專利名稱：一種結腸特異表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種結腸特異表達質粒及其構建方法和應用。
背景技術：
DNA重組(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA 分子水平進行操作的技術。重組技術是基因工程的核心，指在體外條件下，將不同生物的基因進行人工“剪切” “組合”和“拼接”，使遺傳物質重新構建，然后通過載體如細菌質粒、噬菌體和病毒等轉入受體細胞內進行無性繁殖，并使所需要的基因在受體細胞內表達，產生人類所需要的基因或產物，或創建新的生物類型。DNA重組技術涉及核酸分子雜交技術、限制性核酸內切酶等工具酶的應用、基因轉移等多項技術應用。從1972年，美國科學家保羅·伯格首次成功地重組了世界上第一批DNA分子以來，一系列轉基因家畜、轉基因植物以及家喻戶曉的克隆羊相繼問世，隨后1999年又出生了超級鼠，2000年完成了人類基因組計劃。國內由暨南大學暨東生物工程研究所用質粒 PJU1005在E.coli中成功表達。主要作用是促進血管新生，促進軟組織、軟骨組織、骨組織的損傷修復，并具神經營養作用等等。啟動子(Promoter)位于結構基因5'端上游區，能指導RNA聚合酶全酶與模版的正確結合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特異性轉錄的形式，決定轉錄的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶類型，是轉錄調控的中心。在動物和植物基因工程研究中，為使外源基因在受體中高效表達，必須借助于高活性的啟動子。有時為避免基因產物對受體及環境產生副作用，有時是為了獲得特定的性狀，需使外源基因只在特定的組織或器官中表達。而到現在為止對于特異表達載體的研究的例子也是非常多。在國內，李為民等從金華中棉中克隆了光誘導基因Gacab的啟動子(1009 bp )， 轉化煙草證明Gacab全長啟動子能夠驅動gus基因在轉基因煙草葉片中的特異表達。黃海群等利用PCR法克隆了水稻日本晴的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亞基基因(rbcS ) 5’ 上游調控區，命名為Posrbcs。將Posrbcs與gus基因融合，并通過農桿菌介導轉入水稻中花11 (Oryzasativa ssp. japon ica)中。對轉基因水稻植株中gus活性進行定性與定量分析，結果表明，Posrbcs啟動子可驅動gus基因在轉基因水稻植株的葉片、葉、鞘莖桿及穎殼中特異性表達。肖守華等證明PNZIP啟動子能驅動小麥抗真菌Y-硫堇蛋白(γ-Thionin) 基因在甜瓜葉片組織中表達。在國外，Calgene的有關組織特異性啟動子的專利，控制基因在成熟的水果子房組織中，如草莓，蘋果和梨的子房組織表達。文獻“結腸特異性基因RELMii的克隆及其真核表達載體構建”(鄭麗端，童強松， 呂清，楊秀萍，董繼華，世界華人消化雜志，2007年7月28日，15(21):2284-2觀9)報道，從小鼠結腸組織中提取總RNA，采用RT-PCR方法擴增RELMii全長cDNA，克隆至T載體后進行核酸序列分析，并將其正向插入到真核表達載體pcDNA3. l/Zeo(+)的限制性內切酶位點Eco^ I ；重組子在陽離子脂質體LipofectamindOOO的介導下瞬時轉染小鼠胚胎纖維母細胞WH/3T3、結腸癌細胞系CD6。結果表明RELMii mRNA和蛋白特異表達于小鼠結腸，而其他臟器未見表達。真核表達載體pcDNA3. I-RELM^轉染細胞后，細胞內RELM^ mRNA和蛋白水平均顯著增高。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術中的不足，提供一種結腸特異表達載體。本發明的另一目的是提供上述表達載體的制備方法。本發明的又一目的是提供上述結腸特異表達載體的應用。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種結腸特異表達載體，是用P-relmi3的核苷酸序列替換真核表達載體pVAXl的啟動子PCMV構建而成，所述P-relmi3的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本發明中所述 Ρ-Γθ πιβ啟動子即為P-relmi3的核苷酸序列。