專利名稱：Dna分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼的方法，屬于生物技術(shù)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch-Ham. ex D. Don為貴州苗族人民的習(xí)用藥材，對(duì)于治療泌尿系統(tǒng)疾病具有顯著療效；是著名苗藥“熱淋清顆粒”的唯一原料藥材。頭花蓼是一種藥用價(jià)值很高的中草藥，也是貴州具有代表性的苗藥。對(duì)頭花蓼及其近緣種的藥用情況進(jìn)行調(diào)查結(jié)果表明，目前頭花蓼及其同組植物火炭母、赤脛散、德氏蓼、尼泊爾蓼在貴州運(yùn)用廣泛，并且都用于風(fēng)濕痹痛等疾病的治療，民間多將同科同屬植物，如火炭母 P. chinense L. var. chinense、赤胚散 P. runcinatum Buch. -Ham. ex D.Don var. sinense Hemsl.、尼泊爾藝P. η印alense Meisn、德氏藝P. dielsii Leil植物混作頭花蓼使用，特別是尼泊爾蓼與頭花蓼原植物形態(tài)相似，多誤認(rèn)作頭花蓼用，但實(shí)際上二者在臨床使用上是有區(qū)別的，頭花蓼偏重于利尿通淋，尼泊爾蓼則偏重于治療風(fēng)濕痹痛之癥。但作為干燥藥材收購時(shí)，彼此之間的植物形態(tài)因皺縮而不易分辨和鑒別，從而易造成藥材的混淆使用。對(duì)于頭花蓼的檢測(cè)，傳統(tǒng)的鑒定方法主要依靠形態(tài)學(xué)鑒定，缺點(diǎn)是主觀性強(qiáng)。近年來，以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)在中藥材真?zhèn)舞b別中發(fā)揮了重要的輔助鑒定作用。RAPD操作技術(shù)簡(jiǎn)便，工作效率高，DNA樣品需要量少，不受環(huán)境、發(fā)育、數(shù)量性狀等影響，是一種理想和有效的分子生物學(xué)技術(shù)，在中藥材種屬分類、親緣鑒別、種質(zhì)資源的道地性研究等方面廣泛應(yīng)用。但RAPD標(biāo)記有反應(yīng)溫度低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性、穩(wěn)定性較低，使研究結(jié)果無法作為有效的標(biāo)記保存下來。而若在RAPD研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立SCAR標(biāo)記， 就能有效地克服RAPD重復(fù)性不好的缺點(diǎn)。SCAR (Sequence characterized amplified regions) ^^^ Ψ^Μ^ Τ^Β 記，是一種基于PCR技術(shù)的單基因位點(diǎn)多態(tài)性遺傳標(biāo)記，其原理是在序列未知的DNA標(biāo)記 (RAPD，AFLP等)基礎(chǔ)上，通過對(duì)RAPD片段中某一目的基因的克隆和測(cè)序，設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)于該RAPD片段的序列引物，再去擴(kuò)增原來的模板DNA，可得到產(chǎn)生單位點(diǎn)的SCAR DNA標(biāo)記。與RAPD技術(shù)相比，SCAR技術(shù)用一對(duì)互補(bǔ)到專一基因組位點(diǎn)的長(zhǎng)引物和嚴(yán)格的PCR 條件，退火溫度高，選用較長(zhǎng)的寡核苷酸引物，因此可靠性高，重復(fù)性好，對(duì)反應(yīng)條件不敏感，同時(shí)揭示的信息多，有利于構(gòu)建高密度的遺傳圖譜，能為物種的鑒別提供高效、快速、準(zhǔn)確的方法。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，杜明鳳、陳慶富于2009年發(fā)表了 “貴州和四川頭花蓼居群的RAPD多態(tài)性研究”(武漢植物學(xué)研究2009，27(1) 8 11)，但上述文獻(xiàn)是針對(duì)不同產(chǎn)地的頭花蓼作遺傳多樣性分析，目的是分析來源于不同地區(qū)的同一物種之間的遺傳差異，立足點(diǎn)在頭花蓼這一個(gè)植物種內(nèi)，并沒有針對(duì)頭花蓼與其近緣種尼泊爾蓼進(jìn)行SCAR標(biāo)記的鑒別研究?jī)?nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種利用DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼藥材的方法。從而克服現(xiàn)有技術(shù)中，頭花蓼與尼泊爾蓼的藥材干品不易分辨和鑒別，預(yù)防及避免“熱淋清顆粒”的原料藥材混淆使用的問題。為保證“熱淋清顆粒”的原料供應(yīng)、解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼的引物，所述引物序列如下5’ -GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3‘5，-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，。一種利用DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼的方法，操作步驟如下1)合成特異性鑒別引物按序列5，-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3，，5，-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，合成一對(duì)特異性鑒別引物；2)以改良CTAB法分別提取頭花蓼DNA基因、尼泊爾蓼DNA基因；3)以步驟2)所得的頭花蓼DNA基因和尼泊爾蓼DNA基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果。