專利名稱：快速檢測基因組中基因拷貝數的方法
技術領域：
本發明屬于生物DNA檢測技術，特別是一種快速檢測基因組中基因拷貝數的方法。
背景技術：
在現代的科學研究和生產實踐中，我們有時需要準確地知道生物體的基因拷貝數。比如，人類脊柱肌肉萎縮癥(Spinal muscular atrophy, SMA)的遺傳病因是一對SMA 基因中的一個部分缺失。我們需要準確地知道其基因的拷貝數，才能做出正確的診斷。又如，隨著轉基因技術在農業生產中的應用，各個國家對轉基因生物采取了嚴格的控制，研究者必須準確地知道目標基因在轉基因植物中的拷貝數。現行測定基因拷貝數的方法有三種1、生物雜交法。將轉基因植物與非轉基因植物相互雜交，根據子代中轉基因植物的比率和孟德爾定律，推算出目標基因在轉基因植物中的拷貝數。2、Southern印跡法。將轉基因植物的DNA用限制性內切酶水解，然后用瓊脂糖凝膠電泳將DNA按片段大小分開，再將其轉移到硝酸纖維或尼龍膜上。將目標基因用放射性同位素或其他方法標記，然后和印到膜上的DNA雜交。根據放射性條帶的數值，推斷出目標基因的拷貝數。3、實時PCR法。實時PCR又稱TaqMan PCR,它用一對基因的PCR引子和探針以及DNA聚合酶，通過反復的熱冷循環，將目標基因以指數形式擴增。由于PCR產物可以用熒光來定量，而且熒光閾值循環數(Threshhold Cycle, Ct)與被擴增基因的起始濃度對數是直線負相關的，因此我們可以用目標基因和已知內參照基因的Ct差值來確定目標基因的基因拷貝數。現有技術的最明顯的缺陷在于1、用時長，耗資大。上述生物雜交法需要一個整個植物生長季才能產生子一代，并需要檢測大量的子一代才可以獲得有統計意義的數據。2、 需特殊設備和裝置。上述Southern印跡法需要放射性同位素操作許可和暗房等基礎設施和條件，還需要大量資金處理放射性廢物。非放射性方法很難達到檢測單一基因的靈敏度， 且價格昂貴。3、基于不充分的假設。上述實時PCR 2ΔΔα法基于一個不充分的假設，即目標基因和內參照基因具有同樣的PCR擴增系數。但這項假設一般難以成立，不同序列和長度的基因，其PCR擴增系數都有差異。由于PCR是以指數方式擴增基因的，微小的PCR擴增系數差異會在多個循環擴增后造成PCR擴增的巨大差異，直接影響基因拷貝數的計算。4、基于不充分的試驗條件。現有實時PCR測定基因拷貝數的方法，都需要生物標準品，標準品中含有已知拷貝數的目標基因和內參照基因，然后用實驗樣品同標準品比較，方可得出其目標基因的拷貝數。但這對于一個新物種或新的目標基因非常難于實現。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術之不足，提供一種快速檢測基因組中基因拷貝數的方法。本發明的目的按照下述方案實現快速檢測基因組中基因拷貝數的方法，包括以下操作步驟1)選取生物體中一個已知拷貝數的基因為內參照基因，分別設計目標基因和內參照基因的TaqMan PCR引物和探針；2)用PCR反應將目標基因和內參照基因分別擴增和純化，測試各自的重量濃度，并根據其核酸片段長短，將重量濃度換算為摩爾濃度；3)將目標基因和內參照基因按不同摩爾濃度比混合成系列標準品，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因標準品的閾值熒光循環數，并將系列閾值熒光循環數差值與相應摩爾濃度比的對數做成標準曲線；4)提取并純化所測生物體DNA，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因的閾值熒光循環數，算出其差值，然后按照標準曲線將其換算為目標基因和內參照基因摩爾濃度比，亦即基因拷貝數比；
所述目標基因和內參照基因的標準摩爾濃度溶液是由PCR擴增并純化制成的； 所述不同摩爾濃度比的目標基因/內參照基因標準混合液，是由權利要求2的目標基因和內參照基因的標準摩爾濃度溶液按比例相混制成的；
目標基因/內參照基因的標準曲線，是由目標基因和內參照基因閾值熒光循環數的差值與目標基因和內參照基因摩爾濃度比的對數值對應形成的；