上述結腸特異表達載體，具體為pVAXl質粒除去從酶切位點ΙΛ/Ι和之間的序列，總共718bp，將在ΙΛ/Ι和之間的718bp序列片段替換成了 P-relmi3序列(SEQ ID N0:l，982bp)。本發明根據已知relink基因的mRNA序列(GenBank登錄號NM_023881)，將其在 NCBI中與小鼠全基因序列進行比對找出它的5’端啟動子序列，命名為5’-relmi3 (SEQ ID N0:6)，在5’-relmi3的基礎上擴增的P-relmi3序列片段作為啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1。上述結腸特異表達載體的構建方法，步驟如下以小鼠全基因組為模板，以SEQ ID NO: 2^3為上下游引物，擴增Ρ-Γθ πιβ，用ΙΛ/Ι和對真核表達載體pVAXl和P_relm3 分別進行雙酶切，酶切后的產物再進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆， 經過酶切鑒定和測序鑒定都正確的載體即為所述結腸特異表達載體。一種熒光標記的結腸特異表達載體，是以P-relmi3啟動子替換PCMV啟動子的 PVAXl質粒為出發載體，將綠色熒光蛋白基因Efgp插入到該出發載體中構建而成，即將 Efgp基因插入P-relmi3啟動子下游構建而成。上述熒光標記的結腸特異表達載體，具體為pVAXl質粒除去從酶切位點ΙΛ/Ι 和之間的序列，總共718bp，將在ΙΛ/Ι和之間的718bp序列片段替換成了 Ρ-Γθ πιβ序列(SEQ ID N0:l，982bp)。在這個質粒接下來的多克隆位點區插入了 Egfp基因(752bp)，最后得到3988bp的載體序列，即ρ⑶T-GFP。接入的方式不會引起序列倒置，是
合理有效的。上述帶有熒光標記的結腸特異表達載體的啟動子由982個堿基對組成，對結腸特異性表達的調控作用明顯，同時該質粒還具有Egfp (Green Fluorescent Protein)核苷酸序列(由797bp個堿基對組成)，在其下游插入目的基因可以通過熒光檢測目的基因的構建是否成功，使檢測方法變得容易。Egfp基因編碼的蛋白為綠色熒光蛋白(GFP)，由238個氨基酸組成，分子量約27KD。GFP在包括熱、極端pH和化學變性劑等苛刻條件下都很穩定，用甲醛固定后在熒光顯微鏡下，用波長約490 nm的紫外線激發后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測；無需任何的作用底物或共作用物，檢測的靈敏度不受反應效率的影響，保證了極高的檢出率；蛋白本身性質穩定；可在多種異源生物中表達且無細胞毒性；其基因片段長度較小，易于構建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性，為研究其他基因表達產物的分布提供了方便。因此常作為一種報告基因被應用于各種研究領域。本發明所述結腸特異表達載體在制備基因藥物中的應用。本發明提供的腸道特異表達載體具有重要的應用價值。應用之一是在生產環境友好型腸道特異分解臭氣的轉基因豬方面，隨著畜牧業的迅猛發展，養豬場的數量急劇增加， 造成的污染問題日益突出，在養豬場，臭氣不僅危害工作人員的健康，造成空氣污染，而且也會使影響豬的健康生長，造成效益降低。應用腸道特異表達載體能特異的啟動分解臭氣的目的基因僅在腸道表達，不影響豬的正常功能的同時，減少空氣污染。改善豬場的工作環境以及豬的生活環境，環境友好的同時增加收益。本發明提供的表達方法的第二個應用，是用于腸道疾病靶向治療藥物。無論是人類還是動物，患有腸道疾病的概率都是非常高的，應用腸道特異表達載體，給研究腸道疾病靶向治療藥物以及腸道疾病的診斷提供了基礎。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
現有技術中已知relmii基因在結腸特異表達，本發明與現有技術的區別在于用的出發載體質粒不同。PVAXl載體是在載體pcDNA3. 1的基礎上改建而成的一種新型真核表達載體，大小為3.0 1Λ。該質粒用卡那霉素抗性篩選基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性篩選基因，最大程度的減少抗性篩選基因和人類基因組發生重組的可能性。PVAXl含有多個克隆酶切位點，允許同時克隆多個大片段的目的基因，強啟動子PCMV和BGH poly A信號可以在哺乳動物細胞中高水平表達重組蛋白。本研究選擇的大小為IOOObp左右的P-relmβ 啟動子作為結腸特異表達啟動子，能夠使目的基因在腸道特異表達，載體制備方法簡單實用，應用于轉基因藥物的制備。