步驟2)中，所述以改良CTAB法分別提取頭花蓼DNA基因、尼泊爾蓼DNA基因的步驟如下①取頭花蓼、尼泊爾蓼藥材各50mg，放入已消毒的2個(gè)研缽中，分別加入CTAB提取液約MOO μ L，分別迅速研磨，在研磨的過程中加入20 μ L β -巰基乙醇，研磨至粉末糊狀；②用鑷子取離心管放在離心板上，編號(hào)，待用；③分別用移液槍將研磨好的藥材提取液吸取700 μ L至離心管中；離心管插于漂浮板上，60°C水浴加熱60min，每IOmin振搖一次；④取出離心管，分別加入700 μ L氯仿異戊醇=24 1的混合溶液，充分混勻， 室溫下12，OOOrpm離心IOmin ；⑤將離心管的上層水相轉(zhuǎn)入一新離心管中，分別加入700μ L CTAB沉淀緩沖液，混勻，室溫下靜置濁；⑥室溫下12，OOOrpm離心lOmin，棄廢液；⑦向離心管中加入700 μ L70%的乙醇，室溫下12，OOOrpm離心5min，棄廢液；⑧再加入700yL 95%的乙醇，室溫下12，OOOrpm離心5min，棄廢液；⑨敞開離心管口，在室溫下放置5h，揮干乙醇，得到所提取的藥材總DNA ；⑩裝有藥材DNA的離心管中于_20°C貯存?zhèn)溆谩２襟E3)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為分別取4支50 μ L的PCR反應(yīng)管，建立頭花蓼藥材、尼泊爾蓼藥材、陰性對(duì)照1、陰性對(duì)照2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系①頭花蓼PCR反應(yīng)管中加入以下成分頭花蓼DNA模板1 μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmiX13l·! L，一對(duì)IOpmol .L—1的高度特異性鑒別引物各1 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ L ；
②尼泊爾蓼PCR反應(yīng)管中加入以下成分尼泊爾蓼DNA模板1 μ L，IOmmol ·廠1 的dNTPmix 13 μ L，一對(duì)IOpmol · L-1的高度特異性鑒別引物各1 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至 25μ L ；③陰性對(duì)照1的PCR反應(yīng)管中加入以下成分頭花蓼DNA模板1 μ L，IOmmol · L—1 的dNTPmix 13 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ L ；④陰性對(duì)照2的PCR反應(yīng)管中加入以下成分IOmmol 'Γ1的dNTPmix 13 μ L，一對(duì) IOpmol · L-1的高度特異性鑒別引物各1 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ L。步驟3)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性lmin，51°C退火 45s，72°C延伸2min，循環(huán)40次；72°C后延伸7min，4°C保存。步驟4)中，所述檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果的步驟為分別自4支PCR反應(yīng)管中取5μ L 反應(yīng)液加入1 μ L溴酚藍(lán)溶液染色后，再將染色液加入1. 0%瓊脂糖凝膠梳孔，在TE緩沖液中電泳lh，取出，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照觀察；結(jié)果在瓊脂糖凝膠上，頭花蓼藥材在與 Mark 300bp相對(duì)應(yīng)位置，可見一條明亮的電泳帶，而尼泊爾蓼藥材在相同位置無任何條帶出現(xiàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以貴州具有代表性的民族藥熱淋清顆粒的唯一原料藥材頭花蓼為研究對(duì)象，探索使用RAPD分析方法對(duì)頭花蓼及近緣種進(jìn)行遺傳多樣性分析；并在 RAPD的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將RAPD方法轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，為頭花蓼及其近緣種鑒定提供準(zhǔn)確可靠、快速穩(wěn)定的方法。本發(fā)明用篩選18條RAPD引物對(duì)頭花蓼、尼泊爾蓼進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了頭花蓼及其近緣種的RAPD指紋圖譜，從RAPD圖譜中找到能特異性區(qū)分頭花蓼和尼泊爾蓼的電泳條帶，對(duì)之進(jìn)行切膠、回收并進(jìn)行測(cè)序，然后根據(jù)序列設(shè)計(jì)出4對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將 RAPD 轉(zhuǎn)化為 SCAR0 其中的引物 THL12f 和 THL 12r (5，-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3，， 5’ -TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3’ )在300bp時(shí)可以明確鑒別出頭花蓼(頭花蓼有電泳帶，尼泊爾蓼無電泳帶)。本發(fā)明所提供的SCAR標(biāo)記特異性好，穩(wěn)定可靠，操作簡(jiǎn)單，可鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼，達(dá)到了發(fā)明目的，并在“熱淋清顆粒”原藥材的使用中得到較好推廣應(yīng)用。發(fā)明人進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下實(shí)驗(yàn)例1 頭花蓼與尼泊爾蓼的RAPD分析1材料和儀器1. 1實(shí)驗(yàn)材料采集貴州頭花蓼、尼泊爾蓼用硅膠迅速干燥，-20°C保存。各樣品由貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥教研室江維克教授鑒定。見表1表1實(shí)驗(yàn)材料
權(quán)利要求