提取并純化生物體的DNA，用實時PCR測定其目標基因和內參照基因的閾值熒光循環數，并根據權利要求4的標準曲線來確定目標基因和內參照基因的基因拷貝數比值。本發明對實時PCR測定基因拷貝數的方法做出了重大改進。它將不再拘于現行的簡單假設-所有PCR都具有相同的擴增系數，而是基于實驗模擬，這從根本上解決了測定基因拷貝數的理論基礎問題。同時它也將不再需要一個已知目標基因和內參照基因拷貝數的標準品，解決了如何獲取第一個標準品的難題。本發明的具體步驟如下
1、選取生物體中一個已知拷貝數的基因為內參照基因，分別設計目標基因和內參照基因的TaqMan PCR引物和探針；2、用PCR反應將目標基因和內參照基因分別擴增和純化，測試各自的重量濃度，并根據其核酸片段長短，將重量濃度換算為摩爾濃度；3、將目標基因和內參照基因按不同摩爾濃度比混合成系列標準品，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因標準品的閾值熒光循環數，并將系列閾值熒光循環數差值與相應摩爾濃度比的對數做成標準曲線；4、提取并純化所測生物體DNA，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因的閾值熒光循環數，算出其差值，然后按照標準曲線將其換算為目標基因和內參照基因摩爾濃度比，亦即基因拷貝數比。因為內參照基因的拷貝數是已知的，我們可以由此可以得知目標基因在該生物體中的拷貝數。


圖1.本發明方法圖解
圖2. TaqMan PCR的反應機理
圖3.不同量DNA的TaqMan PCR反應。DNA經過系列稀釋，然后加入iTaqMan PCR 反應試管中，與探針反應。不同量的DNA需要不同的PCR循環方可產生可測熒光(該PCR循環數稱為Ct或閾值循環數);起始DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循環方可產生可測熒光。圖4.基因濃度與TaqMan PCR閾值熒光循環數的關系。
圖 5. ACt (Ct,HvNHXl - Ct，MsCycl)與摩爾濃度比對數{Log2(HvNHXl/MsCyclX} 相關性的標準曲線。圖 6. ACt (Ct，HvNHXl - Ct，MsNHXl)與摩爾濃度比對數{Log2 (HvNHXl/ MsNHXl)}相關性的標準曲線。圖 7. ACt (Ct，MsCycl - Ct，MsNHXl)與摩爾濃度比對數{Log2 (MsCycl/ MsNHXl)}相關性的標準曲線。
具體實施例方式參照表1.轉基因紫花苜蓿的內參照基因MsCycl和MsNHXl以及轉基因HvNHXl 的閾值熒光循環值。表2.確定生物體中的基因拷貝數。本發明的具體步驟如下
以自構建的轉基因紫花苜蓿為例。在轉基因紫花苜蓿中，目標基因大麥鈉氫離子對流泵(HvNHXl)被農桿菌Ti質粒引入紫花苜蓿基因組中，我們需要檢測該基因在紫花苜蓿基因組中的拷貝數。在紫花苜蓿中，細胞周期蛋白1 (MsCycl)和紫花苜蓿鈉氫離子對流泵1 (MsNHXl)已經被前人用Southern Blot方法證明是單拷貝基因，我們用它們作為內參照基因。我們從商業機構訂制了 TaqMan探針和PCR引子，如下
HvNHXl TaciMan 探針5，FAM-TGGAAATTTGCTAGTGACAGCCCTGGC-3，Iowa Black MsCycl TaqMan 探針5' FAM-AAGCTTCAGTTGGTTGGTTTAGTGGCAATG-3' Iowa Black MsNHXl TaqMan 探針
5，FAM/TTCCTGTAGAACCTGGCTCACCAAGTGAA/3，Iowa Black 在上述探針中，FAM是熒光染料，Iowa Black是猝光劑。HvNHXl PCR 弓 | 子5 ‘ -TGGATGCACTGGATATCGAGAA-3 ‘ 禾口 5'-AAAATTGAGCTTATTCCGATGGAT-3’
MsCycl PCR 引子5 ‘ - TGGAAAAGCAGTCTGTGGTAAGAA-3‘ 禾口 5'-TCCTCATACTTGCATGCCAAAA-3’
MsNHXl PCR 引子5，-TGTTTTTGGTGGCAGAGGTTT-3，和 5，-CAACCCCATTGATTACCATTGC-3’