圖1. ρ⑶T-GFP質粒的結構示意圖； 圖2. pVAXl質粒的結構示意圖3. Ρ-Γθ πιβ啟動子per電泳圖，其中1、2、3均為P-relm3，M為marker ； 圖4.實施例1 Ρ-ΓΘ πιβ啟動子酶切回收產物電泳圖，M為marker，1為P_relm3酶切回收產物；
圖5. P-relm^連接pVAXl載體后的菌液鑒定圖6.實施例2中Egfp基因PCR電泳圖，其中M為marker，1、2、3均為Egfp基因； 圖7.實施例2中ρ⑶T質粒酶切鑒定圖，M為marker，1、2均為酶切產物； 圖8. pVAXI-GFP組和pCDT-GFP組在SW480細胞上的表達結果，圖中綠色熒光顯示有表達；
圖9. pVAXI-GFP組和pCDT-GFP組在Vero細胞上的表達結果，圖中綠色熒光顯示有表
達；
圖10.為空白組(未轉染任何質粒)和脂質體組(空白脂質體轉染細胞)在sw480細胞上的表達；
圖11.為空白組(未轉染任何質粒)和脂質體組(空白脂質體轉染細胞)在vero細胞上的表達；
圖12.實施例4小鼠肝臟冰凍切片熒光檢測結果，顯示沒有熒光，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是肝臟形態圖13.實施例4小鼠肌肉冰凍切片熒光檢測結果，顯示沒有熒光，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是肌肉形態圖14.實施例4小鼠結腸冰凍切片熒光檢測結果，實驗組有綠色熒光顯示，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是結腸形態圖，實驗組1、2、3分別為同一切片的不同視野； 圖15.實施例4小鼠脾冰凍切片熒光檢測結果，顯示沒有熒光，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是脾形態圖16.實施例4小鼠腎冰凍切片熒光檢測結果，顯示沒有熒光，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是腎形態圖17.實施例4小鼠小腸冰凍切片熒光檢測結果，顯示沒有熒光，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是小腸形態圖18.實施例4小鼠心冰凍切片熒光檢測結果，顯示沒有熒光，a是疊加圖，b是熒光蛋白表達檢測圖，c是心形態圖。
具體實施例方式以下實施例中除有特殊說明外，均為本領域常規實驗試劑、方法和步驟。實施例1重組質粒ρ⑶的構建 1. Ρ-Γθ πιβ 的 PCR 擴增
根據已知relink基因的mRNA序列(GenBank登錄號ΝΜ_023881)，將其在NCBI中與小鼠全基因序列進行比對找出它的5’端序列，通過預測啟動子的網站預測的啟動位置，分別設計引物，引入酶切位點i/Ζ Ι和feoRI，設計針對mRNA序列872_891bp的上游引物F 5 ，-TCTACGCGTTCCACCCCATAATCAGCA-3'，SEQ ID NO:2，針對 1836_1854bp 的下游引物 R :5，-GACTCGAG TTATCTAGATCCG-3，，SEQ ID NO:3 (其中劃線部分為酶切位點)。以小鼠總DNA為模板，上述F和R為引物，擴增relmii基因的啟動子P-relmii序列片段。PCR反應體系組成如下模板 μ ，10 Xbuffer ΙΟμ , dNTPs 8 μ ，引物F 1 μ ，引物 R μ , Bland Taq 1 μ , ddH20 補至 ΙΟΟμ 。PCR 反應程序94°C預變性 3min，1 個循環； 94°C 40s, 58°C 40s, 72°C lmin，35 個循環；72°C后延伸 lOmin。PCR產物在1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測時可觀察到IOOObp左右的特異性條帶，見圖3。2.重組質粒pCD的構建
