專利名稱：一種堿性木聚糖酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種堿性木聚糖酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
木聚糖是一種多聚五碳糖，主要成分是D-木糖，是植物半纖維素的重要組成部分，它占植物碳水化合物總量的1/3，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的再生生物資源。木聚糖的結構復雜，主鏈由P-D-吡喃木糖殘基經￠-1,4-糖苷鍵連接成，不同來源的木聚糖有不同的側鏈取代基團。內切-P-1，4_D-木聚糖酶(endo-0-1,4-D-xylanase)[EC 3.2.1. 8]，簡稱木聚糖酶，負責木聚糖主鏈骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶。根據糖苷水解酶催化區域的氨基酸序列組成和疏水性分析，可將糖苷水解酶類分成不同的家族，目前發現的木聚糖酶主要屬于F/10和G/11家族。木聚糖酶具有重要的潛在應用價值，廣泛應用在食品、飼料、制漿造紙、生物脫膠等行業。木聚糖酶有巨大的應用潛力，但應用在不同的領域對木聚糖酶的性質有不同的要求。一般來說，最適作用溫度決定了酶的應用領域，熱穩定性則與酶能否工業化生產有很大關系。如造紙需高溫和堿性的條件，紙漿底物需要嗜熱堿酶才能有效地進行生物漂白。堿性木聚糖酶也被應用于生物脫膠 和洗滌劑生產中。飼料粒化前加入木聚糖酶主要在70 95°C下進行，因此熱穩定性好的木聚糖酶可應用到動物飼料的生產。另外，飼用酶必須在溫度約為40°C，pH約為4. 8的條件下具有高度的活性，以適應動物消化道的環境。面漿團通常在低于35°C的條件下調制，因此，在低溫或中溫的條件下酶活很高的嗜冷木聚糖酶目前被用于低溫或中溫加工過程中特別是食品業。由于不同工業生產中需要不同性質的酶，因此，研究新的具有優良性質的木聚糖酶具有重大意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種蛋白。本發明提供的蛋白，可人工合成，是如下(a)或(b)或(C)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)由序列2自N端第28-366所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶功能的由(a)或(b)衍生的蛋白質。其中序列表中序列2由366個氨基酸組成，分子量約37kDa。所述蛋白(木聚糖酶)的編碼基因具體可為如下I)-3)中任一所述的DNA分子I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在嚴格條件下可與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子。序列表中的序列I由1101個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1101位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白。上述嚴格條件可為在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。含有上述蛋白編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范圍。所述重組載體具體為在pET28a的BamH I和Xho I位點間插入所述蛋白的編碼基因得到的重組載體pET28a-BcxylllA。所述重組菌具體可為在大腸桿菌BL21(DE3)、BL21_Gold (DE3)、BL21_Gold (DE3)pLysS或BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL中導入含有上述木聚糖酶編碼基因的重組載體得到的重組菌。擴增上述內切木聚糖酶編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍，所述引物對的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。本發明的第二個目的是提供一種制備木聚糖酶的方法。本發明所提供的制備木聚糖酶的方法，是發酵培養所述的重組菌，即得到木聚糖酶。所述培養溫度為37°C，所述培養的時間為6h。本發明的實驗證明 ，本發明從錫盟堿湖中分離到嗜堿菌Bacilluscellulosilyticus SN5，通過構建菌基因組文庫，獲得木聚糖酶編碼基因，并將其轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，實驗結果表明，本發明的木聚糖酶具有較高的最適反應溫度，很好的熱穩定性和堿穩定性，在高鹽中穩定性和抗逆性較高，具有較高的比活力，是目前細菌來源的比活力最高的木聚糖酶，因此，此木聚糖酶在紙漿漂白、生物脫膠及洗滌劑生產中具有較好的應用前景。


圖1為重組木聚糖酶BcxylllA的SDS-PAGE電泳2為重組木聚糖酶BcxylllA的最適反應溫度圖3為重組木聚糖酶Bcxyl IIA的最適反應pH圖4為重組木聚糖酶BcxylllA的熱穩定性圖5為重組木聚糖酶BcxylllA的pH穩定性圖6為NaCl對重組木聚糖酶BcxylllA的酶活性影響圖7為重組木聚糖酶BcxylllA對NaCl的耐受性
