來自雞卡氏桿菌的細胞溶解性rtx-毒素的制作方法
專利名稱：來自雞卡氏桿菌的細胞溶解性rtx-毒素的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物健康領域且特別是由卡氏桿菌屬(Gallibacterium spp),包括雞卡氏桿菌(Gallibacterium anatis)、卡氏桿菌基因種 I (Gallibacterium genomospeciesI)和卡氏桿菌基因種2 (Gallibacterium genomospecies 2)所引起的新細菌性家禽疾病的病原體。本發明提供來自卡氏桿菌(Gallibacterium)物種的新型RTX毒素，將該新型毒素稱為GtxA (卡氏桿菌毒素)。此外，本發明提供GtxA的氨基酸及核苷酸序列，包含失活的類毒素或類毒素片段的疫苗，以及免疫禽類來預防該疾病的方法及診斷禽類的雞卡氏桿菌感染的方法。
背景技術：
在過去十年間，在所有主要的家禽生產國中提高生產率的密集型家禽飼養法造成了疾病表現的增加。這引起了對于控制這些疾病的新型及較佳疫苗及疫苗接種計劃的需求增加。如今，已對多種動物進行了針對大量病毒及細菌源性疾病的免疫。家禽病毒性疾病的例子如雞新城疫(Newcastle Disease)、傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis) >禽肺炎病毒(Avian Pneumovirus)、禽痘(Fowlpox)、傳染性法氏囊病(Infectious BursalDisease)等。細菌性疾病的例子如由副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum)(上呼吸道)、禽波氏桿菌(Bordetella avium)(上呼吸道)、鼻氣管鳥桿菌(Omithobacteriumrhinotracheale)(下呼吸道)所引起的禽鼻炎(Avian Coryza),沙門氏菌感染(Salmonella infections)(消化道)，雞霍亂(fowl cholera)(敗血癥)的病原體多殺性巴斯德菌，(Pasteurella multocida)以及大腸桿菌(E. coli)感染。產蛋家禽生殖器官及腹膜的炎癥是商業產蛋家禽群體中經常發生的問題，引起產蛋量下降、死亡率增加以及隨之而來的經濟損失及動物福利下降。常常從這些病變中分離出禽病原性大腸桿菌，但若干研究已表明，雞卡氏桿菌單獨或作為共病原體是卵巢炎、輸卵管炎及腹膜炎的常見原因。此外，已從禽敗血癥、肝炎、腸炎及上呼吸道病變病例中分離出雞卡氏桿菌(G. anatis)。雞卡氏桿菌是產蛋母雞及其他禽類物種的上呼吸道與下生殖道正常菌群的常見部分(Bojesen A. M. , Nielsen S. S. , Bisgaard M. , Prevalence andtransmission of haemolytic Gallibacterium species in chicken production systemswith different biosecurity levels, Avian Pathol. (2003) 32 :503-510),且因此可被視為機會性病原體。未深入研究其發病機制，尤其沒有在分子水平上深入研究，而且對雞卡氏桿菌引發疾病能力背后的基因及機制知之甚少。雞卡氏桿菌(G. anatis)分為2個生物變種β -溶血性生物變種溶血型雞卡氏桿菌及非溶血性生物變種雞卡氏桿菌。溶解紅血球的能力是病原性雞卡氏桿菌分離株的主要表型(Christensen H. , Bisgaard Μ.,Bojesen A. M. , Mutters R. , Olsen J. E. , Genetic relationships among avian isolatesclassified as Pasteurella haemolytica, ' Actinobacillus salpingitis ' orPasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen.nov. , comb,nov and description of additional genomospecies within Gallibacterium gen.nov, Int. J. Syst. Evo I. Microbiol. (2003) 53 :275-287)。卡氏桿菌是屬于變形菌(Y -proteobacterial)巴斯德菌科(Pasteurellaceae)的革蘭氏陰性菌屬(Christensen等人，同上)，且巴斯德菌科的各種病原性成員，如引發人類牙周病的伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)，牛運輸熱(bovine shipping fever)的病原體溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)以及豬病原體胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pIeuropneumoniae)產生屬于RTX-毒素(RTX是毒素重復單兀的縮寫)群組的溶血素及白細胞毒素。可以獲得由失活或活減毒細菌組成的雞卡氏桿菌疫苗。然而，這些疫苗不會對該物種分泌的溶血性蛋白質給予保護作用
發明內容
本發明旨在研究雞卡氏桿菌生物變種溶血型(G. anatis biovar haemolytica)與真核細胞的相互作用，以及識別與表征負責溶血性表型的基因和蛋白質。發明人發現雞卡氏桿菌對禽類巨噬細胞具有高細胞毒性，這很可能是在發病機制中起關鍵作用的性狀。此夕卜，發明人識別及表征了一種負責雞卡氏桿菌生物變種溶血型的白血球毒性及溶血活性的新型RTX-毒素。本發明涉及來自卡氏桿菌(Gallibacterium)屬，最優選為選自由雞卡氏桿菌(Gallibacterium anati)、卡氏桿菌基因種 I (Gallibacterium genomospecies I)及卡氏桿菌基因組2 (Gallibacterium genomospecies 2)構成的組的細菌的GtxA多肽及多核苷酸。在第一方面，本發明涉及分離的多肽，該多肽包含以下群組中的氨基酸序列a) SEQ ID No. I、2 或 3 ;b)選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。具有如SEQ ID NO I所示氨基酸序列的多肽是來自雞卡氏桿菌的RTX毒素。將這由2026個氨基酸(aa)組成的蛋白質稱為GtxA (卡氏桿菌毒素)。這是典型的成孔RTX-毒素尺寸的2倍。GtxA的C-末端IOOOaa與巴斯德桿菌科(Pasteurelleceae)的其他成員的RTX-毒素同源,例如與胸膜肺炎放線桿菌(A. pleuropneumoniae) ApxIA具有38%的序列相似性。與此相反，N-末端約950aa在GenBank數據庫中沒有顯著匹配物,但含有11個未知功能的57-aa重復單元。GtxA毒素具有多種效用，包括但不限于作為類毒素疫苗的用途，以及用于揭示通常在禽類中且尤其在家禽中針對雞卡氏桿菌的已存在的免疫反應的診斷用途。在又一方面，本發明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含選自以下群組中的核酸序列
a)SEQ ID No. 4、5 或 6 ;b)選自由SEQ ID No. 4、5和6所構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少60%的序列同一性；c)由a)中的任一者的至少450個連續核苷酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一核酸改變為不同核酸，條件是該序列中不超過90個核酸被如此改變；d)能夠在高嚴格條件下與跟SEQ ID No. 4、5或6互補的多核苷酸雜交的多核苷酸；e)編碼SEQ ID No. I、2或3的多肽的多核苷酸；f)編碼選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體的多核苷酸，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及
g)編碼由SEQ ID No. 1、2或3中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段的多核苷酸，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。此外，本發明涉及包含本發明的多核苷酸的載體。在其他方面，本發明涉及本發明的多肽、本發明的多核苷酸及本發明的載體的醫學用途。優選地，醫學用途是用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。在一方面，本發明涉及本發明的多肽和/或多核苷酸在制備用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷的藥物中的應用。在其他方面，本發明涉及經本發明的載體轉化或轉導的分離的宿主細胞，并涉及能夠生產本發明的感染性病毒粒子的包裝細胞系。此外，本發明涉及抗體，其能夠特異性結合具有選自以下群組中的氨基酸序列的分離的多肽a) SEQ ID No. I、2 或 3 ;b)選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。這些針對GtxA的抗體可用于診斷及治療方面。在其他方面，本發明涉及失活本發明的分離的多肽的方法。此外，本發明涉及疫苗組合物，其包含本發明的分離的多肽或以裸DNA或載體制備的分離的多核苷酸，可選地連同一種或多種合適的佐劑、賦形劑、乳化劑或介載體。在另一方面，本發明涉及將本發明的疫苗施與本文所述的禽類物種的方法，其中所述疫苗是通過肌肉內或皮下注射，透過例如食物或水口服，氣霧劑，在例如足或翼部劃痕，滴眼劑或經胚給藥(in-ovo administration)來施用。在其他方面，本發明涉及本發明的多肽或多核苷酸在作為診斷標記的用途。本發明也提供了診斷禽類物種中病原性細菌卡氏桿菌(Gallibacterium)感染的方法，所述方法包含檢測本發明的多肽，檢測針對該多肽的抗體，或檢測本發明的多核苷酸。優選地，病原性細菌來自卡氏桿菌屬，更優選地選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組。本發明也提供了檢測本發明的多肽存在的試劑盒，試劑盒包含至少一種能夠結合該多肽的結合蛋白，所述結合蛋白與固體支持物連接。優選地，所述結合蛋白是抗體。在一方面，本發明涉及檢測針對本發明的多肽的抗體的試劑盒，其中所述試劑盒包含已固定到固體表面的所述多肽。
圖I :雞卡氏桿菌培養物上清液的溶血活性以及GtxA的表達。A.雞卡氏桿菌12656-12的生長以及無細胞培養物上清液的溶血活性。將過夜培 養物按I : 100稀釋并，且記錄其生長(在600nm吸光度測量細胞密度)及無細胞培養物上清液的溶血活性。顯示了在BHI中按100倍稀釋的上清液的溶血活性。平行收獲細胞外蛋白質用于蛋白質印跡法(圖5B)。實驗重復三次，溶血活性的水平有所變化，但相對模式一致。B.用Apxl-抗血清蛋白質印跡法測定GtxA的水平。在印跡法之前,于指定時間點收獲上清液，并如材料與方法中所述濃縮100倍，且通過3% -8%凝膠進行SDS-PAGE分離。在OD6qq = 2時收獲來自Δ gtxA的細胞外蛋白質(標記Δ gtxA的泳道)。WC =來自野生型的全細胞裂解物，接種后5小時收獲細胞。尺寸標記物指示在左側。重復實驗，結果相同。圖2 :雞卡氏桿菌12656-12野生型(wt)與同基因的gtxA突變(AgtxA)的溶血活性及細胞毒性。A. β -溶血。將細菌劃線接種于含5%牛血的BHI-瓊脂培養板上，并在37°C培養18小時。B.與生理鹽水(空白對照)、wt或AgtxA共培養I小時后的HDll細胞光學顯微鏡檢測結果(100倍放大)。在指數生長晚期(0D_ = I)收獲細菌，并以10. C感染量(m. o. i)添加。以LDH活性量化細胞毒性。將HDll細胞用如IB所述的細菌培養。顯示了三個重復孔的平均值，柱條表不標準誤差(S. E)。圖3A.雞卡氏桿菌12656-12中的gtxA、gtxC及其側翼基因的基因構造。箭頭指示開放讀碼框。在gtxC下游指示出預測的轉錄終止子。B. GtxA的構造。K指示保守的賴氨酸殘基(Lysl484和Lysl607)。標記了富含甘氨酸、天冬氨酸的區域(位置1640-1830)。C. GtxA N-末端域的15個重復單元的比對，以Radar法[Heger A. , Holm L,Rapid automatic detection and alignment of repeats in protein sequences，Proteins (2000) 41 :224-237]來生成比對結果。右邊數字指示GtxA中的氨基酸位置。標記了重復單元中50%以上氨基酸相同(黑色)或相似(灰色)的位置。圖4 :表達GtxA的大腸桿菌的細胞毒素活性。A.在30°C培養的生長于含5%牛血和0. ImM IPTG的LB-瓊脂中的大腸桿菌ER2566的β -溶血活性。TlSS :+或-指示了表達大腸桿菌的TlSS-組分HlyB和HlyD的質粒pLG575存在與否。RTX = GtxA的第931-2026位氨基酸，N-端=GtxA的第1-949位
氨基酸。B.使用表達不同形式的GtxA的大腸桿菌ER2566/pLG575的液體溶血檢測和LDH
細胞毒性檢測。圖5 :大腸桿菌中GtxA的表達。對來自IPTG誘導后的大腸桿菌ER2566的全細胞裂解物(WC)和細胞外蛋白質(EC)進行蛋白質印跡分析。以4-12%凝膠中進行SDS-PAGE來分離蛋白，并在PVDF-膜上形成印跡。用ApxI-抗血清探測印跡。B =空白，尺寸標記物指示在右側(PageRulerPrestained Protein Ladder Plus (Fermentas))。各泳道中的上部條帶具有預期大小的全長GtxA(215kDa)或RTX-域(117kDa)。尺寸較小的條帶很可能是降解產物。