將P-relmi3序列的PCR產物用內切酶i/Ζ Ι和進行酶切消化，同時將pVAXl質粒(invitrogen公司)同樣用內切酶i/Ζ Ι和進行酶切消化，37°C作用池，兩個反應的反應體系如下10 X buffer M 10μ L,#7wl EcoRl 5 μ L，PCR 產物(或 pVAXl 質粒) 30^50 μ L，ddH20補至100 μ L，同時用CIAP (堿性磷酸酶)去磷酸化。在Τ4連接酶的作用下連接消化的P-relmi3序列的PCR產物和酶切處理的pVAXl質粒，4°C連接過夜，反應體系如下10 X連接buffer 1 μ L，PCR酶切回收產物5 7 μ L，pVAXl質?；厥债a物1 μ L，T4 DNA 連接酶1 μ L，ddH20補至10 UL0將連接產物轉化DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆，將陽性克隆用3ml左右的LA培養基在37°C繼續培養，然后抽取質粒。用酶切的方法進行酶切鑒定。送鑒定為陽性的重組質粒到奧科生物技術公司進行序列測定。測序正確的重組質粒即為新構建的PCD質粒(含有ZAo I酶切位點)。實施例2含有熒光報告基因的重組質粒構建 1. Egfp綠色熒光蛋白基因的擴增
根據Egfp-C3載體(invitrogen公司)中的Egfp基因設計引物，引入兩個酶切位點 &ORI 和損ol，上游引物 F (5’-GAGAATTCCCACCATGGTGAGCA-3’, SEQ ID NO: 4 )和下游引物 R (5’-GACTCGAGTTATCTAGATCCG-3’, SEQ ID NO: 5)，擴增 Egfp 基因片段。PCR 反應體系的組成如下模板 μ ，IOXbuffer 10 μ , dNTPs 8 μ , F 1 μ , R μ , Bland Taq 1 μ , ddH20 補至 100ML。PCR 反應程序94°C預變性 3min，l 個循環；94°C 40s, 60°C 40s, 72°C lmin,35 個循環；72°C后延伸lOmin。PCR產物在1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測時可觀察到SOObp左右的特異性條帶，見圖6。2.構建含Egfp報告基因的載體ρ⑶T-GFP
為了使Egfp綠色熒光報告基因置于腸道特異表達基因的表達調控元件的控制之下。 將Egfp基因的PCR產物用內切酶I和損ο I進行酶切消化，同時將ρ⑶質粒(實施例 1制備)用內切酶I和損ol進行酶切消化，37°C作用3h，反應體系如下10Xbuffer MlO μ Ι,Ι ο I 5 μ L,BcoR I 5 μ L，PCR 產物(或 pCD 質粒)30 50 μ L，ddH20 補至 100 μ L。同時用CIAP去磷酸化。在T4連接酶的作用下，4°C連接過夜，反應體系如下10X連接buffer 1口1^，？0 酶切回收產物5 741^，？^質?；厥债a物141^，114 DNA連接酶1 yL，dd H2O補至 10 μ L0將連接產物轉化Ε. coli DH5 α感受態細胞，最后取菌液涂布含有100 μ g/mL kana 的LB瓊脂培養基上，37°C培養12 16h。平板上挑取5個單菌落接種3 mL含50 μ g/mL kana 的LB培養液中，37 °C振搖培養1池后，取菌液用實施例1中的引物F/R進行PCR檢測，同時設立空白對照(反應體系中的模板為1 μ L的ddH20作為空白對照組)和陽性對照(反應體系中的takara公司提供的control DNA為模板，以及相應的引物作為陽性對照組)，反應體系如下10 X PCR buffer 2yL，菌液 1 μ L, dNTPs 2μ L (2. 5mM)，引物 F 0. 5 μ L (20 μ Μ)，弓丨 tl R ο. 5 μ L (20 μ Μ)，Taq 0. 1 μ L (5U/μ L)，ddH20 補至 20 μ L。按常規方法擴增 Egfp 基因，反應條件為94°C預變性3min ；94°C變性40s，60°C退火40s, 72°C延伸Imin。循環35次， 最后72°C延伸IOmin0 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠(含0.5 μ g/mL溴化乙錠，EB)電泳檢測， 在100V的電壓下進行電泳，20min后在紫外燈下觀察結果。挑取陽性克隆，將陽性克隆用 3ml左右的Kana培養基在37°C 220rpm過夜振蕩培養，次日用Ε. Z. N. A. Plasmid Minipi^ps Kit提取質粒，按試劑盒說明書進行操作抽取質粒。用酶切的方法進行酶切鑒定(鑒定結果見圖7)。送鑒定為陽性的重組質粒到奧科生物技術公司進行序列測定。測序正確的重組質粒即為新構建的結腸特異表達基因啟動子與Egfp報告基因的載體，命名為pCDT-GFP質粒。實施例3將結腸特異表達載體pCDT用脂質體介導感染細胞