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、木聚糖酶及其編碼基因的獲得
1、木聚糖酶及其編碼基因的發現錫盟堿湖嗜堿菌SN5是中科院微生物所2010年從我國內蒙錫盟堿湖內分離得到，其16s rRNA基因序列比對結果表明與Bacillus cellulosilyticus DSM2522的相似性為98%,初步鑒定為 Bacillus cellulosilyticus。提取堿湖嗜堿菌Bacillus cellulosilyticus SN5的基因組DNA，用限制性內切酶Sau3A I部分酶切后，切膠回收3-9kb的片段，與經BamH I酶切去磷酸化的pUC118載體連接，轉化感受態細胞E. coli DH5 a，涂布在LB平板(含100 y g/ml Amp、0. 5M IPTG和0. 2% RBB-xylan (Remazol Brilliant Blue R-D-Xylan, sigma 公司產品，目錄號M5019),pH8. 0)上，37°C培養過夜，獲得約1. 5萬個克隆子，其中3個克隆子周圍出現透明圈，為陽性克隆子。對陽性克隆子所含質粒的插入片段進行測序，獲得一個具有1101個核苷酸的0RF，編碼366個氨基酸，存在一個潛在的含27個氨基酸的信號肽。同源比對發現該ORF編碼的氛基酸序列與來自Bacillus sp. YA-335的endo-1,4_beta_xylanase的氛基酸序列有67%的相似性，屬于糖基水解酶11家族成員，將其命名為BcxylllA。2、木聚糖酶及其編碼基因的獲得以Bacillus cellulosilyticus SN5的基因組DNA為模板,所用引物如下正向引物 5' GCATGGATCCCAAATCACTGGAAATGAA ATCG 3'(序列 3，包含 BamH I 酶切識別點 GGATCC和內切酶的保護堿基 GCAT，);反向引物 5' GCTACTCGAGGTGAATTTCTAAGTAGTCGATATAAG3'
(序列4，包含Xho I酶切識別位點CTCGAG和內切酶的保護堿基GCTA)進行PCR擴增，PCR擴增條件如下先95°C預變性5min，然后95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 90s，共35個循環；最后72°C延伸7min，得到1037bp的PCR產物。將上述PCR反應產物用cycle-pure kit純化，用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產物與經相同酶切的pET28a載體(購自Promega公司)用T4連接酶4°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，獲得重組菌。提取重組菌的質粒測序驗證，結果表明，該質粒中的PCR產物具有序列表中序列I自5’末端第82-1098位核苷酸，將其PCR產物的基因命名為BcxylllA,該基因編碼的蛋白命名為BcxylllA,該蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列2自N端第28-366位氨基酸，將序列表中的序列I自5’末端第82-1098位插入pET28a 的 BamH I 和 Xho I 位點間，命名為 pET28a_BcxylllA。也可人工合成序列1，采用上述的方法同樣得到pET28a_BcxylllA。實施例2、利用重組菌發酵生產木聚糖酶1、含有木聚糖酶編碼基因的重組菌的獲得將重組質粒pET28a_BcxylllA轉化表達宿主BL21(DE3)感受態中，得到重組菌BL21 (DE3) /pET28a-Bcxyl 11A，提取質粒進行測序，質粒為pET28a_Bcxyl 11A，說明構建得到含有該質粒的重組菌BL21(DE3)/pET28a-BcxylllA。采用同樣的方法將空載體pET28a轉入BL21 (DE3)中，得到重組菌BL21 (DE3) /pET28a,提取質粒進行 PCR 鑒定，正向引物為 5 ' GCATGGATCCCAAATCACTGGAAATGAAATCG3'(序列 3);反向引物為 5' GCTACTCGAGGTGAATTTCTAAGTAGTCGATATAAG3'(序列 4)，結果未得到目的片段，說明構建得到轉空載體重組菌BL21 (DE3)/pET28a。2、木聚糖酶的純化及活性測定
1)木聚糖酶的純化A、培養將上述步驟I獲得的重組菌BL21 (DE3)/pET28a-BcxylllA的單菌落接種至卡那霉素終濃度為50 u g/ml的5ml LB液體培養基中，37°C培養12h。將培養液按照I %的接種量轉接至200ml新鮮的LB液體培養基中，37°C培養至0D600達到0. 6，再在培養基中加入終濃度為ImM的IPTG繼續誘導培養6h。將培養液6000g離心IOmin收集菌體。B、提取將菌體重懸于10ml 結合緩沖液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 10mM 咪唑，pH7. 9)中，超聲破碎菌體(16v,20min),4°C,15, OOOg離心lOmin，收集上清液，即為Bcxyl IIA粗提液。C、純化將粗提液過His Bind Column (Novagen公司生產)純化上樣前用5ml結合緩沖液洗柱子^fbinding buffer下降至層析介質表面,小心加入制備好的粗酶液；用10倍床體積的IXbinding buffer洗,除去未結合的雜蛋白；5倍床體積的I X wash buffer洗,除去結合較弱的雜蛋白；5倍床體積的IXelute buffer洗。