圖6 :來自不同卡氏桿菌菌株的氨基酸序列比對。將GtxA(SEQ ID No I)的第1133-1515位氨基酸與源自其他卡氏桿菌菌株的其他毒素的氨基酸序列進行比對。點指示相同殘基，而突出顯示部分為非保守位置。圖7在OD6tltl = 0.6時收獲來自不同雞卡氏桿菌菌株以及卡氏桿菌基因種1(G.genomospecies I) (CCM5974)及卡氏桿菌基因種2 (CCM5976)的模式菌株的培養物上清液，并過濾除菌。如方法中所述使細胞外蛋白質沉淀，并用3-8% Tris-乙酸鹽SDS-凝膠進行分離，在PVDF膜上形成印跡,并用ApxIA-抗血清探測。箭頭標出GtxA(215kDa)。較大條帶為與GtxA無關的未識別蛋白質(參見圖3)或GtxA的修飾形式。M=分子尺寸標記物(Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Fermentas))，尺寸指不在右側(kDa)。圖8 =TlSS-突變體中的GtxA的β -溶血活性及亞細胞定位。Α.雞卡氏桿菌12656-12及同基因突變體的β -溶血。在37 °C培養經12656-12 (wt)、gtxA-和gtxBD突變體劃線接種的血瓊脂培養板24小時后的照片。已從劃線的左側部分移除細菌以顯露菌落下的溶血。B. GtxA的亞細胞定位。在向生長穩定期轉變時(OD600 = I. 7)收獲細胞及上清液。如方法中所述使細胞外蛋白質沉淀。用3-8% Tris-乙酸鹽SDS-凝膠分離全細胞裂解物(沉淀)和細胞外蛋白質(上清液)，并在PVDF膜上形成印跡，且用ApxIA-抗血清探測。箭頭標出GtxA。通過質譜分析確認同一性。抗血清另外識別了野生型及突變型菌株中皆存在的約270kDa的未識別蛋白質。尺寸標記物指示在左邊(Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Fermentas))。圖9 :雞卡氏桿菌12656-12中的gtxAC及gtxEBD基因座的構造。箭頭表示開放讀碼框(ORF)。用小箭頭在各ORF上方指出用于檢測gtxA及gtxEBD的引物對的位置。為了比較，還包括了典型RTX-毒素基因座的構造(Frey & Kuhnert2002)。定義本文所用術語“佐劑”是指與所施用的免疫原性決定簇/抗原/核酸構建體混合可增強或者改良對所述決定簇的免疫反應的物質。本文所用術語“等位基因變體”是指編碼SEQ ID No. I的基因的替代形式。等位基因可由核酸序列中的至少一個突變產生，且可產生其結構或功能可能有改變或無改變的改變的mRNA或多肽。產生等位基因的常見突變變化一般歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。這類變化各自可在既定序列中單獨或與其他變化組合出現一次或多次。本文所用術語“抗體”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的活性部分。抗體是例如完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫活性的片段。本文所用術語“抗原”是指可以結合到呈無性繁殖分布的免疫受體(T-細胞或B-細胞受體)的物質；通常為肽、多肽或多聚多肽。抗原優選為能夠誘發免疫反應。本文所用術語“結合檢測”是指任何兩個或更多分子以共價或非共價形式彼此結合，從而能測量該分子之一的濃度的任何生物或化學檢測。本文所用的術語“生物樣本”是指選自由血清、血漿、全血、唾液、尿、淋巴、活檢組織、精液、糞便、眼淚、汗液、乳汁、腦脊髓液、腹水、滑液構成的組的任何樣本，但不限于此。本文所用術語“載體”是指與抗原耦合而有助于誘發免疫反應的實體或化合物。
種共有化學和/或物理特性的氨基酸取代的取代。氨基酸可根據共有特性分組。保守氨基酸取代是將既定氨基酸組內的一個氨基酸用同一組內的另一個氨基酸取代，其中既定組內的氨基酸展現相似或實質上相似的特性。本文所用術語“檢測部分”是指一分子的能夠結合并檢測另一分子的特定部分，分子優選但不限于蛋白質。本文所用術語“診斷標記”是指一化合物，例如蛋白質，可以用于確定個體罹患何種失調的特征。本文所用術語“失調”是指疾病或醫學問題，并為生物體中與特定癥狀及體征相關且損害身體機能的異常情況。這可能由外部因素，如侵入生物體引起，或者可能由內部機能失調引起。本文所用術語“片段”是指核酸或多肽的非全長部分。因此，片段本身亦分別為核酸或多肽。本文所用術語“免疫原性”是指特定物質，如抗原或抗原表位激發免疫反應的能力，其中所述免疫反應可為細胞免疫反應或體液免疫反應。本文所用術語“藥物”是指醫藥藥物，也稱為藥品或藥劑，可將其寬泛地定義為任何旨在用于預防性、治療性、改善性或癥狀性用途的化學物質，優選為疫苗。根據上文應該了解，本發明的期望用途并非必定包含100%預防、治療或改善任何疾病，而是也包含部分預防、治療或改善。本文所用術語“致病性”是指病原體，如微生物，如雞卡氏桿菌(Gallibacteriumanatis)在生物體中產生傳染性疾病的能力。本文所用術語“質粒”是指從染色體DNA分離的能夠不依賴于染色體DNA進行復制的染色體外DNA分子。本文所用術語“多核苷酸”是指由以鏈形式共價鍵結合的核苷酸單體，例如DNA(脫氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)組成的有機聚合物分子。本文所用術語“多肽”是指也稱為蛋白質的有機化合物，其為具有至少兩個且優選具有兩個以上氨基酸的肽。通用術語氨基酸包含天然及非天然氨基酸，它們皆可呈“D”或“L”異構形式。本文所用術語“預防性治療”是指目的在于預防而非治療或治愈疾病的任何醫學方法。術語預防不意為絕對的，而是也包括部分預防疾病或疾病的一個或多個癥狀。本文所用術語“啟動子”是指在DNA鏈中與RNA聚合酶結合而啟動通過一個或多個臨近結構基因進行的信使RNA轉錄的結合位點。本文所用術語“RTX毒素”(結構毒素重復單元)是指由大量病原性革蘭氏陰性細菌產生的成孔蛋白質毒素。本文所用術語“序列同一性”是指兩個序列之間的同一性百分比的測定，并可以使用數學算法來獲得。一個用于比較兩個序列的數學算法的優選的、非限制性實例為Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268 的算法，改良為 Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877 的算法。這種算法并入到了Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 的 BLASTN 和 BLASTP 程序中。 為了表征同一性，比對目標序列以便獲得最高水平的同源性(匹配度)。基于這些一般原理，兩個核酸序列的“同一'I"生百分比”可采用BLASTN算法[Tatiana A. Tatusova,Thomas L. Madden Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences ；FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250],可從 NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)網頁(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)獲得，并使用此處建議的默認設置(即，匹配的加分=I ;錯配的罰分=-2 ;鏈選項=雙鏈；空位開放=5 ;延伸空位=2 ;罰分空位X dropoff = 50 ;預期值=10 ;序列長度=11 ;過濾器開啟)來確定。BLASTN算法確定兩個所比對的核苷酸序列重疊范圍內的序列同一性百分t匕。由于Blast是局部比對，所以最適用于計算長度不同的兩個相關序列之間重疊范圍內的序列同一性百分比。用于比較序列的數學算法的另一優選的、非限制性實例為CLUSTAL ff(l. 7)比對算法(Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994)CLUSTAL Wimprovingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. NucleicAcids Research，22 :4673-4680.)。CLUSTAL W 可以用于多序列比對，優選使用 BLOSUM 62作為計分矩陣。當計算序列同一性時，CLUSTAL W包括由比對參照序列的長度所產生的任何空位。序列同一性是由將匹配數目除以具有空位的比對序列的長度來計算。本文所用術語“信號肽”是指決定蛋白質在細胞中的最終位置的氨基酸短序列，也稱為分選肽。本文所用術語“毒素”是指由活細胞或生物體產生的能夠在與身體組織接觸或由身體組織吸收時引起疾病的有毒物質。本文所用術語“類毒素”是指毒性已經化學或熱處理而被減弱或抑制但保持其他特性，例如免疫原性的細菌毒素(通常為外毒素)。本文所用術語“轉錄因子”是指結合至特定DNA序列并從而控制遺傳信息從DNA向mRNA傳遞的蛋白質。本文所用術語“疫苗”是指能夠在動物體內誘發免疫反應的物質或組分。免疫反應是指在生物體內誘生記憶，產生傳染因子，遇到繼發反應而非初次反應，從而降低其對宿主生物體的影響的免疫反應(體液的/抗體的和/或細胞的)。本文所用術語“載體”是指作為運載工具將外來遺傳物質轉移至另一細胞中的DNA分子。
具體實施例方式本發明的主要目的在于提供疫苗組合物，其包含來自雞卡氏桿菌(Gallibacterium anati)的特定RTX毒素，GtxA或其免疫原性變異體或片段，用作治療和/或預防性治療禽類的由卡氏桿菌(Gallibacterium)屬細菌感染引起的任何疾病的藥物。雞卡氏桿菌是雞及其他禽類物種上呼吸道與下生殖道中的正常菌群的一部分。然而，雞卡氏桿菌也已從病理性病變中分離出來并因此將其認為是潛在病原體。本發明提供一種新型毒性因子；即具有非典型構造及廣泛靶細胞范圍的雞卡氏桿菌RTX-毒素。來自雞卡氏桿菌培養物的無細胞且經濾除菌的上清液溶解有紅血球及源自禽類的巨卩遼細胞樣細胞(HDll),這表明產生了一種或多種外毒素。在雞卡氏桿菌12656-12的基因組序列中，鑒定出RTX-毒素基因。所編碼的蛋白質，稱為GtxA(卡氏桿菌毒素)，由 2026個氨基酸(aa)組成。這是典型成孔RTX-毒素尺寸的2倍。GtxA的C-末端1000個aa與巴斯德桿菌科(Pasteurelleceae)其他成員的RTX-毒素同源,例如與胸膜肺炎放線桿菌(A. pleuropneumoniae)ApxIA具有38%序列相似性。與此相反，N-末端約950個aa在GenBank數據庫中沒有顯著匹配物,但含有11個未知功能的57_aa重復單元。表達gtxA及其乙酰轉移酶激活子gtxC的大腸桿菌(E.coli)變得具有溶血性和白血球毒性。研究了 GtxA的各種截短形式的功能。C-末端RTX-域所展現的溶血活性低于完整毒素，這表明N-末端域并非必需的，而是最大溶血活性所需。僅用C-末端未檢測出對HDll細胞的細胞毒性，這表明新型N-末端重復單元域是對白血球的細胞毒性效應所必需的。用蛋白印跡法(western blotting)和northern印跡法研究雞卡氏桿菌中gtxA的表達。在細胞外蛋白質部分中以生長期依賴性方式檢測到GtxA，但未在細胞相關的蛋白質部分中檢測到GtxA，這與預測的毒素分泌相符。針對gtxA的存在及表達、GtxA分泌水平以及培養物上清液的裂解活性，研究了 11種不同基因型及表型的卡氏桿菌菌株。gtxA分布廣泛且可見于所測試的所有菌株中，包括卡氏桿菌基因種(Gallibacterium genomospecies) I和2 (圖6,比對)。菌株間的表達情況實質上不同，且無毒性非溶血型菌株F149T表達量微小。上清液中的GtxA水平與對HDll細胞的溶血活性及細胞毒性活性的水平在某種程度上相關。預期GtxA顯著促成了雞卡氏桿菌的致病性。GtxA先前未有描述，GtxA是分子量為215kDa且具有SEQ ID No. I序列的2026個氨基酸的大多肽。它可分為C-末端片段及N-末端片段。示例性C-末端片段由1077個氨基酸(SEQ ID No. 2)組成，類似特征為6個串聯重復九肽的典型RTX毒素。示例性N-末端由949個氨基酸(SEQ ID No. 3)組成，其相對疏水且與GenBank中的其他RTX毒素或其他蛋白質幾乎不共有序列相似性。毒素活性依賴于激活子，GtxC，其促進GtxA的脂肪酸酰化，S卩，毒性依賴于多肽的轉錄后酰化。未酰化的蛋白質不具有毒性。GtxA展現了細胞溶解表型，主要是溶血性及白血球毒性。C-末端RTX-域所展現的溶血活性低于完整毒素，這表明N-末端域并非必需的，而是最大溶血活性所需。僅用C-末端未檢測出對源自禽類的巨噬細胞樣HDll細胞的細胞毒性，這表明新型N-末端重復單元域是對白血球的細胞毒性效應所必需的。篩選來自不同地理區域(Denmark、Czech Republic和Mexico)的卡氏桿菌菌株的gtxA基因的存在，在所測試的所有菌株中皆發現有該基因，但個別菌株之間表達情況存在實質性差異。這差異似乎與地理起源無關。雞卡氏桿菌是雞、產蛋母雞及其他禽類物種上呼吸道與下生殖道中的正常菌群的一部分。然而，雞卡氏桿菌也已從禽類病理性病變中分離出來，且相信雞卡氏桿菌對家禽的發病機制發揮了重要作用。因此，本發明的目的在于提供源自GtxA蛋白質或其免疫活性多肽變異體的類毒素疫苗，用作治療和/或預防疾病的藥物。所述疾病可能由恒溫動物的細菌感染引起，且本發明的另一目的在于預防或治療所述疾病。本發明的另一方面涉及用于治療和/或預防疾病的編碼GtxA蛋白質的多核苷酸或編碼免疫活性多肽變異體的多核苷酸。如由圖6中的部分氨基酸序列的比對所證明，GtxA多肽在不同雞卡氏桿菌分離株 間高度保守。因此，預期包含GtxA類毒素的疫苗組合物可對大量不同的雞卡氏桿菌分離株，甚至對卡氏桿菌屬的相關種類有效。細菌物種本發明涉及多肽、多核苷酸及帶有多核苷酸的表達載體。在一個實施方式中，多核苷酸及多肽源自雞卡氏桿菌。此外，本發明也涵蓋來自巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae),優選來自卡氏桿菌(Gallibacterium)屬，最優選來自由雞卡氏桿菌(Gallibacteriumanatis)、卡氏桿菌基因種I (Gallibacterium genomospecies I)和卡氏桿菌基因種2 (Gallibacterium genomospecies 2)構成的組的細菌的多肽及和多核苷酸。已經證實GtxA與其他RTX毒素廣泛不同。通過本文所提供的分子工具，發明人已使得克隆或探測來自卡氏桿菌屬的其他GtxA樣毒素成為可能。預期這些來自相關物種的GtxA樣毒素與SEQ ID NO 1、2或3展現某種程度的序列同源性，且可預期編碼序列與基于本發明的多核苷酸的探針雜交。遺傳修飾的菌株如實施例2中所述，本發明的發明人已生產了雞卡氏桿菌gtxA突變型菌株。將該菌株命名為AgtxA。實施例7中描述了關于這種雞卡氏桿菌AgtxA突變體的感染實驗，其中感染野生型微生物的禽類一般顯現涉及生殖道及腹膜的彌散性及化膿性炎癥，這與在野外從雞卡氏桿菌自然感染所觀測到的病變相當。另一方面，感染AgtxA突變體的禽類一般顯現位于卵巢的較輕度炎癥。因此，研究已表明在雞中gtxA實質上促成了雞卡氏桿菌的發病機制。由此可斷定，本發明的發明人已證實上文所定義的AgtxA菌株可以用于免疫生物體。這些免疫的生物體,例如禽類物種，因此可以經由對例如特定病原性微生物表面上的非gtxA抗原產生的抗體而對表達gtxA的野生型微生物產生免疫性，特定病原性微生物的種類與gtxA表達和/或分泌已經消除的微生物的種類相同。因此，在一個方面，本發明涉及轉基因敲除的微生物，其中內源gtxA基因已被破壞從而消除了功能性gtxA多肽的表達，且其中所述微生物所展現的致病性相對于非轉基因的對照微生物而言有所降低。在一個實施方式中，微生物是雞卡氏桿菌。在另一實施方式中，轉基因微生物不具有抗生素抗性。