將已構建好的載體用Lipofectamine2000轉染SW480細胞(人結腸癌細胞)以及Vero細胞，設置陽性對照組(PVAX1-GFP組，為pVAXl質粒與綠色熒光蛋白基因構建的質粒)、空白組(未轉染任何質粒)、脂質體組(空白脂質體轉染細胞)以及實驗組(P⑶T-GFP轉染細胞)， 轉染結果見圖8 11，從圖中結果可以看出，pVAXl-GFP組和pCDT-GFP在SW480細胞上均有表達，，pVAXl-GFP組在Vero細胞中有表達，但是pCDT-GFP組在Vero細胞沒有表達?？瞻捉M和脂質體組在兩種細胞均未表達。表明P⑶T-GFP重組載體能夠啟動蛋白表達，且能在腸道細胞表達，在非腸源細胞，如Vero細胞中不表達。實施例4將結腸特異表達載體ρ⑶T肌肉注射小鼠體內的表達
將實施例2制備的pCDT-GFP質粒以及pVAXl質粒的菌液分別在kana培養板上劃線培養，在37°C培養箱中過夜，次日挑取單菌落，用3ml左右的kana培養基在37°C 220rpm過夜振蕩培養。之后用裝有400ml kana培養基的三角瓶在37°C培養箱中過夜擴大培養。次日用天根生物有限公司的大提質粒試劑盒大量提取質粒。檢測質粒的濃度，放_20°C保存。將從暨大試驗動物中心買來的4周的昆明小白鼠分為兩組，用同一批飼料進行飼養。組別分別是空白組(磷酸緩沖液PBS)和pCDT實驗組(脂質體與pCDT質粒的混合液，按體積比2:1混合)。連續注射三天。之后隔三天，在此期間的第三天不予提供飼料，讓小鼠空腹一天，到注射后的第四天，殺小鼠，分別取心臟，肝臟，腎臟，脾臟，肌肉，結腸，小腸。裝于2ml的離心管中，置于液氮中速凍，15 20分鐘之后，用黑色薄膜袋放入-80度保存。第二天送萊德爾公司做冰凍切片免疫熒光。具體方法是將組織做成冰凍切片，之后將冰凍切片丙酮固定10分鐘，接著用PBS洗2次，每次5分鐘，5分鐘后用抗熒光淬滅劑封片。最后顯微鏡檢測熒光并拍照。結果顯示只有結腸組織有明顯的熒光表達(見圖14實驗組1、2、 3)，而其他組織如肝臟、肌肉、小腸、腎、脾、心臟組織均無熒光表達。見圖12、13、15、16、17、 18。
權利要求
1.一種結腸特異表達載體，其特征在于是用P-relmβ核苷酸序列替換真核表達載體 PVAXl的啟動子PCMV構建而成，所述Ρ-Γθ1πιβ的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.權利要求1所述結腸特異表達載體的構建方法，其特征在于步驟如下以小鼠全基因組為模板，以SEQ ID NO:2^3為上下游引物，擴增P-relmi3序列，用ΙΛ/Ι和對真核表達載體PVAXl和P-relmi3序列分別進行雙酶切，酶切后的產物再進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆，經過酶切鑒定和測序鑒定都正確的載體即為所述結腸特異表達載體。
3.一種熒光標記的結腸特異表達載體，其特征在于是將綠色熒光蛋白基因Efgp插入到權利要求1所述P_relmi3核苷酸序列的下游構建而成。
4.根據權利要求4所述熒光標記的結腸特異表達載體，其特征在于所述綠色熒光蛋白基因Efgp的擴增用引物如SEQ ID NO:4 5所示。
5.權利要求1所述結腸特異表達載體在制備轉基因藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述轉基因藥物為腸道疾病靶向治療藥物。
全文摘要
本發明公開了一種結腸特異表達載體及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發明的結腸特異表達載體，是用Relmβ基因啟動子(命名為P-relmβ)的核苷酸序列替換真核表達載體pVAX1的啟動子PCMV，構建而成的。該表達載體的制備方法是擴增大小約1000bp的P-relmβ序列，用MluI和EcoRI對真核表達載體pVAX1和P-relmβ分別進行雙酶切，酶切后的產物再進行連接構建而成。本發明的結腸特異表達載體表達效率高，且制備方法簡單，可以廣泛應用于轉基因藥物的制備。
文檔編號C12N15/66GK102321654SQ201110254009
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者孫寶麗, 畢英佐, 王靜, 謝青梅, 馬靜云 申請人:華南農業大學