約5ml,棄去最初的0. 2ml和最后的1. 8ml，收集中間的3ml (蛋白主要集中在此區域)。將收集液在AKTA FPLC系統上進行脫鹽，脫鹽條件為緩沖液20mM Tris-HCl,pH8. 0 ;流速3ml/min,收集蛋白峰。采用離心濃縮管(Milipore公司生產)濃縮脫鹽后的樣品溶液至1ml，上樣到Superdex 75 10/300GL柱(GE公司產品)進行分子篩層析，平衡緩沖液為20mMTris-HCl (含 0. 15M NaCl，pH8. 0)，流速 0. 3ml/min，收集各個蛋白峰的樣品，SDS-PAGE鑒定各個洗脫峰的樣品，保留含有BcxylllA的樣品(洗脫柱體積為11. 34ml開始出現該產品)。以重組菌 BL21 (DE3) /pET28a 和 BL21 (DE3)為對照。結果如圖1所示，1:分子量Marker ；2 BL21 (DE3)/pET28a裂解物上清；3 :粗酶液；4 :過鎳柱純化結果；5 :分子篩純化結果，可以看出泳道3-5有大小為約45kD的蛋白，比理論值偏大(因重組蛋白的N端和C端含有載體上的一段His標簽)，純化產物為BcxylllA。重組菌BL21 (DE3) /pET28a和BL21 (DE3)為對照，未得到大小為45kD的目標蛋白，其洗脫產物分別為對照純化產物I和對照純化產物2。2)木聚糖酶的活性測定對上述步驟I)獲得的純化產物、對照純化產物I和對照純化產物2分別進行酶活檢測。將I個酶活單位(U)定義為一定條件下，每分鐘產生Iumol木糖所需要的酶量為
一個單位。酶活測定的反應體系如下將1g樺木木聚糖(xylan from birchwood, sigma,X0502)溶于100ml濃度為50mM，pH8. 0的Tris-HCl緩沖液中，得到xylan底物溶液；取480tl上述xylan底物溶液，分別與20tl濃度為0. 001mg/ml的上述步驟I)獲得的純化產物、對照純化產物I和對照純化產物2混合均勻，50°C反應10min后，加入等體積DNS試劑，然后再煮沸5min顯色。即時冷卻后，取200 U 1，測試540nm處的吸光值。實驗設三次重復，結果取平均值，結果表明，上述步驟I)獲得的純化產物BcxylllA的酶平均比活力為2528u/mg(mg為酶的干重),是目前細菌來源的比活力最高的木聚糖酶。而對照純化產物I和對照純化產物2酶的平均比活力均為0，進一步證明步驟I)獲得的純化產物BcxylllA為木聚糖酶。3、酶學性質表征下述實驗均為重復三次，結果取平均值。A、最適酶促反應溫度的測定取480 ill上述步驟2的2)的xylan底物溶液，加入20 濃度為0. 001mg/ml的上述步驟2的I)獲得的木聚糖酶BcxylllA，混合均勻后分別在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C和70°C下，按照上述步驟2的2)的酶活測定方法測定木聚糖酶BcxylllA在不同溫度下的酶活，以確定最適酶促反應溫度。結果如圖2所示，可以看出最適溫度為50°C，將酶在50°C時的活性設定為100%，在35-55°C之間，相對活性達50%以上。B、最適酶促反應pH值的測定將樣木木聚糖分別溶于50mM下述緩沖液中Na2HP04/citric acid (pH 4. 0-6. 0),sodium phosphate (pH 6. 0-7. 5), Tris/HCl (pH 7. 5-8.8)和 glycine/NaOH(pH 8. 8-10. 4))中，配制不同pH值的xylan底物溶液。取480 上述不同pH值的xylan底物溶液，加入20 u I濃度為0. 001mg/ml的上述步驟2的I)獲得的純化產物木聚糖酶BcxylllA，混合均勻后在50°C下，按照上述步驟2的2)的酶活測定方法測定木聚糖酶BcxylllA在不同pH條件下的酶活，以確定最適酶促反應的pH值。結果如圖3(圖中 是4種緩沖液的結果，不同緩沖液之間有重疊值，進行了換算)所示，可以看出最適PH值為8.0，將酶在pH8.0時的活性設定為100%，在pH6. 0-8. 8之間，相對活性可達50%以上。C、熱穩定性的測定將上述步驟2的I)獲得的木聚糖酶BcxylllA用Tris/HCl緩沖液(50mM、pH8. 8)稀釋至終濃度為0. 00lmg/ml，將上述酶液分別在50 °C、60 V、70°C、80 V下保溫30min、60min、90min和120min，然后按照上述步驟2的2)的酶活力測定方法測定木聚糖酶BcxylllA的殘余酶活力，以測定上述木聚糖酶BcxylllA的熱穩定性。結果如圖4所示，可以看出，50°C下殘余酶活力均高于其他溫度，且處理時間越長，殘余酶活性越小；在501、601、701、801下處理211，殘余酶活分別達起始酶活性的80. 7%,53. 7%,31. 6%和 18. 5%，說明 BcxylllA 有好的熱穩定性。D、pH 穩定性將上述步驟2的I)獲得的木聚糖酶BcxylllA用50mM的不同緩沖液[Na2HPO4/citric acid (pH 4.0-6.0), sodium phosphate (pH 6. 0-7. 5)，Tris/HCl (pH 7. 5-8. 8)和glycine/NaOH(pH 8. 8-10. 4)]稀釋至終濃度為0. 001mg/ml，置于4°C存放24h，然后按照上述步驟2的2)的酶活力測定方法測定木聚糖酶BcxylllA的殘余酶活力，以測定上述木聚糖酶BcxylllA的pH穩定性。結果如圖5所示，可以看出，BcxylllA在pH8. 8時最穩定，在堿性范圍內穩定，在PH8-11范圍內保存24h，殘余酶活達70%以上。E、對鹽離子抗性測試