GtxA 多狀一種野生型GtxA，即天然存在的非突變型蛋白質，以SEQ ID No. I標示。在一方面，本發明涉及分離的多肽，所述多肽包含選自以下群組中的氨基酸序列a)SEQ ID No. 1、2 或 3 ;b)選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是該序列中不超過30個氨基酸被改變。其他野生型GtxA多肽可從其他卡氏桿菌以及其他雞卡氏桿菌分離株中分離出 來。如圖6中的片段比對所示，預期這些GtxA與SEQ ID NO I、2和/或3享有高度序列同一性。在優選的實施方式中，本發明涉及SEQ ID No. I及GtxA序列變異體，該GtxA序列變異體包含與SEQ ID No. I至少70%的序列同一性，更優選為包含與GtxA序列75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性,例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性，例如至少99. 5%的序列同一性，諸如至少99. 9%的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及GtxA多肽的C-末端域，其以SEQ ID No. 2定義，并涉及序列變異體，該序列變異體包含與SEQ ID No. 2至少70%的序列同一性，更優選為包含與GtxA序列的C-末端域75 %的序列同一性，例如至少80 %的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及GtxA多肽的N-末端域，其以SEQ ID No. 3定義，并涉及序列變異體，該序列變異體包含與SEQ ID No. 3至少70%的序列同一性，更優選為包含與GtxA序列的N-末端域75 %的序列同一性，例如至少80 %的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。除全長GtxA之外，本發明還涉及GtxA的片段，例如C-末端GtxA域以及涉及N-末端GtxA域。此外，本發明涉及這些多肽的片段。在優選的實施方式中，所述片段由至少150個連續氨基酸組成，優選為至少200個氨基酸，更優選為至少300個氨基酸，更優選為至少500個氨基酸，更優選為至少750個氨基酸，更優選為至少1000個氨基酸，更優選為1250個氨基酸，更優選為至少1500個氨基酸，更優選為至少1750個氨基酸，更優選為至少2000個氨基酸。GtxA片段可與野生型GtxA序列在一個或多個位置上不同。在優選的實施方式中，所述片段可含有至多30個氨基酸取代，更優選至多25個取代，更優選至多20個取代，更優選至多15個取代，更優選至多10個取代，更優選至多5個取代，諸如4、3、2或I個取代。
本發明所涵蓋的其他變異體是指SEQ ID No. 1、2和3的多肽的變異體，其中發生了保守氨基酸取代。在優選的實施方式中，本發明涉及包含SEQ ID No. 1、2或3的任何多肽，其中多肽序列中的任何氨基酸已經由另一氨基酸保守取代。在另一優選的實施方式中，所述序列變異體及片段具免疫原性。在再一優選的實施方式中，所述序列變異體及片段保留生物活性，諸如毒性，其中所述毒性包含在接受體的細胞膜中形成孔，例如細胞毒性，諸如細胞溶解性細胞毒性，例如溶血性細胞毒性。本發明也涉及SEQ ID No. 1、2和3的多肽，其中所述多肽為了去除諸如毒性的生物活性，而經特別修飾，但保留諸如免疫原性的活性。因此，在優選的實施方式中，SEQ ID No. 1、2和3的多肽已優選通過熱或輻射，更優選通過以非酰化形式表達，更優選通過暴露于諸如甲醛的化學物質，而失活。在另一優選的實施方式中，本發明涉及包含SEQ ID No. 1、2或3的任何多肽，其中信號肽已被異源信號肽替代。出于純化的目的，可標記本發明。在優選的實施方式中，SEQ ID No. 1、2和3可用 標簽，例如C-myc標簽,諸如HSV標簽,例如V5標簽,諸如麥芽糖結合蛋白標簽，例如纖維素結合域標簽，諸如BCCP標簽，例如鈣調蛋白標簽，諸如Nus標簽，例如谷胱甘肽-S-轉移酶標簽，諸如綠色突光蛋白標簽，例如硫氧還蛋白標簽，諸如S標簽,例如Strep標簽。優選地，標簽位于蛋白質的C-末端部分，諸如位于C-端最末端處。更優選地，通過在標簽與RTX多肽之間插入蛋白酶位點，可從GtxA多肽上切割標簽。GtxA多核苷酸本發明提供SEQ ID No. 4、5和6的特定多核苷酸序列。本發明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下群組中的核酸序列a)SEQ ID No. 4、5 或 6 ;b)選自由SEQ ID No. 4、5和6所構成的組的多核苷酸的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少60%的序列同一性；c)由a)中的任一者的至少450個連續核苷酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一核苷酸改變為不同核苷酸，限制條件是該序列中不超過90個核苷酸被如此改變；d)能夠在高嚴格條件下與跟SEQ ID No. 4、5或6互補的多核苷酸雜交的多核苷酸；e)編碼SEQ ID No. I、2或3的多肽的多核苷酸；f)編碼選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體的多核苷酸，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及g)編碼由SEQ ID No. 1、2或3中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段的多核苷酸，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。適用于測定核苷酸探針與同源DNA或RNA序列間雜交的實驗條件涉及將含有待雜交的DNA片段或RNA的過濾膜預浸泡于5 X SSC[氯化鈉/檸檬酸鈉；參見Sambrook etal. ；Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab. ,Cold SpringHarbor, NY 1989]中 10 分鐘，且在 5XSSC、5XDenhardt 溶液[參見 Sambrook 等人；同上]、0. 5% SDS和ΙΟΟμ g/ml變性的經超聲處理的鮭魚精子DNA[參見Sambrook等人；同上]的溶液中將過濾膜預雜交，繼而在大約45°C下于含有濃度為10ng/ml的隨機引物的[Feinberg A P & Vogelstein B ；Anal. Biochem. 1983 132 6-13]經 32P_dCTP 標記(比活性> lXKWcpm/yg)的探針的相同溶液中雜交12小時。隨后在至少60°C (中嚴格條件)，優選至少65°C (中/高嚴格條件)，更優選在至少70°C (高嚴格條件)，且甚至更優選在至少75°C (極高嚴格條件)的溫度下，于O. I X SSC、0. 5% SDS中洗滌過濾膜兩次，持續30分鐘。可使用X-射線薄膜來檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。在一個實施方式中，核酸分子與選自由SEQ ID No. 4、5和6構成的組的核酸序列的差別單個核苷酸。單取代可為沉默突變或可產生保守氨基酸取代。單取代或缺失也可產生移碼突變。在更優選的實施方式中，本發明涉及與SEQ ID No. 4的多核苷酸具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列，更優選為與SEQ ID No. 4至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95 %，更優選為至少96 %，更優選為至少97 %，更優選為至少98 %，更優選為至少99 %的序列同一性。
在另一優選的實施方式中，本發明涉及與SEQ ID No. 5的多核苷酸具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列，更優選為與SEQ ID No. 5至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95 %，更優選為至少96 %，更優選為至少97 %，更優選為至少98 %，更優選為至少99 %的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及與SEQ ID No. 6的多核苷酸具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列，更優選為與SEQ ID No. 6至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95 %，更優選為至少96 %，更優選為至少97 %，更優選為至少98 %，更優選為至少99 %的序列同一性。本發明也涉及SEQ ID No. 1、2和3的多核苷酸的片段，在優選的實施方式中，該片段由至少450個連續核苷酸組成，更優選由至少500個連續核苷酸，更優選由至少600個連續核苷酸，更優選由至少750個連續核苷酸，更優選由至少1000個連續核苷酸，更優選由至少1500個連續核苷酸，更優選由至少2000個連續核苷酸，更優選由至少2500個連續核苷酸，更優選由至少3000個連續核苷酸，更優選由至少3500個連續核苷酸，更優選由至少4000個連續核苷酸，更優選由至少4500個連續核苷酸，更優選由至少5000個連續核苷酸，更優選由至少5500個連續核苷酸，更優選由至少6000個連續核苷酸組成。多核苷酸片段可在一個或多個位置上不同于該片段所源自的野生型GtxA多核苷酸序列。在優選的實施方式中，該片段可含有至多90個核苷酸取代，更優選至多80個取代，更優選至多70個取代，更優選至多60個取代，更優選至多50個取代，更優選至多40個取代，更優選至多30個取代，更優選至多20個取代，更優選至多10個取代，更優選至多5個取代，諸如4、3、2或I個取代。本發明涉及能夠與具有SEQ ID No. 4、5和6的序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，優選在高嚴格雜交條件下進行。本發明的多核苷酸可包含天然存在的等位的核酸變異體的核苷酸序列。
本發明的多核苷酸也可包含SEQ ID No. 4、5和6的變異體，其中單獨多核苷酸已被優化以在大腸桿菌中表達。表汰載體本發明的多核苷酸可包含在任何合適載體中，諸如表達載體或克隆載體。有多種載體可用，且可選擇適合于特定目的的任何載體。可通過多種方法將適當的核酸序列插入載體中，例如，可采用本領域熟知的技術將DNA插入適當的限制性酶切位點處。除與本發明有關的核酸序列之外，載體還可進一步包含信號序列，復制起始位點，一個或多個標記基因，增強子元件，啟動子以及轉錄終止序列中的一種或多種。載體也可包含其他序列，諸如增強子、聚腺苷酸(poly-Α)尾、接頭、多接頭、可操作接頭、多克隆位點(MCS)、終止密碼子、內部核糖體進入位點(IRES)以及用于整合的宿主同源序列或其他限定的元件。載體優選為表達載體，包含有效連接到調控核酸序列的核酸，調控核酸序列引導該核酸在合適細胞中表達。
在優選的實施方式中，本發明的載體為質粒載體，諸如真核質粒載體，更優選為原核質粒載體。在另一優選的實施方式中，載體也可為病毒載體，優選為源自逆轉錄病毒科(Retroviridae)，諸如慢病毒，例如HIV，諸如SIV，例如EAIV，諸如CIV0在又一優選的實施方式中，載體可選自，但不限于，包含α病毒、腺病毒、腺相關病毒、桿狀病毒、HSV、冠狀病毒、牛乳頭瘤病毒、Mo-MLV的群組，優選為腺相關病毒。在另一優選實施方式中，本發明的載體包含啟動子，更優選其中所述啟動子優選連接至本發明的多核苷酸。在優選的實施方式中，所述啟動子選自，但不限于，原核啟動子，優選其中原核啟動子包含其他元件，諸如RNA聚合酶結合位點，例如Pribnow盒或其部分,諸如_35元件或其部分。本發明的原核載體可以用于使失活的GtxA在例如大腸桿菌中重組表達。由于大腸桿菌不含有GtxC基因，所以在大腸桿菌中表達的GtxA未經適當酰化且因此無毒性。在另一優選的實施方式中，所述啟動子選自，但不限于，真核啟動子，優選其中的真核啟動子包含其他元件，諸如RNA聚合酶結合位點,例如TATA盒或其部分,諸如至少一個用于任一真核轉錄因子的結合位點。本發明載體的優選實施方式是裸DNA疫苗，其包含有效連接至本發明的多核苷酸的真核啟動子。疫苗一般而言，疫苗是能夠在具有功能性免疫系統的活標本中誘導免疫反應的物質或組合物。組合物可包含以下一種或多種“活性成分”，諸如抗原(例如蛋白質、多肽、肽、核酸及其類似物)、除了其他元件外還包含一種或多種抗原的核酸構建體、細胞、(例如負載APC、繼承性轉移的T細胞)、復合物分子(抗體、TCR及MHC復合物等)、運載體、佐劑以及藥物運載體。本發明涉及疫苗組合物，其包含來自雞卡氏桿菌的本發明的分離的多肽，優選包含多肽的失活形式，或其免疫原性變異體或片段。本文所用術語“疫苗”是指用于誘導針對源自雞卡氏桿菌的特異性免疫目的的獸用醫學疫苗。本發明涉及疫苗組合物，其包含SEQ ID No. 1、2或3的多肽、所述多肽的失活形式、其功能性同系物、具有至少70%的序列同一性的多肽或所述多肽的免疫原性活性片段。將所述疫苗稱為類毒素疫苗。類毒素疫苗是使用喪失毒性但保留免疫原性的毒素激發目標生物體的免疫反應，以使所述目標生物體對將來由源自相同或相似細菌物種的毒素或相似毒素所致的感染具有抵抗力的疫苗。在優選的實施方式中，所述疫苗包含失活的多肽，所述多肽就毒性而言是失活的，但保留免疫原性，其優選通過熱，更優選通過暴露于化學品諸如甲醛，更優選通過表達呈未酰化形式的SEQ ID No. I多肽而失活。在另一優選的實施方式中，疫苗進一步包含失活或活減毒雞卡氏桿菌。在又一優選的實施方式中，本發明進一步涉及至少一種來自對禽類物種具有病原性的病毒或微生物的其他抗原，其中所述病毒或微生物是選自但不限于由傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)、雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)、傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)、雞貧血因子(Chicken Anaemiaagent)、禽類呼腸孤病毒(Avian Reovirus)、禽肺炎病毒(Avian Pneumovirus)、雞痘病毒(Chicken Poxvirus)、禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus)、雞敗血支原體 (Mycoplasma gallisepticum)、副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum)、多殺性巴斯德菌(Pasteurella multocida)和大腸桿菌(Eschericia coli)構成的組。當將諸如毒素的抗原引入宿主生物體中時，通常使用其他組分來增強免疫反應。這些組分通常稱作佐劑。本發明的疫苗組合物優選包含佐劑和/或載體。佐劑是混合在疫苗組合物中增強或以別的方式改良對GtxA多肽或其免疫原性片段的免疫反應的任何物質。運載體是能夠與GtxA多肽或其免疫原性片段締合且有助于呈遞抗原的骨架結構，例如多肽或多糖。因此，在優選的實施方式中，本發明的疫苗組合物包含選自但不限于由弗氏完全佐劑和不完全佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、quil A、礦物油及非礦物油、植物油及聚羰乙烯構成的組中的佐劑和/或運載體。本發明的疫苗組合物可通過若干途徑施用，例如通過肌肉內或皮下注射，透過例如食物或水口服，諸如通過氣霧劑，例如通過例如在足部或翼部劃痕，諸如通過滴眼劑，例如通過卵內投藥來施用。禽類巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae)的大部分成員以共生菌形式在恒溫動物，優選在禽類的粘膜中存活。