基因全片段快速測序方法
【專利摘要】本發明提供了基因全片段(>50kb)快速測序方法，該方法包括以下步驟：(1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶，在相同PCR條件下擴增不同基因片段，所述PCR條件優選96℃～100℃變性5～15sec，66℃～70℃退火延伸6～10min，25～35個循環；(2)標準化PCR產物；(3)制備測序文庫；(4)基因測序。使用本方法可在相同PCR條件下擴增不同長度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火溫度及延伸時間即可成功擴增出目的片段，結合MiSeq平臺進行測序，為長鏈PCR與新一代基因測序技術的結合應用提供了一種24小時內生成結果的快速有效的方法。
【專利說明】基因全片段快速測序方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因測序【技術領域】，具體涉及基因全片段快速測序方法。
【背景技術】
[0002] 為了獲得目的物的類型和是否具有相關突變等一系列信息，近年來各國相繼建立 起病毒變異和耐藥基因序列測定的方法。基因序列測定分析法同其他方法相比，在技術上 和經濟上都具有明顯優勢。基因序列測定分析法檢測的是易突變區域的完整序列。新一代 的個人基因組測序儀，如Illumina的MiSeq和Ion Torrent公司的PGM，已普遍應用與科研 和臨床檢測。這些測序平臺的多用性和靈活性更適用于科研周期較快速的小型實驗室的科 研。將測序與長鏈PCR結合可以為遺傳變異檢測提供更快捷更經濟的方法。
[0003] 自聚合酶鏈反應（PCR)出現以來，已成為分子生物學中克隆DNA小片段不可或缺 的方法之一。1992年，Barnes研發了新的PCR條件可以使擴增片段達5KB,通過改變酶的 條件，長鏈PCR的擴增片段可以從 3_5KB至超過30KB。長鏈PCR技術的進步使得PCR更快 速、更簡潔的用于基因組圖譜和測序，并促進分子遺傳學的研究。然而，傳統的PCR有擴增 片段長度的限制，且在實驗中成功地擴增所有擴增子，需要改變退火溫度和延伸時間，這是 因為擴增子不同的長度及引物具有不同Tm值。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明提供了基因全片段快速測序方法，該方法結合了長鏈PCR與新 一代基因測序技術且PCR擴增在相同PCR條件下即可擴增目的片段。
[0005] 基因全片段快速測序方法，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶,在相同PCR條件下擴增不同基因片段，所述PCR 條件優選96°C?100°C變性5?l5sec，66°C?7〇°C退火延伸6?10min，25?35個循環；
[0007] (2)標準化PCR產物；
[0008] (3)制備測序文庫；
[0009] (4)基因測序。
[0010] 本發明提供的基因全片段快速測序方法的有益效果是：本發明在相同PCR條件下 擴增不同長度基因片段和不同Tm值的引物，相同退火溫度及延伸時間即可成功擴增出目 的片段，并結合MiSeq平臺進行測序，為長鏈PCR與新一代基因測序技術的結合應用提供了 一種快速有效的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是擴增所得目的片段
[0012]圖2是與遺傳性乳腺癌相關的致病突變，該突變為BRCA2中c. 5946delT
[0013] 圖3是所有樣品中存在的突變，該突變為BRCA2中c. 4563A>G
[0014] 圖4是所有樣品中存在的突變，該突變為c. 2972A>G
[0015] 圖5是樣品2, 7, 8存在的突變，該突變為BRCA1中c. 19410T和c. 1936G>A
【具體實施方式】
[0016] 本發明提供的基因全片段快速測序方法，該方法包括以下步驟：
[0017] (1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶,在相同PCR條件下擴增不同基因片段，所述PCR 條件優選96°C?l〇〇°C變性5?15sec，66°C?70°C退火延伸6?10min，25?35個循環；
[0018] (2)標準化PCR產物；
[0019] (3)制備測序文庫；
[0020] (4)基因測序。
[0021] 下面將結合實施例對本發明提供的方法予以進一步的說明。
[0022] 收集八位對照組患者和實驗組1例遺傳性乳腺癌患者的外周血，提取DNA用于長 鏈PCR擴增和下一代測序，以評估實驗能否在一組患者中穩定使用并成功地識別陽性突變 位點。
[0023] 乳腺癌易感基因的快速測序方法步驟如下：
[0024] (1)選用TaKaRa公司的PrimeSTAR GXL DNA酶，采用在同一溫度下退火延伸的 二步法，在相同PCR反應條件下擴增BRCA1和BRCA2的全基因區域，BRCA1基因定位為 CHR17:41196312-41279500, GRCh37/hgl9, BRCA1 基因定位為 CHR13:32889617-32973809， GRCh37/hgl9。
[0025] PCR 擴增體系：35ng DNA 模板，2·5μηιο?Λ 的引物 3.2yL，5XPrimeSTAR 緩沖液 4 μ L，1· 6 μ L dNTP，0· 4LPrimeSTAR GXL DNA酶，加蒸餾水至反應體系總體積20 μ L。所述 引物序列見表1。
[0026] 表1 BRCA1和BRCA2基因引物序列
[0027] ___
【權利要求】
1. 基因全片段快速測序方法，該方法包括以下步驟：（1)采用PrimeSTAR GXL DNA酶， 在相同PCR條件下擴增不同基因片段，所述PCR條件優選96°C?100°C變性5?15sec， 66°C?70°C退火延伸6?10min，25?35個循環；（2)標準化PCR產物；（3)制備測序文庫； ⑷基因測序。
2. 根據權利要求1所述的基因全片段快速測序方法，其特征在于：步驟（1)所述基因 片段為BRCA1和BRCA2基因。
3. 根據權利要求1所述的基因全片段快速測序方法，其特征在于：步驟（2)所述標準 化PCR產物采用Agencourt AMPure XP PCR試劑盒純化目的片段，使用Qubit dsDNA BR Assay試劑盒標準定量DNA。
4. 根據權利要求1所述的基因全片段快速測序方法，其特征在于：步驟（3)所述文庫 制備采用Nextera XT試劑盒進行制備。
5. 根據權利要求1所述的基因全片段快速測序方法，其特征在于：步驟（4)所述基 因測序采用Illumina的MiSeq平臺進行測序，使用BWA進行比對，GATK軟件分析突變， wANNOVAR網絡服務器注釋分析結果。
6. 根據權利要求5所述的基因測序，其特征在于：IIIUmina的MiSeq平臺進行測序的 測序參數為2X250讀長。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232761SQ201410429092
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月27日 優先權日:2014年8月27日
【發明者】王凱, 汪鋒, 趙倩, 賈海英 申請人:武漢凱吉盈科技有限公司