將上述步驟2的I)獲得的木聚糖酶BcxylllA分別在含有不同濃度的NaCl (0-4M)的I % birchwood xylan底物的Tris/HCl緩沖液(50mM, pH8. 0)溶液中，按照上述步驟2的2)的酶活力測定方法測定木聚糖酶BcxylllA的殘余酶活力，以測定上述木聚糖酶BcxylllA對高鹽的抗性。結果如圖6所示,可以看出，在含有4M NaCl的I % birchwood xylan底物的Tris/HCl緩沖液(50mM，pH8. 0)溶液的殘余酶活力為起始酶活力的49% ;說明BcxylllA對NaCl有一定抗性。F、對鹽離子的耐受性測試將上述步驟2的I)獲得的木聚糖酶BcxylllA置于不同濃度的NaCl (0-4M)的Tris/HCl緩沖液(50mM，pH8. 8)中，4°C放置24h后取樣，按照上述步驟2的2)的酶活力測定方法測定木聚糖酶BcxylllA的殘余酶活力，以考察上述木聚糖酶BcxylllA在高鹽條件下的耐受性。結果如圖7所示，可以看出，BcxylIIA在含有2M NaCl的Tris/HCl緩沖液(50mM，pH8. 8)中的殘余酶活力為66%;在含有4M NaCl的Tris/HCl緩沖液(50mM，pH8. 8)中的殘余酶活力為38% ;說明BcxylllA對鹽離子具有一定耐受性。上述結果表明，上述步驟2的I)獲得的木聚糖酶BcxylllA的最適反應溫度為50°C;最適反應pH值為8. 0 ;且熱穩定性較高，在pH 8.8的條件下，501、601、701、801下處理2h，殘余酶活分別達80. 7%、53. 7%、31.6%和18. 5% ;BcxylllA在pH8. 8時最穩定，在堿性范圍內穩定，在PH8-11范圍內保存24h，殘余酶活達70%以上。此木聚糖酶具有在高達4M NaCl的高鹽條件下，仍具有49%的殘余酶活。同時，此內切木聚糖酶在2M NaCl和4M NaCl中，24h溫育后仍具有66%和38%的殘余酶活。實驗數據表明，木聚糖酶BcxylIIA具有良好的抗逆性和穩定性 以及高的比活力，在紙漿漂白、生物脫膠及洗滌劑生產中具有應用前景。
權利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)或(C)的蛋白質 (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)由序列2自N端第28-366所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (c)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有木聚糖酶功能的由(a)或(b)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)-3)中任一所述的DNA分子 1)序列表中的序列I所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下可與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼具有木聚糖酶功能所述蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pET載體的多克隆位點間插入權利要求1所述蛋白的編碼基因得到的重組載體；所述PET載體優選為載體pET28a0
6.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權利要求5所述的重組載體導入到大腸桿菌BL21 (DE3)中得到的重組菌。
7.擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任一片段的引物對，所述引物對的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。
8.權利要求1所述的蛋白作為木聚糖酶的應用； 或權利要求1所述的蛋白在紙漿漂白、生物脫膠及洗滌劑中的應用。
9.一種制備木聚糖酶的方法，包括如下步驟發酵培養權利要求4或6所述的重組菌，即得到木聚糖酶。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述培養溫度為37°C，所述培養的時間為6h。
全文摘要
本發明公開了一種堿性木聚糖酶及其編碼基因與應用。該蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有內切葡聚糖酶功能的由(a)衍生的蛋白質。本發明實驗結果表明，本發明的木聚糖酶Bcxyl11A具有很高的酶比活力，是目前細菌來源的最高比活力木聚糖酶，該酶熱穩定性好，有利于工業化生產，且在高鹽中都具有較強的抗逆性和穩定性，因此，木聚糖酶Bcxyl11A在紙漿漂白、生物脫膠及洗滌劑生產中具有較好的應用前景。
文檔編號C12R1/19GK103060290SQ20111031712
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者馬延和, 柏文琴, 薛燕芬 申請人:中國科學院微生物研究所