卡氏桿菌(Gallibacterium)屬的成員包括共生及病原性菌株，其中病原性菌株主要引起禽類宿主呼吸道及生殖道的疾病。在優選的實施方式中，本發明涉及本發明的多肽、本發明的多核苷酸以及本發明的載體，其用于治療恒溫動物，優選為禽類物種諸如鴨屬(Anas)，例如雁屬(Anser)，諸如潛鴨屬(Aythya)，例如麝鴨屬(Biziura),諸如黑雁屬(Branta),例如天鵝屬(Cygnus)，諸如燕尾區鳥屬(Creagrus),例如噪El屬(Gelochelidon),諸如El屬(Larus),例如白||屬(Pagophila),諸如叉尾區鳥屬(Xemaes)，例如鸛科(Ciconiidae)，諸如鴻屬(Columba)，例如地鳩屬(Columbina)，諸如黃鳩屬(Ducula),例如雞鳩屬(Gallicolumba),諸如姬地鳩屬(Geopelia),例如鵓鳩屬(Geotrygon),諸如鳳冠鳩屬(Goura)，例如山鳩屬(Gymnophaps),諸如新西蘭鳩屬(Hemiphaga),例如棕翅鳩屬(Leptotila),諸如巨地鳩屬(Leucosarcia),例如胃$鳩屬(Macropygia),諸如裸臉原鳩屬(Metriopelia),例如冠鳩屬(Ocyphaps),諸如小長尾鳩屬(Oena),例如斑尾鴻屬(Patagioenas),諸如褐果鳩屬(Phapitreron),例如果鳩屬(Ptilinopus),諸如印加地鳩屬(Scardafella),例如斑鳩屬(Streptopelia),諸如綠鳩屬(Treron),例如森鳩屬(Turtur),諸如哀纟鳥屬(Zenaida),例如冠冢雉屬(Aepypodius),諸如叢冢雉(Alectura),例如雉科(Phasianidae),諸如松雞亞科(Tetraoninae),例如鶴鶘科(Pelecanidae),諸如紅鸛科(Phoenicopteridae),例如鳳頭鶴踏科(Cacatuidae),諸如吸蜜鶴踏科(Loriidae),例如鶴踏科(Psittacidae),諸如鴯鹋科(Dromaiidae),例如小美洲能屬(Pterocnemia),諸如大美洲能屬(Rhea),例如能鳥科(Struthionidae)的細菌感染。在更優選的實施方式中，本發明的多肽、本發明的多核苷酸以及本發明的載體可用于治療選自由鴨、火雞和雞，優選產蛋母雞構成的組的禽類物種的細菌感染。技述為了檢測本發明的多肽或其免疫原性片段的存在，產生能夠特異性結合至所述多肽或其免疫原性片段的抗體是有用的。所述抗體可結合至單獨多肽上的任一表位。
在優選的實施方式中，所述抗體可以是源自血清的多克隆抗體或單克隆或重組抗體，其中抗體包含抗體的抗原結合片段諸如Fv、scFv、Fab、Fab’或F (ab) 2,多聚形式諸如二聚IgA分子或五價IgM,親和抗體或雙價抗體。在優選的實施方式中，本發明涉及IgA抗體，最優選為雞IgA抗體。因此，在優選的實施方式中，本發明涉及能夠特異性結合至SEQ ID No. 1、2或3的多肽的抗體。在另一優選的實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含與SEQ ID No. I至少70%的序列同一性的多肽的抗體，更優選與SEQ ID No. I有75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99 %的序列同一性。在又一優選實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含與SEQ ID No. 2至少70%的序列同一性的多肽的抗體，更優選與SEQ ID No. 2有75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性,例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。在另一優選實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含與SEQ ID No. 3至少70%的序列同一性的多肽的抗體，更優選與SEQ ID No. 3有75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性,例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含SEQ ID No. 1、2和3中任一多肽的免疫原性片段的多肽的抗體，該片段由至少150個連續氨基酸組成，優選由至少200個連續氨基酸,更優選由至少300個連續氨基酸,更優選由至少500個連續氨基酸,更優選由至少750個連續氨基酸,更優選由至少1000個連續氨基酸,更優選由至少1250個連續氨基酸，更優選由至少1500個連續氨基酸,更優選由至少1750個連續氨基酸,更優選由至少2000個連續氨基酸組成。
在又一優選的實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含免疫原性片段的多肽的抗體，其中該片段可含有至多30個氨基酸取代，更優選至多25個取代，更優選至多20個取代，更優選至多15個取代，更優選至多10個取代，更優選至多5個取代，諸如4、3、2或I個取代。皿診斷性檢測試劑盒是實施與本發明相關的診斷方法的所有組分的集合。在優選的實施方式中，本發明涉及檢測試劑盒，其中在生物樣本中檢測到由卡氏桿菌屬的細菌物種的存在所引起的細菌感染的指示。所述指示可以是SEQ ID No. 1、2或3中任一多肽或其功能性變異體，或針對任一所述多肽的抗體的存在。在優選的實施方式中，可通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)來檢測所述多肽或抗體的存在。ELISA是用于檢測樣本中蛋白質或任何其他抗原的存在的定量技術。在ELISA中，將未知量的抗原固定至表面，隨后用特異性抗體沖刷表面，以便特異性抗體可結合至抗原。 將此抗體連接至酶，且在最終步驟中，添加用該酶可以使其轉化為某些可檢測信號的物質。存在有如下幾種類型的ELISA 間接ELISA夾心ELISA競爭ELISA反向ELISA其他基于免疫的分析法也可用于檢測樣本中的所述多肽或抗體，諸如化學發光免疫檢測及解離增強鑭系免疫分析法。本發明進一步涉及診斷檢測試劑盒，其用于檢測本發明的任一多核苷酸或對雞卡氏桿菌GtxA具有特異性的其他特定DNA或RNA序列的存在。因此，在優選的實施方式中，本發明涉及用于檢測所述多核苷酸的聚合酶鏈反應(PCR)或實時(RT)-PCR法。PCR是在若干數量級上擴增一段DNA并進而最終檢測出其單個或少量副本，從而產生特定DNA序列的數千個至數百萬個副本的技術。該方法依賴于熱循環、其由反復加熱及冷卻反應物以使DNA熔融以及進行DNA酶促復制的循環組成。含有與目標區域互補的序列的引物(短DNA片段)以及DNA聚合酶是使得選擇性及重復擴增成為可能的關鍵組分。隨著PCR進行，所產生的DNA本身可作為復制模板，從而開始使DNA模板呈指數擴增的鏈式反應。多肽、多核苷酸及表達載體的醫學用途作為類毒素疫苗的失活毒素通常用于治療和/或預防性治療細菌感染，主要用于獸醫應用，優選用于治療家禽群體。采用類毒素疫苗的目的在于調節免疫系統，以使其不對抗侵入的細菌而對抗由侵入的細菌產生的毒素。因此，本發明的GtxA多肽、編碼GtxA多肽的多核苷酸或表達載體可用于產生類毒素疫苗，其可用作治療和/或預防性治療由分泌GtxA毒素和/或類似毒素的細菌引起的病原性病況。在特定的實施方式中，對禽類提供被動免疫的劑量為每劑約O. 25ml疫苗。在另一實施方式中，劑量為每劑約0.4ml疫苗。在再一實施方式中，劑量為每劑約0.6ml疫苗。在一實施方式中，劑量為每劑約O. 5ml疫苗。在一個實施方式中，禽類是選自，但不限于，由鴨、火雞和雞所構成的組。在另一優選的實施方式中，禽類為產蛋母雞。本發明也提供對禽類施用本發明的疫苗，以保護禽類免受多種疾病侵襲的方法，這是通過將其他疫苗納入組合物中來完成的。本發明包括對禽類，優選為鴨、火雞或雞，更優選為產蛋母雞，接種疫苗以提供針對GtxA毒素的主動免疫。小雞和/或幼禽在生命早期接受疫苗接種，在約I天大或稍微更大些時(在出生第一周內)經單劑或兩劑疫苗接種。實現主動免疫的適當疫苗劑量可以在約O. 05ml至約O. 5ml范圍內變化。在特定實施方式中，疫苗劑量為約O. 05ml至約O. Iml0預期各禽類需要接受疫苗接種一次以上，諸如在1-3個月內接受兩次疫苗接種。為了終身保護例如產蛋母雞，可能需要每年再接種。在進一步的實施方式中，可以對禽類施用本發明的毒素或其免疫原性片段。同樣地，用作本發明的疫苗的GtxA毒素或其免疫原性片段的劑量范圍可為每劑每千克體重約 I μ g至每千克體重約1000 μ g,示例性范圍是每只動物每劑每公斤體重約10 μ g至每公斤體重約ΙΟΟμ go表I.引物列表。用于構建及驗證gtxA突變體的引物。下劃線為限制性位點。
引物名稱引物序列(5’-3’)__SEQIDNO
4240TATCGTCGACTATCCATCGCGGCATCAG7
4242AGCTGAATTCAAGCAAGTGCTATTGCTACCG 8
4243AGCTGAATTCTTATGTCGGCGATCAAACAA 94245 TATGTCTAGAGGCGTTGGTGGATAAGAGAT 10kanR CGATAGATTGTCGCACCTGA11kanF TATGGAACTGCCTCGGTGA 1239F TGATGCAATCAAAGATAAAGTCG 135734R AATCGGCATTGGAGCTTTC 142871F AACCAAACCAATCCAAGGT 15
3270R_ATTGCCGTCTTTGCCTACTG_16_表II.用于在大腸桿菌中表達的構建體的引物列表。下劃線為限制性位點。粗體指示通過重疊延伸來拼接的重疊區域。
權利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含選自以下群組中的氨基酸序列a)SEQID No. 1、2 或 3 ; b)選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及 c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是所述序列中不超過30個所述氨基酸被如此改變。
2.如權利要求I所述的多肽，其為選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的序列的天然存在的等位基因變異體。
3.如權利要求I所述的多肽，其中所述多肽包含源自巴斯德桿菌科，更優選為源自卡氏桿菌屬，更優選選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組的氨基酸序列。
4.如權利要求I所述的多肽，其為在此描述的變異多肽，其中所選序列中指定的任一氨基酸被改變以提供保守性取代。
5.如權利要求I所述的多肽，其中所述信號肽由異源信號肽置換。
6.如權利要求I所述的多肽，其與SEQID No. I具有至少70%的序列同一性，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. I的序列的多肽。
7.如權利要求I所述的多肽，其與SEQID No. 2具有至少70%的序列同一性，更優選為至少75 %，更優選為至少80 %，更優選為至少85 %，更優選為至少90 %，更優選為至少95%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 2的序列的多肽。
8.如權利要求I所述的多肽，其與SEQID No. 3具有至少70%的序列同一性，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 3的序列的多肽。
9.如權利要求I所述的多肽，或其片段，其中所述片段包含至少150個氨基酸，優選為至少200個氨基酸，更優選為至少300個氨基酸，更優選為至少500個氨基酸，更優選為至少750個氨基酸，更優選為至少1000個氨基酸，更優選為1250個氨基酸，更優選為1500個氨基酸，更優選為1750個氨基酸，最優選為2000個氨基酸。
10.如權利要求I所述的多肽，其中所述多肽已經過特定修飾而移除毒性活性。
11.如權利要求I所述的多肽，其中所述變異體是具有生物活性的。
12.如權利要求11所述的多肽，其中生物活性為毒性，其中所述毒性包含在接受體內形成孔，更優選為細胞毒性，更優選為細胞溶解性細胞毒性，甚至更優選為溶血性細胞毒性。
13.如權利要求9至11所述的多肽，其中所述變異體具有免疫原性。
14.如權利要求9所述的多肽，其中所述片段與SEQID NO I相比含有不超過30個氨基酸取代，更優選為不超過25個，更優選為不超過20個，更優選為不超過15個，更優選為不超過10個，更優選為不超過5個，更優選為不含氨基酸取代。
15.如前所述的權利要求中任一項所述的多肽，其進ー步包含親和性標簽，諸如polyHis標簽、GST標簽、HA標簽、FLAG標簽、C-myc標簽、HSV標簽、V5標簽、麥芽糖結合蛋白標簽、纖維素結合域標簽、BCCP標簽、鈣調蛋白標簽、Nus標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶標簽、綠色滅光蛋白標簽、硫氧還蛋白標簽、S標簽、Strep標簽。
16.如權利要求15所述的多肽，其中任一親和性標簽是可切割的。
17.如權利要求I至16中任一項所述的多肽，其為失活的。
18.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽通過熱或輻射而失活。
19.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽為化學失活的，優選通過暴露于甲醛而化學失活。
20.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽是SEQID No. I的未酰化形式。
21.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽或其任一片段具有免疫原性。
22.如前所述權利要求中任一項所述的多肽，作為藥物的應用。
23.如權利要求22所述的應用，其用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。
24.如權利要求22或23所述的應用，其中所述細菌感染是在恒溫動物中。
25.如權利要求22或23所述的應用，其中所述恒溫動物為禽類物種。
26.如權利要求22或23所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨科，更優選為鴨屬、雁屬、潛鴨屬、麝鴨屬、黑雁屬或天鵝屬；鵒形目，更優選為燕尾鷗屬、噪鷗屬、鷗屬、白鷗屬或叉尾鷗屬；鸛形目，更優選為鸛科；鴿形目，更優選為鴿屬、地鳩屬、黃鳩屬、雞鳩屬、姬地鳩屬、鶉鳩屬、鳳冠鳩屬、山鳩屬、新西蘭鳩屬、棕翅鳩屬、巨地鳩屬、鵑鳩屬、裸臉原鳩屬、冠鳩屬、小長尾鳩屬、斑尾鴿屬、褐果鳩屬、果鳩屬、印加地鳩屬、斑鳩屬、綠鳩屬、森鳩屬或哀鴿屬；雞形目，更優選為冠冢雉屬、叢冢雉、雉科或松雞亞科；鵜形目，更優選為鵜鶘科；紅鸛目，更優選為紅鸛科；鸚形目，更優選為鳳頭鸚鵡科、吸蜜鸚鵡科或鸚鵡科；鶴鴕目，更優選為鴯鹋科；美洲鴕鳥目，更優選為小美洲鴕屬或大美洲鴕屬；能形目，更優選為鴕鳥科構成的組。