當熒光染料和猝光劑被同時連在iTaqMan探針上時，由于FRET效應(FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)，FAM 的熒光將被猝光劑 IOWA BLACK 吸收而無法發出。但在聚合酶鏈式反應(PCR)中，探針將被DNA聚合酶水解，使FAM游離出來，發出熒光(見圖2)。DNA由兩條反向螺旋鏈組成，且這兩條鏈上的堿基彼此互補，腺嘌呤對胸腺嘧啶 (A對T)，鳥嘌呤對胞嘧啶(G對C)。當DNA雙鏈的堿基不互補時，它們將無法形成穩定的 DNA雙螺旋結構。如上所述，我們已測知HvNHXl和MsCycl基因的DNA序列，我們根據這些差別設計出它們各自特異的iTaqMan探針。HvNHXl的I1aqMan探針只能和的HvNHXl基因完全互補，形成穩定的DNA雙螺旋結構；反之MsCycl的TaqMan探針只能和MsCycl的基因完全互補，形成穩定的DNA雙螺旋結構。因為TaqMan PCR反應產生熒光的先決條件是TaqMan探針與其互補鏈形成穩定的結構，所以MsCycl探針只有和MsCycl DNA在一起時才能產生熒光，反之HvNHXl探針只有和HvNHXl DNA在一起時才能產生熒光。TaqMan PCR反應不僅有很強的專一性，還有很強的定量性。如圖3所示，不同量的基因DNA需要不同的PCR循環方可產生可測熒光(該PCR循環數稱為Ct或閾值循環數);起始DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循環方可產生可測熒光。我們將上面試驗中DNA量的對數與其Ct作圖，我們可以得到如下對應關系標準曲線，如圖4。從圖4我們可以看出，一個基因濃度的對數與其Ct是直線負相關的。因此，我們用TaqMan PCR不僅可以區分目標基因和內參照基因，還可以將其分別定量。在本發明中，我們將檢測目標基因拷貝數看成一個目標基因與內參照基因摩爾濃度比值的特例。我們用PCR專一地擴增目標基因HvNHXl和內參照基因MsCycl和MsNHXl ； 我們將擴增的HvNHXl、MsCycl和MsNHXl基因純化；我們用紫外分光光度計測出其重量濃度，然后根據其堿基長度算出其摩爾濃度。我們將HvNHXl、MSCycl以及MsNHXl按不同的摩
爾濃度比相混，然后用TaqMan PCR分別測出Ct
HvNHXl;
Ct
MsCycl
和Ct,MsNHX1，由此我們可以得到
ACt (Ct
-Ct
MsCycl
)與摩爾濃度比對數{Log (HvNHXl/MsCycl)}相關性的標準曲線,
從理論可以推算出ACt (Ct
HvNHXl
-Ct
MsCycl
)與摩爾濃度比對數ILog2 (HvNHXl/MsCycl) }
是線性相關的，如圖5。用同樣的方法，由此我們可以得到ACt (Ct
-Ct
,MsNHXl
11 ~~ Ct, MsNHXl )與摩爾
)與摩爾濃度比對數ILog
濃度比對數{Log (HvNHXl/MsNHXl)}以及 ACt (Ct,MsCycl (MsCycl/MsNHXl) }相關性的標準曲線，如圖6和圖7。 對實驗轉基因紫花苜蓿，我們測得HvNHXl，MsCycl和MsNHXl的閾值熒光循環數如表1
基因 HvNHXl MsCyd MsNHXI 24.87 23.98 23.87 24.3 24.14 24.03 24.41 23.94 24.23
24.0524.51 23.87 24.08 24.41 24,03
24.0624.18 24.23
乎均 24.295 24,19333 24.04333
表1
我們根據圖5、6、7的標準曲線將其轉化為基因濃度比，亦即基因拷貝數比，如表2。
UBS 爾濃磨 α ι Pl ι uatii
￥=4 J 14x+ 0.0563 MsCfdiMsNHKI .150.941:1表2
因此，對于任何一個實驗生物，我們僅需用TaqMan PCR測定其目標基因和內參照基因的Ct值，就可以根據標準曲線來確定其摩爾濃度比，亦即基因拷貝數。上述具體實驗設備及條件如下(1) TaqMan PCR反應條件如下