1.一種鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼的引物，其特征在于所述引物序列如下5’ -GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3‘5， -TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，。
2.一種利用DNA分子標(biāo)記鑒別技術(shù)鑒別頭花蓼與尼泊爾蓼的方法，其特征在于操作步驟如下1)合成特異性鑒別引物按序列 5，-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3，，5，-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3，合成一對(duì)特異性鑒別引物；2)以改良CTAB法分別提取頭花蓼DNA基因、尼泊爾蓼DNA基因；3)以步驟2)所得的頭花蓼DNA基因和尼泊爾蓼DNA基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟幻中，所述以改良CTAB法分別提取頭花蓼DNA基因、尼泊爾蓼DNA基因的步驟如下①取頭花蓼、尼泊爾蓼藥材各50mg，放入已消毒的2個(gè)研缽中，分別加入CTAB提取液約 MOO μ L，分別迅速研磨，在研磨的過程中加入20 μ L β-巰基乙醇，研磨至粉末糊狀；②用鑷子取離心管放在離心板上，編號(hào)，待用；③分別用移液槍將研磨好的藥材提取液吸取700μ L至離心管中；離心管插于漂浮板上，60°C水浴加熱60min，每IOmin振搖一次；④取出離心管，分別加入700yL氯仿異戊醇=M 1的混合溶液，充分混勻，室溫下 12，OOOrpm 離心 IOmin ；⑤將離心管的上層水相轉(zhuǎn)入一新離心管中，分別加入700μ L CTAB沉淀緩沖液，混勻， 室溫下靜置濁；⑥室溫下12，OOOrpm離心lOmin，棄廢液；⑦向離心管中加入700μL70%的乙醇，室溫下12，OOOrpm離心5min，棄廢液；⑧再加入700μ L 95%的乙醇，室溫下12，OOOrpm離心5min，棄廢液；⑨敞開離心管口，在室溫下放置釙，揮干乙醇，得到所提取的藥材總DNA；⑩裝有藥材DNA的離心管中于_20°C貯存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為分別取4支50 μ L的PCR反應(yīng)管，建立頭花蓼藥材、尼泊爾蓼藥材、陰性對(duì)照1、陰性對(duì)照2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系①頭花蓼PCR反應(yīng)管中加入以下成分頭花蓼DNA模板1μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmiX13l·! L，一對(duì)IOpmol .L—1的高度特異性鑒別引物各1 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ L ；②尼泊爾蓼PCR反應(yīng)管中加入以下成分尼泊爾蓼DNA模板1μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmix 13 μ L，一對(duì)IOpmol · Γ1的高度特異性鑒別引物各1 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至 25μ L ；③陰性對(duì)照1的PCR反應(yīng)管中加入以下成分頭花蓼DNA模板1μ L，IOmmol · L—1的 dNTPmix 13 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ L ；④陰性對(duì)照2的PCR反應(yīng)管中加入以下成分10mmol· Γ1的dNTRnix 13 μ L，一對(duì) IOpmol · Γ1的高度特異性鑒別引物各1 μ L，加入雙蒸水補(bǔ)齊至25 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟幻中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性5min ；94°C變性lmin，51°C退火45s，72 °C延伸2min，循環(huán)40次；72°C后延伸 7min，4°C 保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟4)中，所述檢測(cè)PCR反應(yīng)結(jié)果的步驟為分別自4支PCR反應(yīng)管中取5 μ L反應(yīng)液加入1 μ L溴酚藍(lán)溶液染色后，再將染色液加入 1. 0%瓊脂糖凝膠梳孔，在TE緩沖液中電泳lh，取出，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照觀察；結(jié)果在瓊脂糖凝膠上，頭花蓼藥材在與Mark 300bp相對(duì)應(yīng)位置，可見一條明亮的電泳帶，而尼泊爾蓼藥材在相同位置無任何條帶出現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明以貴州具有代表性的民族藥頭花蓼為研究對(duì)象，探索使用RAPD分析方法對(duì)頭花蓼與尼泊爾蓼進(jìn)行遺傳多樣性分析；并在RAPD的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將RAPD方法轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，為頭花蓼與尼泊爾蓼的藥材鑒定提供了準(zhǔn)確可靠、快速穩(wěn)定的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102296118SQ20111026322
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者周濤, 張麗艷, 李孟林, 梁斌, 江維克, 王尚華, 謝宇 申請(qǐng)人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司