27.如權利要求22或23所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨、火雞及雞構成的組，優選為產蛋母雞。
28.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下群組中的核酸序列a)SEQID No. 4、5 或 6 ; b)選自由SEQID No. 4、5和6所構成的組的核苷酸的序列變異體，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少60%的序列同一性； c)由a)中的任一者的至少450個連續核苷酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一核苷酸改變為不同核苷酸，限制條件是所述序列中不超過90個所述核苷酸被如此改變； d)能夠在高嚴格條件下與跟SEQID No. 4、5或6互補的多核苷酸雜交的多核苷酸； e)編碼SEQID No. I、2或3的多肽的多核苷酸； f)編碼選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體的多核苷酸，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及 g)編碼由SEQID No. 1、2或3中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段的多核苷酸，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是所述序列中不超過30個所述氨基酸被如此改變。
29.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含天然存在的等位基因核酸變異體的核苷酸序列。
30.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼源自卡氏桿菌屬，更優選為選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組的氨基酸序列的核酸序列。
31.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述編碼的多肽與SEQID No. 4具有至少60 %的序列同一性，更優選為至少65 %，更優選為至少70 %，更優選為至少75 %，更優選為至少80 %，更優選為至少85 %，更優選為至少90 %，更優選為至少85 %，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 4序列的多核苷酸。
32.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述編碼的多肽具有與SEQID No. 5具有至少60%的序列同一性，更優選為至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80 %，更優選為至少85 %，更優選為至少90 %，更優選為至少85 %，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 5序列的多核苷酸。
33.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述編碼的多肽具有與SEQID No. 6具有至少60%的序列同一性，更優選為至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少85%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 6序列的多核苷酸。
34.如權利要求28至33中任一項所述的多核苷酸，其經最優化以在大腸桿菌中表達。
35.如權利要求28至34中任一項所述的多核苷酸，作為藥物的應用。
36.如權利要求35所述的應用，其用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。
37.如權利要求35或36所述的應用，其中所述細菌感染是在恒溫動物中。
38.如權利要求35或36所述的應用，其中所述恒溫動物為禽類物種。
39.如權利要求35或36所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨科，更優選為鴨屬、雁屬、潛鴨屬、麝鴨屬、黑雁屬或天鵝屬；鵒形目，更優選為燕尾鷗屬、噪鷗屬、鷗屬、白鷗屬或叉尾鷗屬；鸛形目，更優選為鸛科；鴿形目，更優選為鴿屬、地鳩屬、黃鳩屬、雞鳩屬、姬地鳩屬、鶉鳩屬、鳳冠鳩屬、山鳩屬、新西蘭鳩屬、棕翅鳩屬、巨地鳩屬、鵑鳩屬、裸臉原鳩屬、冠鳩屬、小長尾鳩屬、斑尾鴿屬、褐果鳩屬、果鳩屬、印加地鳩屬、斑鳩屬、綠鳩屬、森鳩屬或哀鴿屬；雞形目，更優選為冠冢雉屬、叢冢雉、雉科或松雞亞科；鵜形目，更優選為鵜鶘科；紅鸛目，更優選為紅鸛科；鸚形目，更優選為鳳頭鸚鵡科、吸蜜鸚鵡科或鸚鵡科；鶴鴕目，更優選為鴯鹋科；美洲鴕鳥目，更優選為小美洲鴕屬或大美洲鴕屬；能形目，更優選為鴕鳥科構成的組。
40.如權利要求35或36所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨、火雞及雞構成的組，優選為產蛋母雞。
41.包含權利要求28至34中任一項所述的多核苷酸的載體。
42.如權利要求41所述的載體，其進ー步包含有效連接至所述多核苷酸的啟動子。
43.如權利要求41或42所述的載體，其中所述啟動子選自由原核啟動子所構成的組。
44.如權利要求43所述的載體,其中所述啟動子包含轉錄起始位點及RNA聚合酶結合位點。
45.如權利要求43所述的載體,其中所述啟動子包含Pribnow盒或其部分。
46.如權利要求43所述的載體，其中所述啟動子包含-35元件或其部分。
47.如權利要求41或42所述的載體，其中所述啟動子選自由真核啟動子所構成的組。
48.如權利要求47所述的載體,其中所述啟動子包含轉錄起始位點及RNA聚合酶結合位點。
49.如權利要求47所述的載體，其中所述啟動子包含TATA盒。
50.如權利要求47所述的載體，其中所述啟動子包含至少ー個任一真核轉錄因子的結合位點。
51.如權利要求41或42所述的載體，所述載體為病毒載體或質粒載體。
52.如權利要求51所述的載體，所述質粒載體為真核質粒載體或原核質粒載體。
53.如權利要求41或42所述的載體，所述載體選自由源自包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV和CIV的逆轉錄病毒科的載體構成的組。
54.如權利要求41或42所述的載體，選自由a病毒、腺病毒、腺相關病毒、桿狀病毒、HSV、冠狀病毒、牛乳頭瘤病毒、Mo-MLV的載體構成的組，優選為腺相關病毒。
55.如權利要求41至54中任ー項所述的載體，作為藥物的應用。
56.如權利要求41至54中任ー項所述的載體，其用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。
57.如權利要求55或56所述的應用，其中所述細菌感染是在恒溫動物中。
58.如權利要求55或56所述的應用，其中所述恒溫動物為禽類物種。
59.如權利要求55或56所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨科，更優選為鴨屬、雁屬、潛鴨屬、麝鴨屬、黑雁屬或天鵝屬；鵒形目，更優選為燕尾鷗屬、噪鷗屬、鷗屬、白鷗屬或叉尾鷗屬；鸛形目，更優選為鸛科；鴿形目，更優選為鴿屬、地鳩屬、黃鳩屬、雞鳩屬、姬地鳩屬、鶉鳩屬、鳳冠鳩屬、山鳩屬、新西蘭鳩屬、棕翅鳩屬、巨地鳩屬、鵑鳩屬、裸臉原鳩屬、冠鳩屬、小長尾鳩屬、斑尾鴿屬、褐果鳩屬、果鳩屬、印加地鳩屬、斑鳩屬、綠鳩屬、森鳩屬或哀鴿屬；雞形目，更優選為冠冢雉屬、叢冢雉、雉科或松雞亞科；鵜形目，更優選為鵜鶘科；紅鸛目，更優選為紅鸛科；鸚形目，更優選為鳳頭鸚鵡科、吸蜜鸚鵡科或鸚鵡科；鶴鴕目，更優選為鴯鹋科；美洲鴕鳥目，更優選為小美洲鴕屬或大美洲鴕屬；能形目，更優選為鴕鳥科構成的組。
60.如權利要求55至56所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨、火雞及雞構成的組，優選為產蛋母雞。
61.一種分離的宿主細胞，其經如所述權利要求41至54中任一項中的所述載體轉化或轉導。
62.如權利要求61所述的宿主細胞,選自由大腸桿菌、酵母菌屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、Sf9 昆蟲細胞構成的組；更優選為 CH0、CH0-Kl、HEI193T、HEK293、C0S、PC12、HiB5、RN33b 或BHK細胞。
63.能夠生產權利要求53或54中任ー項的傳染性病毒粒子的包裝細胞系。
64.ー種抗體，其能夠特異性結合至具有選自以下群組中的氨基酸序列的分離的多肽a)SEQID No. 1、2 或 3 ; b)選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及 c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是所述序列中不超過30個所述氨基酸被如此改變。
65.如權利要求64所述的抗體，其中所述抗體為禽類抗體，優選為雞抗體。
66.如權利要求64所述的抗體，其中所述抗體為多克隆、血清源性抗體或單克隆或重組抗體。
67.如權利要求64所述的抗體，其中抗體包含抗體的抗原結合片段諸如Fv、scFv、Fab、Fab’或F(ab)2,多聚形式諸如ニ聚IgA分子或五價IgM,親和抗體或雙價抗體。
68.一種使權利要求I至21中任一項所述的分離的多肽失活的方法，其中所述方法包含使用熱或化學品，優選為甲醇，或其中所述方法包含以未酰化形式表達所述多肽。
69.如權利要求68所述的方法，其中所述失活的多肽具有免疫原性。
70.ー種疫苗組合物，包含權利要求I至21中任一項所述的分離的多肽。
71.ー種疫苗組合物，包含權利要求28至34中任一項所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸以裸DNA或以載體形式使用。
72.如權利要求70和71所述的疫苗組合物，進ー步包含一種或多種適合的佐劑、賦形齊U、乳化劑或載體。
73.如權利要求70和71所述的疫苗組合物，進ー步包含來自對權利要求26所述的禽類物種具病原性的病毒或微生物的至少ー種其他抗原。
74.如權利要求73所述的疫苗組合物，其中所述病毒或微生物選自由傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、雞貧血因子、禽類呼腸孤病毒、禽肺炎病毒、雞痘病毒、禽腦脊髄炎病毒、雞敗血支原體、副雞嗜血桿菌、多殺性巴斯德菌和大腸桿菌構成的組。
75.如權利要求70所述的疫苗組合物，其中所述多肽與SEQID No. I的未酰化形式相同。
76.如權利要求70所述的疫苗組合物，其中所述多肽或其任何片段具有免疫原性。
77.如權利要求70和71所述的疫苗組合物，進ー步包含活的、減毒的雞卡氏桿菌。
78.一種將權利要求70至77中任一項所述的疫苗施與權利要求26所述的禽類物種的方法，其中所述疫苗通過肌肉內或皮下注射，透過例如食物或水口服，氣霧劑，在例如足或翼部劃痕，滴眼劑或經卵內投藥來施用。
79.如權利要求78所述的方法，其中所述禽類物種接種疫苗至少一次，諸如至少兩次，例如至少三次。
80.如權利要求78和79中任一項所述的方法，其中各疫苗劑量每劑含有每千克體重約I U g至每千克體重約IOOOii g的蛋白質，優選為每劑每公斤體重約IOii g至每公斤體重約100 u go
81.如權利要求78和79中任一項所述的方法，其中，其中疫苗的各單位劑量為約0.Iml至約2ml，諸如約0. 25ml至約lml，例如約0. 5ml。
82.如權利要求I至21所述的多肽，作為診斷性標記的應用。
83.—種診斷禽類物種的病原性細菌卡氏桿菌感染的方法，所述方法包含檢測權利要求I至9中任一項所述的多肽，檢測針對所述多肽的抗體，或檢測權利要求28至33中任一項的多核苷酸。
84.如權利要求83所述的方法，其中所述病原性細菌是來卡氏桿菌屬，更優選為選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組。
85.如權利要求83所述的方法，其中所述方法包含針對所述多肽的抗體的檢測，優選其中所述抗體為IgA。
86.—種檢測權利要求I至9所述的多肽的試劑盒，所述試劑盒包含至少ー種能夠結合所述多肽的結合蛋白，所述結合蛋白連接至固體支持物。
87.如權利要求86所述的試劑盒，所述試劑盒包含另ー結合蛋白，其中一種結合蛋白連接至可檢測部分。
88.如權利要求86所述的試劑盒，其中所述固體支持物為微粒。
89.如權利要求86所述的試劑盒，其中所述結合蛋白是針對權利要求I至9中任ー項所述的多肽的抗體。
90.如權利要求86所述的試劑盒，其中所述試劑盒能夠檢測所述多肽的量。
91.一種檢測針對權利要求I至9中任一項所述的多肽的抗體的試劑盒，其中所述試劑盒包含已固定至固體表面的所述多肽。
92.如權利要求91所述的試劑盒，其中所述抗體為IgA型。
93.ー種轉基因敲除微生物，其中內源基因已被破壞而消除功能性gtxA的表達和/或分泌，且其中所述微生物所展現的致病性相對于同一種類的野生型微生物而言有所降低。
94.如權利要求93所述的微生物，其中所述微生物為雞卡氏桿菌。
95.如權利要求93或94所述的微生物，其中所述gtxA基因已被破壞。
96.如權利要求93或94所述的微生物，其中所述gtxBD基因已被破壞。
全文摘要
本發明涉及動物健康且特別是由卡氏桿菌屬(Gallibacterium spp)，包括雞卡氏桿菌(Gallibacterium anatis)、卡氏桿菌基因種1(Gallibacterium genomospecies 1)和卡氏桿菌基因種2(Gallibacterium genomospecies 2)所引起的新細菌性家禽疾病的病原體領域。本發明提供來自卡氏桿菌物種的新型RTX毒素，將該新型毒素稱為GtxA(卡氏桿菌毒素)。此外，本發明提供GtxA的氨基酸及核苷酸序列，包含失活類毒素或類毒素片段的疫苗，以及免疫禽類來預防該疾病的方法及禽類的雞卡氏桿菌感染的診斷方法。
文檔編號A61K39/102GK102781954SQ201080045643
公開日2012年11月14日 申請日期2010年10月7日 優先權日2009年10月9日
發明者博迪爾·瑪麗·克里斯滕森, 安德斯·麥基·玻約森 申請人:哥本哈根大學
技術領域：
本發明屬于動物健康領域且特別是由卡氏桿菌屬(Gallibacterium spp),包括雞卡氏桿菌(Gallibacterium anatis)、卡氏桿菌基因種 I (Gallibacterium genomospeciesI)和卡氏桿菌基因種2 (Gallibacterium genomospecies 2)所引起的新細菌性家禽疾病的病原體。本發明提供來自卡氏桿菌(Gallibacterium)物種的新型RTX毒素，將該新型毒素稱為GtxA (卡氏桿菌毒素)。此外，本發明提供GtxA的氨基酸及核苷酸序列，包含失活的類毒素或類毒素片段的疫苗，以及免疫禽類來預防該疾病的方法及診斷禽類的雞卡氏桿菌感染的方法。
背景技術：