在伯樂公司的96孔板上，加入下述反應試劑1 χ PCR緩沖液II (ABI，無Mg2+)，3mM MgCl2 ,300 mM dNTP，200 nM PCR 正向引物，200 nM 反向引物，300 nM TaqMan IOffA BLACK 探針，1 U GoldTaq DNA聚合酶(ABI)，DNA樣品，總反應體積為12.5微升。TaqMan PCR反應溫度控制如下95 C 11分鐘，40個循環(94 C 30秒，65 C 30秒)。(2) PCR反應條件如下
在200 μ 1的PCR反應管中，加入下述反應試劑1 X PCR緩沖液II (ΑΒΙ，無Mg2+)， 3mM MgCl2 ,300 mM dNTP，200 nM PCR 正向引物，200 nM 反向引物，1 U GoldTaq DNA 聚合酶(ABI)，DNA樣品，總反應體積為12. 5微升。TaqMan PCR反應溫度控制如下95 C 11分鐘，40個循環(94 C 30秒，65 C 30秒)。(3) PCR DNA純化和定量方法如下
用QIAGEN公司的QiaQuick PCR Purification試劑盒純化PCR擴增的HvNHXl和 MsCycl基因。用紫外分光光度計0D260測定純化基因的重量濃度。根據基因的堿基長度， 將基因的重量濃度換算為摩爾濃度。
權利要求
1.快速檢測基因組中基因拷貝數的方法，包括以下操作步驟1)選取生物體中一個已知拷貝數的基因為內參照基因，分別設計目標基因和內參照基因的TaqMan PCR引物和探針；2)用PCR反應將目標基因和內參照基因分別擴增和純化，測試各自的重量濃度，并根據其核酸片段長短，將重量濃度換算為摩爾濃度；3)將目標基因和內參照基因按不同摩爾濃度比混合成系列標準品，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因標準品的閾值熒光循環數，并將系列閾值熒光循環數差值與相應摩爾濃度比的對數做成標準曲線；4)提取并純化所測生物體DNA，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因的閾值熒光循環數，算出其差值，然后按照標準曲線將其換算為目標基因和內參照基因摩爾濃度比，亦即基因拷貝數比。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述目標基因和內參照基因的標準摩爾濃度溶液是由PCR擴增并純化制成的。
3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于所述不同摩爾濃度比的目標基因/內參照基因標準混合液，是由權利要求2的目標基因和內參照基因的標準摩爾濃度溶液按比例相混制成的。
4.根據權利要求1-3任一所述方法，其特征在于目標基因/內參照基因的標準曲線， 是由目標基因和內參照基因閾值熒光循環數的差值與目標基因和內參照基因摩爾濃度比的對數值對應形成的。
5.根據權利要求1-4任一所述方法，其特征在于提取并純化生物體的DNA，用實時 PCR測定其目標基因和內參照基因的閾值熒光循環數，并根據權利要求4的標準曲線來確定目標基因和內參照基因的基因拷貝數比值。
全文摘要
快速檢測基因組中基因拷貝數的方法，包括以下操作步驟1)選取生物體中一個已知拷貝數的基因為內參照基因，分別設計目標基因和內參照基因的TaqManPCR引物和探針；2)用PCR反應將目標基因和內參照基因分別擴增和純化，測試各自的重量濃度，并根據其核酸片段長短，將重量濃度換算為摩爾濃度；3)將目標基因和內參照基因按不同摩爾濃度比混合成系列標準品，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因標準品的閾值熒光循環數，并將系列閾值熒光循環數差值與相應摩爾濃度比的對數做成標準曲線；4)提取并純化所測生物體DNA，用實時PCR儀分別測定目標和內參照基因的閾值熒光循環數，算出其差值，然后按照標準曲線將其換算為目標基因和內參照基因摩爾濃度比，亦即基因拷貝數比。
文檔編號C12Q1/68GK102337340SQ20111031711
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者李健, 柳金鳳, 計皖 申請人:寧夏林業研究所股份有限公司