專利名稱：適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法。
背景技術：
在分子生物學技術的研究中，關鍵在于DNA的提取。常規的分子生物學操作如PCR、酶切、雜交，對DNA的質量要求不高，一般分子生物學實驗指導書上的常規方法如濃鹽法、酸堿抽提法等即可滿足其要求。隨著全基因組隨機測序方法的成熟，計算機拼裝算法的發展，基因組時代已經到來，從基因組學角度實現傳統醫學、保健等方面的轉化，將有望使基于基因組測試的個體化診療、健康保健方案成為可能。目前基于基因組測序技術的遺傳疾病診斷、個體化治療、遺傳天賦基因檢測以及基因營養學檢測等已開始為廣大群眾所接受。全基因組測序對DNA的樣品具有高純度、大片段的要求，不同于一般PCR樣品的要求。對于全基因組測序的基因組文庫構建，DNA的需求量較大，長度至少大于23kb，而且質量要求較高，應盡量避免多糖、蛋白質的殘留，否則影響庫的構建及后續測序工作。因此，一次性獲取高質高量的DNA就相當必要。基因組DNA，傳統上是從血液中提取的。這種采血的方法對被收集者造成傷害，帶來痛苦，被絕大多數人所厭惡甚至拒絕；尤其是對嬰幼兒而言，不恰當的取樣方式往往無法滿足提取測試的需要。從唾液等其它體液中獲取基因組DNA是一種對人體無傷害、無痛苦的方法，它簡便易行，廉價高效，避免了采血的不需要配備注射器、消毒用具，且比用棉拭子刮取口腔上皮細胞效果好，特別適用于嬰幼兒基因組DNA的提取。中山大學陳嘉昌等人使用試劑盒方法提取唾液DNA ，效果好但成本高；公安部物證中心周云彪等人發明的使用磁珠法進行唾液DNA分離提取，受限于磁珠等特殊物質的購買，不適宜于大范圍的推廣。

發明內容
為解決上述技術問題，本發明提供一種操作安全、簡便、高通量、成本低、提取的基因組DNA質量好的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法。本發明是一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，包括以下步驟(I)向O. 5-lml嬰幼兒唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，反復吹打混勻后，8000 Xg離心5分鐘，棄去上清，此步驟重復一次；(2)向步驟(I)得到的沉淀中加入500ul裂解液，徹底懸浮沉淀并充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離心管數次；(3)向步驟⑵得到的混合液中，加入RNA酶的水溶液10μ L，37°C下靜置IOmin ；(4)向步驟(3)得到的上清液中，加入等體積苯氛-氯仿混合溶液，充分混勻，混合液4°C，12000 X g離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；
(5)向步驟(4)得到的上清液中加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000 X g離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；(6)向步驟(5)得到的上清液中加入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000 Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；(7)向步驟(6)得到的上清液中加入O. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及O.1倍的醋酸鈉溶液，_20°C靜置60分鐘后，4°C，12000 Xg離心10分鐘，棄上清；(8)向步驟(7)得到的沉淀物中加入O. 5mL70%乙醇清洗沉淀物，4°C，12000 X g離心5分鐘，棄上清，此步驟重復一次；(9)步驟⑶得到的沉淀物自然風干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保存待用。優選的，所述的嬰幼兒 唾液樣品為5歲以下兒童的唾液、淚液、鼻涕。優選的，所述步驟⑴中所述的DNA提取緩沖溶液，溶劑為50mM的Tris-HClpH7. 4，配方中各溶劑組分中濃度為0. 5mM的EDTA、50mM的NaCl ；優選的，所述步驟(2)中，所述的裂解液，溶劑為50mM Tri s_HCl pH7. 4，配方中各溶質組分濃度為50mM Tris-HCl pH7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA，1% Triton χ-100,1%Sodium deoxycholate, 0. 1% SDS,蛋白酶 K 20mg/mL。優選的，所述步驟(3)中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的濃度為10mg/mL。優選的，所述步驟(4)中，所述的苯酚-氯仿混合溶液中，苯酚和氯仿的體積比為
I Io優選的，所述步驟(5)中，所述的苯酚-氯仿-異戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 : 24 :1。優選的，所述步驟￠)中，所述的苯氯仿-異戊醇混合溶液中，苯氯仿和異戊醇的體積比為1:1。優選的，所述步驟(7)中，所述的醋酸鈉的水溶液中，醋酸鈉的濃度為3mol/L。本發明的有益技術效果在于(I)本發明方法操作安全、簡便、高通量、成本低，對人體無傷害、無痛苦。(2)本發明方法所述的DNA提取方法適用與嬰幼兒的體液樣本，提取的基因組DNA純度高，含量高，片段在23kb以上，可以滿足一般分子生物學操作及全基因組測序文庫構建。
具體實施例方式下面結合具體實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。本發明是一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，包括以下步驟(I)向0. 5-lml嬰幼兒唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，反復吹打混勻后，8000Xg離心5分鐘，棄去上清，此步驟重復一次，用于去除唾液中的雜質。(2)向步驟(I)得到的沉淀中加入500ul裂解液，徹底懸浮沉淀并充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離心管數次，用于裂解細胞膜等細胞大結構釋放細胞內容物。(3)向步驟⑵得到的混合液中，加入RNA酶的水溶液10μ L，37°C下靜置lOmin，用于消化降解細胞內的各類RNA。(4)向步驟(3)得到的上清液中，加入等體積苯氛-氯仿混合溶液，充分混勻，混合液4°C，12000 Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內，用于變性抽提溶液中的蛋白質。(5)向步驟(4)得到的上清液中加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000 X g離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內，用于抽提溶液中蛋白質并帶走液體內殘余氛。