在過去十年間，在所有主要的家禽生產國中提高生產率的密集型家禽飼養法造成了疾病表現的增加。這引起了對于控制這些疾病的新型及較佳疫苗及疫苗接種計劃的需求增加。如今，已對多種動物進行了針對大量病毒及細菌源性疾病的免疫。家禽病毒性疾病的例子如雞新城疫(Newcastle Disease)、傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis) >禽肺炎病毒(Avian Pneumovirus)、禽痘(Fowlpox)、傳染性法氏囊病(Infectious BursalDisease)等。細菌性疾病的例子如由副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum)(上呼吸道)、禽波氏桿菌(Bordetella avium)(上呼吸道)、鼻氣管鳥桿菌(Omithobacteriumrhinotracheale)(下呼吸道)所引起的禽鼻炎(Avian Coryza),沙門氏菌感染(Salmonella infections)(消化道)，雞霍亂(fowl cholera)(敗血癥)的病原體多殺性巴斯德菌，(Pasteurella multocida)以及大腸桿菌(E. coli)感染。產蛋家禽生殖器官及腹膜的炎癥是商業產蛋家禽群體中經常發生的問題，引起產蛋量下降、死亡率增加以及隨之而來的經濟損失及動物福利下降。常常從這些病變中分離出禽病原性大腸桿菌，但若干研究已表明，雞卡氏桿菌單獨或作為共病原體是卵巢炎、輸卵管炎及腹膜炎的常見原因。此外，已從禽敗血癥、肝炎、腸炎及上呼吸道病變病例中分離出雞卡氏桿菌(G. anatis)。雞卡氏桿菌是產蛋母雞及其他禽類物種的上呼吸道與下生殖道正常菌群的常見部分(Bojesen A. M. , Nielsen S. S. , Bisgaard M. , Prevalence andtransmission of haemolytic Gallibacterium species in chicken production systemswith different biosecurity levels, Avian Pathol. (2003) 32 :503-510),且因此可被視為機會性病原體。未深入研究其發病機制，尤其沒有在分子水平上深入研究，而且對雞卡氏桿菌引發疾病能力背后的基因及機制知之甚少。雞卡氏桿菌(G. anatis)分為2個生物變種β -溶血性生物變種溶血型雞卡氏桿菌及非溶血性生物變種雞卡氏桿菌。溶解紅血球的能力是病原性雞卡氏桿菌分離株的主要表型(Christensen H. , Bisgaard Μ.,Bojesen A. M. , Mutters R. , Olsen J. E. , Genetic relationships among avian isolatesclassified as Pasteurella haemolytica, ' Actinobacillus salpingitis ' orPasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen.nov. , comb,nov and description of additional genomospecies within Gallibacterium gen.nov, Int. J. Syst. Evo I. Microbiol. (2003) 53 :275-287)。卡氏桿菌是屬于變形菌(Y -proteobacterial)巴斯德菌科(Pasteurellaceae)的革蘭氏陰性菌屬(Christensen等人，同上)，且巴斯德菌科的各種病原性成員，如引發人類牙周病的伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)，牛運輸熱(bovine shipping fever)的病原體溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)以及豬病原體胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pIeuropneumoniae)產生屬于RTX-毒素(RTX是毒素重復單兀的縮寫)群組的溶血素及白細胞毒素。可以獲得由失活或活減毒細菌組成的雞卡氏桿菌疫苗。然而，這些疫苗不會對該物種分泌的溶血性蛋白質給予保護作用
發明內容
本發明旨在研究雞卡氏桿菌生物變種溶血型(G. anatis biovar haemolytica)與真核細胞的相互作用，以及識別與表征負責溶血性表型的基因和蛋白質。發明人發現雞卡氏桿菌對禽類巨噬細胞具有高細胞毒性，這很可能是在發病機制中起關鍵作用的性狀。此夕卜，發明人識別及表征了一種負責雞卡氏桿菌生物變種溶血型的白血球毒性及溶血活性的新型RTX-毒素。本發明涉及來自卡氏桿菌(Gallibacterium)屬，最優選為選自由雞卡氏桿菌(Gallibacterium anati)、卡氏桿菌基因種 I (Gallibacterium genomospecies I)及卡氏桿菌基因組2 (Gallibacterium genomospecies 2)構成的組的細菌的GtxA多肽及多核苷酸。在第一方面，本發明涉及分離的多肽，該多肽包含以下群組中的氨基酸序列a) SEQ ID No. I、2 或 3 ;b)選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。具有如SEQ ID NO I所示氨基酸序列的多肽是來自雞卡氏桿菌的RTX毒素。將這由2026個氨基酸(aa)組成的蛋白質稱為GtxA (卡氏桿菌毒素)。這是典型的成孔RTX-毒素尺寸的2倍。GtxA的C-末端IOOOaa與巴斯德桿菌科(Pasteurelleceae)的其他成員的RTX-毒素同源,例如與胸膜肺炎放線桿菌(A. pleuropneumoniae) ApxIA具有38%的序列相似性。與此相反，N-末端約950aa在GenBank數據庫中沒有顯著匹配物,但含有11個未知功能的57-aa重復單元。GtxA毒素具有多種效用，包括但不限于作為類毒素疫苗的用途，以及用于揭示通常在禽類中且尤其在家禽中針對雞卡氏桿菌的已存在的免疫反應的診斷用途。在又一方面，本發明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含選自以下群組中的核酸序列
a)SEQ ID No. 4、5 或 6 ;b)選自由SEQ ID No. 4、5和6所構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少60%的序列同一性；c)由a)中的任一者的至少450個連續核苷酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一核酸改變為不同核酸，條件是該序列中不超過90個核酸被如此改變；d)能夠在高嚴格條件下與跟SEQ ID No. 4、5或6互補的多核苷酸雜交的多核苷酸；e)編碼SEQ ID No. I、2或3的多肽的多核苷酸；f)編碼選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體的多核苷酸，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及
g)編碼由SEQ ID No. 1、2或3中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段的多核苷酸，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。此外，本發明涉及包含本發明的多核苷酸的載體。在其他方面，本發明涉及本發明的多肽、本發明的多核苷酸及本發明的載體的醫學用途。優選地，醫學用途是用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。在一方面，本發明涉及本發明的多肽和/或多核苷酸在制備用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷的藥物中的應用。在其他方面，本發明涉及經本發明的載體轉化或轉導的分離的宿主細胞，并涉及能夠生產本發明的感染性病毒粒子的包裝細胞系。此外，本發明涉及抗體，其能夠特異性結合具有選自以下群組中的氨基酸序列的分離的多肽a) SEQ ID No. I、2 或 3 ;b)選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。這些針對GtxA的抗體可用于診斷及治療方面。在其他方面，本發明涉及失活本發明的分離的多肽的方法。此外，本發明涉及疫苗組合物，其包含本發明的分離的多肽或以裸DNA或載體制備的分離的多核苷酸，可選地連同一種或多種合適的佐劑、賦形劑、乳化劑或介載體。在另一方面，本發明涉及將本發明的疫苗施與本文所述的禽類物種的方法，其中所述疫苗是通過肌肉內或皮下注射，透過例如食物或水口服，氣霧劑，在例如足或翼部劃痕，滴眼劑或經胚給藥(in-ovo administration)來施用。在其他方面，本發明涉及本發明的多肽或多核苷酸在作為診斷標記的用途。本發明也提供了診斷禽類物種中病原性細菌卡氏桿菌(Gallibacterium)感染的方法，所述方法包含檢測本發明的多肽，檢測針對該多肽的抗體，或檢測本發明的多核苷酸。優選地，病原性細菌來自卡氏桿菌屬，更優選地選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組。本發明也提供了檢測本發明的多肽存在的試劑盒，試劑盒包含至少一種能夠結合該多肽的結合蛋白，所述結合蛋白與固體支持物連接。優選地，所述結合蛋白是抗體。在一方面，本發明涉及檢測針對本發明的多肽的抗體的試劑盒，其中所述試劑盒包含已固定到固體表面的所述多肽。
圖I :雞卡氏桿菌培養物上清液的溶血活性以及GtxA的表達。A.雞卡氏桿菌12656-12的生長以及無細胞培養物上清液的溶血活性。將過夜培 養物按I : 100稀釋并，且記錄其生長(在600nm吸光度測量細胞密度)及無細胞培養物上清液的溶血活性。顯示了在BHI中按100倍稀釋的上清液的溶血活性。平行收獲細胞外蛋白質用于蛋白質印跡法(圖5B)。實驗重復三次，溶血活性的水平有所變化，但相對模式一致。B.用Apxl-抗血清蛋白質印跡法測定GtxA的水平。在印跡法之前,于指定時間點收獲上清液，并如材料與方法中所述濃縮100倍，且通過3% -8%凝膠進行SDS-PAGE分離。在OD6qq = 2時收獲來自Δ gtxA的細胞外蛋白質(標記Δ gtxA的泳道)。WC =來自野生型的全細胞裂解物，接種后5小時收獲細胞。尺寸標記物指示在左側。重復實驗，結果相同。圖2 :雞卡氏桿菌12656-12野生型(wt)與同基因的gtxA突變(AgtxA)的溶血活性及細胞毒性。A. β -溶血。將細菌劃線接種于含5%牛血的BHI-瓊脂培養板上，并在37°C培養18小時。B.與生理鹽水(空白對照)、wt或AgtxA共培養I小時后的HDll細胞光學顯微鏡檢測結果(100倍放大)。在指數生長晚期(0D_ = I)收獲細菌，并以10. C感染量(m. o. i)添加。以LDH活性量化細胞毒性。將HDll細胞用如IB所述的細菌培養。顯示了三個重復孔的平均值，柱條表不標準誤差(S. E)。圖3A.雞卡氏桿菌12656-12中的gtxA、gtxC及其側翼基因的基因構造。箭頭指示開放讀碼框。在gtxC下游指示出預測的轉錄終止子。B. GtxA的構造。K指示保守的賴氨酸殘基(Lysl484和Lysl607)。標記了富含甘氨酸、天冬氨酸的區域(位置1640-1830)。C. GtxA N-末端域的15個重復單元的比對，以Radar法[Heger A. , Holm L,Rapid automatic detection and alignment of repeats in protein sequences，Proteins (2000) 41 :224-237]來生成比對結果。右邊數字指示GtxA中的氨基酸位置。標記了重復單元中50%以上氨基酸相同(黑色)或相似(灰色)的位置。圖4 :表達GtxA的大腸桿菌的細胞毒素活性。A.在30°C培養的生長于含5%牛血和0. ImM IPTG的LB-瓊脂中的大腸桿菌ER2566的β -溶血活性。TlSS :+或-指示了表達大腸桿菌的TlSS-組分HlyB和HlyD的質粒pLG575存在與否。RTX = GtxA的第931-2026位氨基酸，N-端=GtxA的第1-949位
氨基酸。B.使用表達不同形式的GtxA的大腸桿菌ER2566/pLG575的液體溶血檢測和LDH
細胞毒性檢測。圖5 :大腸桿菌中GtxA的表達。對來自IPTG誘導后的大腸桿菌ER2566的全細胞裂解物(WC)和細胞外蛋白質(EC)進行蛋白質印跡分析。以4-12%凝膠中進行SDS-PAGE來分離蛋白，并在PVDF-膜上形成印跡。用ApxI-抗血清探測印跡。B =空白，尺寸標記物指示在右側(PageRulerPrestained Protein Ladder Plus (Fermentas))。各泳道中的上部條帶具有預期大小的全長GtxA(215kDa)或RTX-域(117kDa)。尺寸較小的條帶很可能是降解產物。
圖6 :來自不同卡氏桿菌菌株的氨基酸序列比對。將GtxA(SEQ ID No I)的第1133-1515位氨基酸與源自其他卡氏桿菌菌株的其他毒素的氨基酸序列進行比對。點指示相同殘基，而突出顯示部分為非保守位置。圖7在OD6tltl = 0.6時收獲來自不同雞卡氏桿菌菌株以及卡氏桿菌基因種1(G.genomospecies I) (CCM5974)及卡氏桿菌基因種2 (CCM5976)的模式菌株的培養物上清液，并過濾除菌。如方法中所述使細胞外蛋白質沉淀，并用3-8% Tris-乙酸鹽SDS-凝膠進行分離，在PVDF膜上形成印跡,并用ApxIA-抗血清探測。箭頭標出GtxA(215kDa)。較大條帶為與GtxA無關的未識別蛋白質(參見圖3)或GtxA的修飾形式。M=分子尺寸標記物(Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Fermentas))，尺寸指不在右側(kDa)。圖8 =TlSS-突變體中的GtxA的β -溶血活性及亞細胞定位。Α.雞卡氏桿菌12656-12及同基因突變體的β -溶血。在37 °C培養經12656-12 (wt)、gtxA-和gtxBD突變體劃線接種的血瓊脂培養板24小時后的照片。已從劃線的左側部分移除細菌以顯露菌落下的溶血。B. GtxA的亞細胞定位。在向生長穩定期轉變時(OD600 = I. 7)收獲細胞及上清液。如方法中所述使細胞外蛋白質沉淀。用3-8% Tris-乙酸鹽SDS-凝膠分離全細胞裂解物(沉淀)和細胞外蛋白質(上清液)，并在PVDF膜上形成印跡，且用ApxIA-抗血清探測。箭頭標出GtxA。通過質譜分析確認同一性。抗血清另外識別了野生型及突變型菌株中皆存在的約270kDa的未識別蛋白質。尺寸標記物指示在左邊(Spectra Multicolor High Range Protein Ladder (Fermentas))。圖9 :雞卡氏桿菌12656-12中的gtxAC及gtxEBD基因座的構造。箭頭表示開放讀碼框(ORF)。用小箭頭在各ORF上方指出用于檢測gtxA及gtxEBD的引物對的位置。為了比較，還包括了典型RTX-毒素基因座的構造(Frey & Kuhnert2002)。定義本文所用術語“佐劑”是指與所施用的免疫原性決定簇/抗原/核酸構建體混合可增強或者改良對所述決定簇的免疫反應的物質。本文所用術語“等位基因變體”是指編碼SEQ ID No. I的基因的替代形式。等位基因可由核酸序列中的至少一個突變產生，且可產生其結構或功能可能有改變或無改變的改變的mRNA或多肽。產生等位基因的常見突變變化一般歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。這類變化各自可在既定序列中單獨或與其他變化組合出現一次或多次。本文所用術語“抗體”是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的活性部分。抗體是例如完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫活性的片段。本文所用術語“抗原”是指可以結合到呈無性繁殖分布的免疫受體(T-細胞或B-細胞受體)的物質；通常為肽、多肽或多聚多肽。抗原優選為能夠誘發免疫反應。本文所用術語“結合檢測”是指任何兩個或更多分子以共價或非共價形式彼此結合，從而能測量該分子之一的濃度的任何生物或化學檢測。本文所用的術語“生物樣本”是指選自由血清、血漿、全血、唾液、尿、淋巴、活檢組織、精液、糞便、眼淚、汗液、乳汁、腦脊髓液、腹水、滑液構成的組的任何樣本，但不限于此。本文所用術語“載體”是指與抗原耦合而有助于誘發免疫反應的實體或化合物。
