟。二甲苯依次脫蠟3X5min。梯級酒精洗滌，100%酒精2X2min—95%酒精lX5min—70%酒精1X5min—50%酒精1X5min—DEPC水洗滌2X3min—DEPC-PBS洗滌2X5min。滴加300|J胃蛋白酶K(10ng/ml)于切片上，37。C消化20min。切片入PBS(0.1MPBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌lmin，中止反應。切片入0.2NHCL，于37'C反應20-30min,增加組織的通透性。切片用4。/。多聚甲醛(0.1MPBS溶解)后固定10min，室溫。為了增加組織陽性雜交強度，對切片進行乙酰處理。切片入0.25%乙酸酐BufferI(O.IM三乙醇胺)，室溫10min。1MPBS洗滌2X5min。(2)預雜交-20°(:保存的預雜交液，先置于37'C孵育60min，預雜交液的用量為2cmx2cm切片面積50^1，本實驗組織微陣列切片組織面規格為6.5cmx2.8cm和6.2cmx2.8cm大小，每一切片預雜交液的用量均用250(_d，相應大小的石蠟膜履蓋切片，37'C濕盒中預雜交2小時。(預雜交液成份包括2XSSC，10%Dextransulphate，IXDenhardt，ssolution,50mMPhosphateBuffer(PH7.0)，50mMDTT，250^1，100(xg/mlpolyA，5jxg/mlpolydA，250|xg/mlyeastt-RNA，500pg/mlssDNA，47%Deionizedformamide)。移去石蠟膜，甩掉預雜交液，切片置于2XSSC中5min。(3)雜交反應37'C雜交過夜(18-20h)。每一切片加入250pl雜交液并用石蠟膜履蓋。預雜交液中加入相應的探針就成為雜交液。雜交液在預雜交時配制，放置37'C孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實驗用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標記試劑盒標記探針濃度計算依據每一探針的濃度按其與陽性定量探針時檢測反應時顯色進行比對和lOOpmol30個堿基的裸探針標記反應理論探針產量為900ng兩種標準進行綜合計算出標記探針的濃度。雜交后洗滌，切片浸入2XSSC，10min，揭去石蠟膜。依次于搖床上搖動洗滌，2XSSC(0.5%SDS)，2X15min—0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。(4)雜交后顯色檢測反應采用Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與mRNA結合復合物；TSA放大系統增強原位雜交反應顯色反應的陽性信號，DAB顯色。切片轉至TNT緩沖液中，3X5min。滴加TNB阻斷緩沖液，300nl/TMAs，室溫，30min。不洗，吸去多余阻斷劑，1:100稀釋的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1%TritonX-100+l%阻斷劑)，室溫4小時。TNTBuffer(0.1MTris-CL，PH7.5，0.15MNaCL，0.05%Tween20)洗滌，3x5min。切片上滴加信號放大試劑BiotinylTyamid，300(xl/TMAs，(BiotinylTyramid忙存液BiotinylTyramid溶解于0.2mlDMSO，BiotinylTyramid工作液IX稀釋液，1:50稀釋BiotinylTyramid貯存液)，室溫10分鐘。TNT洗，3X5min。切片滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶)，300^1/TMAs,室溫30min。TNT洗，3X5min。蒸溜水洗滌，lXlmin。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應。蘇木素復染，酒精梯級脫水，切片干燥。滴加組織微陣列切片專用封片膠，相應規格的蓋玻片蓋片，切片膠帶轉移系統配備的紫外燈下交聯切片lmin。結果顯示，RB1蛋白在鼻咽癌組織中表達上調，SERPINB6、AGTRL1的在鼻咽癌組織中mRNA的表達下調(參見表3)，這與用本發明的方法所篩選的RB1為上調基因，SERPINB6、AGTRL1為下調基因的結果相符。表3RB1蛋白、AGTRL1、SERPINB6基因mRNA的表達與鼻咽癌病理形態的關系RB1(陽性率)AGTRL1(陽性率)SERPINB6(陽性率)正常鼻咽上皮57扁(53.80/0)61/81(75.310/0)54/71(76.06%)不典型增生鼻咽上皮56/79(70.9%)39/54(72.22%)30/44(68.18%)鼻咽癌354/396(89.4%)173/343(50.44%)186/337(55.19%)權利要求1.一種篩選腫瘤遺傳分子標記物的方法，其特征在于包含以下步驟(1)對腫瘤組織標本和非腫瘤組織標本進行顯微切割；(2)純化組織標本，提取純化組織標本中的RNA；(3)體外轉錄、線性擴增合成aRNA，aRNA再經逆轉錄、二輪體外線性擴增制備生物素標記cRNA探針；(4)探針經片段化后與人類全基因組表達譜芯片雜交，信號掃描，輸出數據，構建腫瘤純化組織的基因表達譜；(5)運用權重賦值算法，逐個剔除交叉驗證，對數據歸一化處理，篩選與腫瘤發生、發展過程相關的分子標記物。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于所述腫瘤為鼻咽癌。全文摘要本發明公開了一種篩選腫瘤遺傳分子標記物的方法顯微切割腫瘤組織標本；純化提取RNA，體外轉錄、線性擴增合成aRNA；逆轉錄、二輪體外擴增制備生物素標記cRNA探針；探針與人類全基因組表達譜芯片雜交，信號掃描，輸出數據，構建腫瘤純化組織的基因表達譜；運用權重賦值算法，使用逐個剔除交叉驗證對數據歸一化處理，分析篩選與腫瘤相關的分子標記物。本發明結合使用高通量基因芯片、結合顯微切割、線性擴增技術，構建不同病理類型、不同臨床分期的腫瘤組織中腫瘤基因表達譜，為篩選不同用途的腫瘤分子標記物和潛在的腫瘤藥物作用靶點提供了新的方法。文檔編號C12Q1/68GK101245385SQ20081003091公開日2008年8月20日申請日期2008年3月26日優先權日2008年3月26日發明者周艷宏,張文玲,曾朝陽,李小玲,李桂源,煒熊,羅曉敏,范松青申請人:中南大學