(6)向步驟(5)得到的上清液中加入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，40C，12000 X g離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內，用于將溶液內殘余氛及氯仿抽提出。(7)向步驟(6)得到的上清液中加入O. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及O.1倍的醋酸鈉溶液，_20°C靜置60分鐘后，4°C，12000 Xg離心10分鐘，棄上清，用于將DNA沉淀分離出來。(8)向步驟(7)得到的沉淀物中加入O. 5mL70%乙醇清洗沉淀物，4°C，12000 X g離心5分鐘，棄上清，此步驟重復一次，用于將沉淀DNA中殘余雜質及有機溶劑進一步去除。(9)步驟⑶得到的沉淀物自然風干，加入20μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，_20°C保存待用，用于將提取的DNA溶解并儲存。優選的，所述的嬰幼兒唾液樣品為5歲以下兒童的唾液、淚液、鼻涕。優選的，所述步驟⑴中所述的DNA提取緩沖溶液，溶劑為50mM的Tris-HClpH7. 4，配方中 各溶劑組分中濃度為0. 5mM的EDTA、50mM的NaCl ；優選的，所述步驟(2)中，所述的裂解液，溶劑為50mM Tris-HCl pH7. 4，配方中各溶質組分濃度為50mM Tris-HCl pH7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Triton χ-100,1%Sodium deoxycholate, 0. 1% SDS,蛋白酶 K 20mg/mL。優選的，所述步驟(3)中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的濃度為10mg/mL。優選的，所述步驟(4)中，所述的苯酚-氯仿混合溶液中，苯酚和氯仿的體積比為
I Io優選的，所述步驟(5)中，所述的苯酚-氯仿-異戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 : 24 :1。優選的，所述步驟￠)中，所述的苯氯仿-異戊醇混合溶液中，苯氯仿和異戊醇的體積比為1:1。優選的，所述步驟(7)中，所述的醋酸鈉的水溶液中，醋酸鈉的濃度為3mol/L。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向O.5-lml嬰幼兒唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，反復吹打混勻后，8000Xg 離心5分鐘，棄去上清，此步驟重復一次；(2)向步驟(I)得到的沉淀中加入500ul裂解液，徹底懸浮沉淀并充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離心管數次；(3)向步驟⑵得到的混合液中，加入RNA酶的水溶液10μL，37°C下靜置IOmin ；(4)向步驟(3)得到的上清液中，加入等體積苯氛-氯仿混合溶液，充分混勻，混合液 4°C，12000 Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；(5)向步驟(4)得到的上清液中加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000 Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；(6)向步驟(5)得到的上清液中加入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C， 12000 Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內；(7)向步驟(6)得到的上清液中加入O.6倍體積的冰浴異丙醇溶液及O.1倍的醋酸鈉溶液，-20°C靜置60分鐘后，4°C，12000 Xg離心10分鐘，棄上清；(8)向步驟(7)得到的沉淀物中加入O.5mL 70%乙醇清洗沉淀物，4°C，12000Xg離心 5分鐘，棄上清，此步驟重復一次；(9)步驟(8)得到的沉淀物自然風干，加入20yL無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保存待用。
2.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述的嬰幼兒唾液樣品為5歲以下兒童的唾液、淚液、鼻涕。
3.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(I)中所述的DNA提取緩沖溶液，溶劑為50mM的Tris-HCl pH7. 4，配方中各溶劑組分中濃度為0. 5mM的EDTA、50mM的NaCl。
4.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述的裂解液，溶劑為50mM Tris-HCl pH7.4，配方中各溶質組分濃度為50mM Tris-HCl pH7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Triton χ-100,1% Sodium deoxycholate, 0.1 % SDS,蛋白酶 K20mg/mL。
5.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述的RNA酶的水溶液中，RNA酶的濃度為10mg/mL。
6.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述的苯酚-氯仿混合溶液中，苯酚和氯仿的體積比為 I I0
7.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(5)中，所述的苯酚-氯仿-異戊醇混合溶液中，苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 : 24 :1。
8.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(6)中，所述的苯氯仿-異戊醇混合溶液中，苯氯仿和異戊醇的體積比為1:1。
9.根據權利要求1所述的一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟(7)中，所述的醋酸鈉的水溶液中，醋酸鈉的濃度為3mol/L。
全文摘要
本發明是一種適用于全基因組測序的嬰幼兒唾液內基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括預處理、裂解、純化、沉淀、洗滌、溶解，本發明方法操作安全、簡便、高通量、成本低，對人體無傷害、無痛苦。提取的基因組DNA純度高，含量高，片段在23kb以上，完全滿足全基因組測序文庫構建及一般分子生物學實驗操作的要求。
文檔編號C12N15/10GK103045586SQ201310018128
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者石松傳, 鮑勇剛 申請人:趙樹民, 于利