種共有化學和/或物理特性的氨基酸取代的取代。氨基酸可根據共有特性分組。保守氨基酸取代是將既定氨基酸組內的一個氨基酸用同一組內的另一個氨基酸取代，其中既定組內的氨基酸展現相似或實質上相似的特性。本文所用術語“檢測部分”是指一分子的能夠結合并檢測另一分子的特定部分，分子優選但不限于蛋白質。本文所用術語“診斷標記”是指一化合物，例如蛋白質，可以用于確定個體罹患何種失調的特征。本文所用術語“失調”是指疾病或醫學問題，并為生物體中與特定癥狀及體征相關且損害身體機能的異常情況。這可能由外部因素，如侵入生物體引起，或者可能由內部機能失調引起。本文所用術語“片段”是指核酸或多肽的非全長部分。因此，片段本身亦分別為核酸或多肽。本文所用術語“免疫原性”是指特定物質，如抗原或抗原表位激發免疫反應的能力，其中所述免疫反應可為細胞免疫反應或體液免疫反應。本文所用術語“藥物”是指醫藥藥物，也稱為藥品或藥劑，可將其寬泛地定義為任何旨在用于預防性、治療性、改善性或癥狀性用途的化學物質，優選為疫苗。根據上文應該了解，本發明的期望用途并非必定包含100%預防、治療或改善任何疾病，而是也包含部分預防、治療或改善。本文所用術語“致病性”是指病原體，如微生物，如雞卡氏桿菌(Gallibacteriumanatis)在生物體中產生傳染性疾病的能力。本文所用術語“質粒”是指從染色體DNA分離的能夠不依賴于染色體DNA進行復制的染色體外DNA分子。本文所用術語“多核苷酸”是指由以鏈形式共價鍵結合的核苷酸單體，例如DNA(脫氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)組成的有機聚合物分子。本文所用術語“多肽”是指也稱為蛋白質的有機化合物，其為具有至少兩個且優選具有兩個以上氨基酸的肽。通用術語氨基酸包含天然及非天然氨基酸，它們皆可呈“D”或“L”異構形式。本文所用術語“預防性治療”是指目的在于預防而非治療或治愈疾病的任何醫學方法。術語預防不意為絕對的，而是也包括部分預防疾病或疾病的一個或多個癥狀。本文所用術語“啟動子”是指在DNA鏈中與RNA聚合酶結合而啟動通過一個或多個臨近結構基因進行的信使RNA轉錄的結合位點。本文所用術語“RTX毒素”(結構毒素重復單元)是指由大量病原性革蘭氏陰性細菌產生的成孔蛋白質毒素。本文所用術語“序列同一性”是指兩個序列之間的同一性百分比的測定，并可以使用數學算法來獲得。一個用于比較兩個序列的數學算法的優選的、非限制性實例為Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268 的算法，改良為 Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877 的算法。這種算法并入到了Altschul，et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410 的 BLASTN 和 BLASTP 程序中。 為了表征同一性，比對目標序列以便獲得最高水平的同源性(匹配度)。基于這些一般原理，兩個核酸序列的“同一'I"生百分比”可采用BLASTN算法[Tatiana A. Tatusova,Thomas L. Madden Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences ；FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250],可從 NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)網頁(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov)獲得，并使用此處建議的默認設置(即，匹配的加分=I ;錯配的罰分=-2 ;鏈選項=雙鏈；空位開放=5 ;延伸空位=2 ;罰分空位X dropoff = 50 ;預期值=10 ;序列長度=11 ;過濾器開啟)來確定。BLASTN算法確定兩個所比對的核苷酸序列重疊范圍內的序列同一性百分t匕。由于Blast是局部比對，所以最適用于計算長度不同的兩個相關序列之間重疊范圍內的序列同一性百分比。用于比較序列的數學算法的另一優選的、非限制性實例為CLUSTAL ff(l. 7)比對算法(Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994)CLUSTAL Wimprovingthe sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. NucleicAcids Research，22 :4673-4680.)。CLUSTAL W 可以用于多序列比對，優選使用 BLOSUM 62作為計分矩陣。當計算序列同一性時，CLUSTAL W包括由比對參照序列的長度所產生的任何空位。序列同一性是由將匹配數目除以具有空位的比對序列的長度來計算。本文所用術語“信號肽”是指決定蛋白質在細胞中的最終位置的氨基酸短序列，也稱為分選肽。本文所用術語“毒素”是指由活細胞或生物體產生的能夠在與身體組織接觸或由身體組織吸收時引起疾病的有毒物質。本文所用術語“類毒素”是指毒性已經化學或熱處理而被減弱或抑制但保持其他特性，例如免疫原性的細菌毒素(通常為外毒素)。本文所用術語“轉錄因子”是指結合至特定DNA序列并從而控制遺傳信息從DNA向mRNA傳遞的蛋白質。本文所用術語“疫苗”是指能夠在動物體內誘發免疫反應的物質或組分。免疫反應是指在生物體內誘生記憶，產生傳染因子，遇到繼發反應而非初次反應，從而降低其對宿主生物體的影響的免疫反應(體液的/抗體的和/或細胞的)。本文所用術語“載體”是指作為運載工具將外來遺傳物質轉移至另一細胞中的DNA分子。
具體實施例方式本發明的主要目的在于提供疫苗組合物，其包含來自雞卡氏桿菌(Gallibacterium anati)的特定RTX毒素，GtxA或其免疫原性變異體或片段，用作治療和/或預防性治療禽類的由卡氏桿菌(Gallibacterium)屬細菌感染引起的任何疾病的藥物。雞卡氏桿菌是雞及其他禽類物種上呼吸道與下生殖道中的正常菌群的一部分。然而，雞卡氏桿菌也已從病理性病變中分離出來并因此將其認為是潛在病原體。本發明提供一種新型毒性因子；即具有非典型構造及廣泛靶細胞范圍的雞卡氏桿菌RTX-毒素。來自雞卡氏桿菌培養物的無細胞且經濾除菌的上清液溶解有紅血球及源自禽類的巨卩遼細胞樣細胞(HDll),這表明產生了一種或多種外毒素。在雞卡氏桿菌12656-12的基因組序列中，鑒定出RTX-毒素基因。所編碼的蛋白質，稱為GtxA(卡氏桿菌毒素)，由 2026個氨基酸(aa)組成。這是典型成孔RTX-毒素尺寸的2倍。GtxA的C-末端1000個aa與巴斯德桿菌科(Pasteurelleceae)其他成員的RTX-毒素同源,例如與胸膜肺炎放線桿菌(A. pleuropneumoniae)ApxIA具有38%序列相似性。與此相反，N-末端約950個aa在GenBank數據庫中沒有顯著匹配物,但含有11個未知功能的57_aa重復單元。表達gtxA及其乙酰轉移酶激活子gtxC的大腸桿菌(E.coli)變得具有溶血性和白血球毒性。研究了 GtxA的各種截短形式的功能。C-末端RTX-域所展現的溶血活性低于完整毒素，這表明N-末端域并非必需的，而是最大溶血活性所需。僅用C-末端未檢測出對HDll細胞的細胞毒性，這表明新型N-末端重復單元域是對白血球的細胞毒性效應所必需的。用蛋白印跡法(western blotting)和northern印跡法研究雞卡氏桿菌中gtxA的表達。在細胞外蛋白質部分中以生長期依賴性方式檢測到GtxA，但未在細胞相關的蛋白質部分中檢測到GtxA，這與預測的毒素分泌相符。針對gtxA的存在及表達、GtxA分泌水平以及培養物上清液的裂解活性，研究了 11種不同基因型及表型的卡氏桿菌菌株。gtxA分布廣泛且可見于所測試的所有菌株中，包括卡氏桿菌基因種(Gallibacterium genomospecies) I和2 (圖6,比對)。菌株間的表達情況實質上不同，且無毒性非溶血型菌株F149T表達量微小。上清液中的GtxA水平與對HDll細胞的溶血活性及細胞毒性活性的水平在某種程度上相關。預期GtxA顯著促成了雞卡氏桿菌的致病性。GtxA先前未有描述，GtxA是分子量為215kDa且具有SEQ ID No. I序列的2026個氨基酸的大多肽。它可分為C-末端片段及N-末端片段。示例性C-末端片段由1077個氨基酸(SEQ ID No. 2)組成，類似特征為6個串聯重復九肽的典型RTX毒素。示例性N-末端由949個氨基酸(SEQ ID No. 3)組成，其相對疏水且與GenBank中的其他RTX毒素或其他蛋白質幾乎不共有序列相似性。毒素活性依賴于激活子，GtxC，其促進GtxA的脂肪酸酰化，S卩，毒性依賴于多肽的轉錄后酰化。未酰化的蛋白質不具有毒性。GtxA展現了細胞溶解表型，主要是溶血性及白血球毒性。C-末端RTX-域所展現的溶血活性低于完整毒素，這表明N-末端域并非必需的，而是最大溶血活性所需。僅用C-末端未檢測出對源自禽類的巨噬細胞樣HDll細胞的細胞毒性，這表明新型N-末端重復單元域是對白血球的細胞毒性效應所必需的。篩選來自不同地理區域(Denmark、Czech Republic和Mexico)的卡氏桿菌菌株的gtxA基因的存在，在所測試的所有菌株中皆發現有該基因，但個別菌株之間表達情況存在實質性差異。這差異似乎與地理起源無關。雞卡氏桿菌是雞、產蛋母雞及其他禽類物種上呼吸道與下生殖道中的正常菌群的一部分。然而，雞卡氏桿菌也已從禽類病理性病變中分離出來，且相信雞卡氏桿菌對家禽的發病機制發揮了重要作用。因此，本發明的目的在于提供源自GtxA蛋白質或其免疫活性多肽變異體的類毒素疫苗，用作治療和/或預防疾病的藥物。所述疾病可能由恒溫動物的細菌感染引起，且本發明的另一目的在于預防或治療所述疾病。本發明的另一方面涉及用于治療和/或預防疾病的編碼GtxA蛋白質的多核苷酸或編碼免疫活性多肽變異體的多核苷酸。如由圖6中的部分氨基酸序列的比對所證明，GtxA多肽在不同雞卡氏桿菌分離株 間高度保守。因此，預期包含GtxA類毒素的疫苗組合物可對大量不同的雞卡氏桿菌分離株，甚至對卡氏桿菌屬的相關種類有效。細菌物種本發明涉及多肽、多核苷酸及帶有多核苷酸的表達載體。在一個實施方式中，多核苷酸及多肽源自雞卡氏桿菌。此外，本發明也涵蓋來自巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae),優選來自卡氏桿菌(Gallibacterium)屬，最優選來自由雞卡氏桿菌(Gallibacteriumanatis)、卡氏桿菌基因種I (Gallibacterium genomospecies I)和卡氏桿菌基因種2 (Gallibacterium genomospecies 2)構成的組的細菌的多肽及和多核苷酸。已經證實GtxA與其他RTX毒素廣泛不同。通過本文所提供的分子工具，發明人已使得克隆或探測來自卡氏桿菌屬的其他GtxA樣毒素成為可能。預期這些來自相關物種的GtxA樣毒素與SEQ ID NO 1、2或3展現某種程度的序列同源性，且可預期編碼序列與基于本發明的多核苷酸的探針雜交。遺傳修飾的菌株如實施例2中所述，本發明的發明人已生產了雞卡氏桿菌gtxA突變型菌株。將該菌株命名為AgtxA。實施例7中描述了關于這種雞卡氏桿菌AgtxA突變體的感染實驗，其中感染野生型微生物的禽類一般顯現涉及生殖道及腹膜的彌散性及化膿性炎癥，這與在野外從雞卡氏桿菌自然感染所觀測到的病變相當。另一方面，感染AgtxA突變體的禽類一般顯現位于卵巢的較輕度炎癥。因此，研究已表明在雞中gtxA實質上促成了雞卡氏桿菌的發病機制。由此可斷定，本發明的發明人已證實上文所定義的AgtxA菌株可以用于免疫生物體。這些免疫的生物體,例如禽類物種，因此可以經由對例如特定病原性微生物表面上的非gtxA抗原產生的抗體而對表達gtxA的野生型微生物產生免疫性，特定病原性微生物的種類與gtxA表達和/或分泌已經消除的微生物的種類相同。因此，在一個方面，本發明涉及轉基因敲除的微生物，其中內源gtxA基因已被破壞從而消除了功能性gtxA多肽的表達，且其中所述微生物所展現的致病性相對于非轉基因的對照微生物而言有所降低。在一個實施方式中，微生物是雞卡氏桿菌。在另一實施方式中，轉基因微生物不具有抗生素抗性。
GtxA 多狀一種野生型GtxA，即天然存在的非突變型蛋白質，以SEQ ID No. I標示。在一方面，本發明涉及分離的多肽，所述多肽包含選自以下群組中的氨基酸序列a)SEQ ID No. 1、2 或 3 ;b)選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是該序列中不超過30個氨基酸被改變。其他野生型GtxA多肽可從其他卡氏桿菌以及其他雞卡氏桿菌分離株中分離出 來。如圖6中的片段比對所示，預期這些GtxA與SEQ ID NO I、2和/或3享有高度序列同一性。在優選的實施方式中，本發明涉及SEQ ID No. I及GtxA序列變異體，該GtxA序列變異體包含與SEQ ID No. I至少70%的序列同一性，更優選為包含與GtxA序列75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性,例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性，例如至少99. 5%的序列同一性，諸如至少99. 9%的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及GtxA多肽的C-末端域，其以SEQ ID No. 2定義，并涉及序列變異體，該序列變異體包含與SEQ ID No. 2至少70%的序列同一性，更優選為包含與GtxA序列的C-末端域75 %的序列同一性，例如至少80 %的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及GtxA多肽的N-末端域，其以SEQ ID No. 3定義，并涉及序列變異體，該序列變異體包含與SEQ ID No. 3至少70%的序列同一性，更優選為包含與GtxA序列的N-末端域75 %的序列同一性，例如至少80 %的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。除全長GtxA之外，本發明還涉及GtxA的片段，例如C-末端GtxA域以及涉及N-末端GtxA域。此外，本發明涉及這些多肽的片段。在優選的實施方式中，所述片段由至少150個連續氨基酸組成，優選為至少200個氨基酸，更優選為至少300個氨基酸，更優選為至少500個氨基酸，更優選為至少750個氨基酸，更優選為至少1000個氨基酸，更優選為1250個氨基酸，更優選為至少1500個氨基酸，更優選為至少1750個氨基酸，更優選為至少2000個氨基酸。GtxA片段可與野生型GtxA序列在一個或多個位置上不同。在優選的實施方式中，所述片段可含有至多30個氨基酸取代，更優選至多25個取代，更優選至多20個取代，更優選至多15個取代，更優選至多10個取代，更優選至多5個取代，諸如4、3、2或I個取代。
本發明所涵蓋的其他變異體是指SEQ ID No. 1、2和3的多肽的變異體，其中發生了保守氨基酸取代。在優選的實施方式中，本發明涉及包含SEQ ID No. 1、2或3的任何多肽，其中多肽序列中的任何氨基酸已經由另一氨基酸保守取代。在另一優選的實施方式中，所述序列變異體及片段具免疫原性。在再一優選的實施方式中，所述序列變異體及片段保留生物活性，諸如毒性，其中所述毒性包含在接受體的細胞膜中形成孔，例如細胞毒性，諸如細胞溶解性細胞毒性，例如溶血性細胞毒性。本發明也涉及SEQ ID No. 1、2和3的多肽，其中所述多肽為了去除諸如毒性的生物活性，而經特別修飾，但保留諸如免疫原性的活性。因此，在優選的實施方式中，SEQ ID No. 1、2和3的多肽已優選通過熱或輻射，更優選通過以非酰化形式表達，更優選通過暴露于諸如甲醛的化學物質，而失活。在另一優選的實施方式中，本發明涉及包含SEQ ID No. 1、2或3的任何多肽，其中信號肽已被異源信號肽替代。出于純化的目的，可標記本發明。在優選的實施方式中，SEQ ID No. 1、2和3可用 標簽，例如C-myc標簽,諸如HSV標簽,例如V5標簽,諸如麥芽糖結合蛋白標簽，例如纖維素結合域標簽，諸如BCCP標簽，例如鈣調蛋白標簽，諸如Nus標簽，例如谷胱甘肽-S-轉移酶標簽，諸如綠色突光蛋白標簽，例如硫氧還蛋白標簽，諸如S標簽,例如Strep標簽。優選地，標簽位于蛋白質的C-末端部分，諸如位于C-端最末端處。更優選地，通過在標簽與RTX多肽之間插入蛋白酶位點，可從GtxA多肽上切割標簽。GtxA多核苷酸本發明提供SEQ ID No. 4、5和6的特定多核苷酸序列。本發明涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下群組中的核酸序列a)SEQ ID No. 4、5 或 6 ;b)選自由SEQ ID No. 4、5和6所構成的組的多核苷酸的序列變異體，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少60%的序列同一性；c)由a)中的任一者的至少450個連續核苷酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一核苷酸改變為不同核苷酸，限制條件是該序列中不超過90個核苷酸被如此改變；d)能夠在高嚴格條件下與跟SEQ ID No. 4、5或6互補的多核苷酸雜交的多核苷酸；e)編碼SEQ ID No. I、2或3的多肽的多核苷酸；f)編碼選自由SEQ ID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體的多核苷酸，其中該變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及g)編碼由SEQ ID No. 1、2或3中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段的多核苷酸，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是該序列中不超過30個氨基酸被如此改變。適用于測定核苷酸探針與同源DNA或RNA序列間雜交的實驗條件涉及將含有待雜交的DNA片段或RNA的過濾膜預浸泡于5 X SSC[氯化鈉/檸檬酸鈉；參見Sambrook etal. ；Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab. ,Cold SpringHarbor, NY 1989]中 10 分鐘，且在 5XSSC、5XDenhardt 溶液[參見 Sambrook 等人；同上]、0. 5% SDS和ΙΟΟμ g/ml變性的經超聲處理的鮭魚精子DNA[參見Sambrook等人；同上]的溶液中將過濾膜預雜交，繼而在大約45°C下于含有濃度為10ng/ml的隨機引物的[Feinberg A P & Vogelstein B ；Anal. Biochem. 1983 132 6-13]經 32P_dCTP 標記(比活性> lXKWcpm/yg)的探針的相同溶液中雜交12小時。隨后在至少60°C (中嚴格條件)，優選至少65°C (中/高嚴格條件)，更優選在至少70°C (高嚴格條件)，且甚至更優選在至少75°C (極高嚴格條件)的溫度下，于O. I X SSC、0. 5% SDS中洗滌過濾膜兩次，持續30分鐘。可使用X-射線薄膜來檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。在一個實施方式中，核酸分子與選自由SEQ ID No. 4、5和6構成的組的核酸序列的差別單個核苷酸。單取代可為沉默突變或可產生保守氨基酸取代。單取代或缺失也可產生移碼突變。在更優選的實施方式中，本發明涉及與SEQ ID No. 4的多核苷酸具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列，更優選為與SEQ ID No. 4至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95 %，更優選為至少96 %，更優選為至少97 %，更優選為至少98 %，更優選為至少99 %的序列同一性。
在另一優選的實施方式中，本發明涉及與SEQ ID No. 5的多核苷酸具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列，更優選為與SEQ ID No. 5至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95 %，更優選為至少96 %，更優選為至少97 %，更優選為至少98 %，更優選為至少99 %的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及與SEQ ID No. 6的多核苷酸具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列，更優選為與SEQ ID No. 6至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95 %，更優選為至少96 %，更優選為至少97 %，更優選為至少98 %，更優選為至少99 %的序列同一性。本發明也涉及SEQ ID No. 1、2和3的多核苷酸的片段，在優選的實施方式中，該片段由至少450個連續核苷酸組成，更優選由至少500個連續核苷酸，更優選由至少600個連續核苷酸，更優選由至少750個連續核苷酸，更優選由至少1000個連續核苷酸，更優選由至少1500個連續核苷酸，更優選由至少2000個連續核苷酸，更優選由至少2500個連續核苷酸，更優選由至少3000個連續核苷酸，更優選由至少3500個連續核苷酸，更優選由至少4000個連續核苷酸，更優選由至少4500個連續核苷酸，更優選由至少5000個連續核苷酸，更優選由至少5500個連續核苷酸，更優選由至少6000個連續核苷酸組成。多核苷酸片段可在一個或多個位置上不同于該片段所源自的野生型GtxA多核苷酸序列。在優選的實施方式中，該片段可含有至多90個核苷酸取代，更優選至多80個取代，更優選至多70個取代，更優選至多60個取代，更優選至多50個取代，更優選至多40個取代，更優選至多30個取代，更優選至多20個取代，更優選至多10個取代，更優選至多5個取代，諸如4、3、2或I個取代。本發明涉及能夠與具有SEQ ID No. 4、5和6的序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，優選在高嚴格雜交條件下進行。本發明的多核苷酸可包含天然存在的等位的核酸變異體的核苷酸序列。
本發明的多核苷酸也可包含SEQ ID No. 4、5和6的變異體，其中單獨多核苷酸已被優化以在大腸桿菌中表達。表汰載體本發明的多核苷酸可包含在任何合適載體中，諸如表達載體或克隆載體。有多種載體可用，且可選擇適合于特定目的的任何載體。可通過多種方法將適當的核酸序列插入載體中，例如，可采用本領域熟知的技術將DNA插入適當的限制性酶切位點處。除與本發明有關的核酸序列之外，載體還可進一步包含信號序列，復制起始位點，一個或多個標記基因，增強子元件，啟動子以及轉錄終止序列中的一種或多種。載體也可包含其他序列，諸如增強子、聚腺苷酸(poly-Α)尾、接頭、多接頭、可操作接頭、多克隆位點(MCS)、終止密碼子、內部核糖體進入位點(IRES)以及用于整合的宿主同源序列或其他限定的元件。載體優選為表達載體，包含有效連接到調控核酸序列的核酸，調控核酸序列引導該核酸在合適細胞中表達。
在優選的實施方式中，本發明的載體為質粒載體，諸如真核質粒載體，更優選為原核質粒載體。在另一優選的實施方式中，載體也可為病毒載體，優選為源自逆轉錄病毒科(Retroviridae)，諸如慢病毒，例如HIV，諸如SIV，例如EAIV，諸如CIV0在又一優選的實施方式中，載體可選自，但不限于，包含α病毒、腺病毒、腺相關病毒、桿狀病毒、HSV、冠狀病毒、牛乳頭瘤病毒、Mo-MLV的群組，優選為腺相關病毒。在另一優選實施方式中，本發明的載體包含啟動子，更優選其中所述啟動子優選連接至本發明的多核苷酸。在優選的實施方式中，所述啟動子選自，但不限于，原核啟動子，優選其中原核啟動子包含其他元件，諸如RNA聚合酶結合位點，例如Pribnow盒或其部分,諸如_35元件或其部分。本發明的原核載體可以用于使失活的GtxA在例如大腸桿菌中重組表達。由于大腸桿菌不含有GtxC基因，所以在大腸桿菌中表達的GtxA未經適當酰化且因此無毒性。在另一優選的實施方式中，所述啟動子選自，但不限于，真核啟動子，優選其中的真核啟動子包含其他元件，諸如RNA聚合酶結合位點,例如TATA盒或其部分,諸如至少一個用于任一真核轉錄因子的結合位點。本發明載體的優選實施方式是裸DNA疫苗，其包含有效連接至本發明的多核苷酸的真核啟動子。疫苗一般而言，疫苗是能夠在具有功能性免疫系統的活標本中誘導免疫反應的物質或組合物。組合物可包含以下一種或多種“活性成分”，諸如抗原(例如蛋白質、多肽、肽、核酸及其類似物)、除了其他元件外還包含一種或多種抗原的核酸構建體、細胞、(例如負載APC、繼承性轉移的T細胞)、復合物分子(抗體、TCR及MHC復合物等)、運載體、佐劑以及藥物運載體。本發明涉及疫苗組合物，其包含來自雞卡氏桿菌的本發明的分離的多肽，優選包含多肽的失活形式，或其免疫原性變異體或片段。本文所用術語“疫苗”是指用于誘導針對源自雞卡氏桿菌的特異性免疫目的的獸用醫學疫苗。本發明涉及疫苗組合物，其包含SEQ ID No. 1、2或3的多肽、所述多肽的失活形式、其功能性同系物、具有至少70%的序列同一性的多肽或所述多肽的免疫原性活性片段。將所述疫苗稱為類毒素疫苗。類毒素疫苗是使用喪失毒性但保留免疫原性的毒素激發目標生物體的免疫反應，以使所述目標生物體對將來由源自相同或相似細菌物種的毒素或相似毒素所致的感染具有抵抗力的疫苗。在優選的實施方式中，所述疫苗包含失活的多肽，所述多肽就毒性而言是失活的，但保留免疫原性，其優選通過熱，更優選通過暴露于化學品諸如甲醛，更優選通過表達呈未酰化形式的SEQ ID No. I多肽而失活。在另一優選的實施方式中，疫苗進一步包含失活或活減毒雞卡氏桿菌。在又一優選的實施方式中，本發明進一步涉及至少一種來自對禽類物種具有病原性的病毒或微生物的其他抗原，其中所述病毒或微生物是選自但不限于由傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)、雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)、傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)、雞貧血因子(Chicken Anaemiaagent)、禽類呼腸孤病毒(Avian Reovirus)、禽肺炎病毒(Avian Pneumovirus)、雞痘病毒(Chicken Poxvirus)、禽腦脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus)、雞敗血支原體 (Mycoplasma gallisepticum)、副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum)、多殺性巴斯德菌(Pasteurella multocida)和大腸桿菌(Eschericia coli)構成的組。當將諸如毒素的抗原引入宿主生物體中時，通常使用其他組分來增強免疫反應。這些組分通常稱作佐劑。本發明的疫苗組合物優選包含佐劑和/或載體。佐劑是混合在疫苗組合物中增強或以別的方式改良對GtxA多肽或其免疫原性片段的免疫反應的任何物質。運載體是能夠與GtxA多肽或其免疫原性片段締合且有助于呈遞抗原的骨架結構，例如多肽或多糖。因此，在優選的實施方式中，本發明的疫苗組合物包含選自但不限于由弗氏完全佐劑和不完全佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、quil A、礦物油及非礦物油、植物油及聚羰乙烯構成的組中的佐劑和/或運載體。本發明的疫苗組合物可通過若干途徑施用，例如通過肌肉內或皮下注射，透過例如食物或水口服，諸如通過氣霧劑，例如通過例如在足部或翼部劃痕，諸如通過滴眼劑，例如通過卵內投藥來施用。禽類巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae)的大部分成員以共生菌形式在恒溫動物，優選在禽類的粘膜中存活。卡氏桿菌(Gallibacterium)屬的成員包括共生及病原性菌株，其中病原性菌株主要引起禽類宿主呼吸道及生殖道的疾病。在優選的實施方式中，本發明涉及本發明的多肽、本發明的多核苷酸以及本發明的載體，其用于治療恒溫動物，優選為禽類物種諸如鴨屬(Anas)，例如雁屬(Anser)，諸如潛鴨屬(Aythya)，例如麝鴨屬(Biziura),諸如黑雁屬(Branta),例如天鵝屬(Cygnus)，諸如燕尾區鳥屬(Creagrus),例如噪El屬(Gelochelidon),諸如El屬(Larus),例如白||屬(Pagophila),諸如叉尾區鳥屬(Xemaes)，例如鸛科(Ciconiidae)，諸如鴻屬(Columba)，例如地鳩屬(Columbina)，諸如黃鳩屬(Ducula),例如雞鳩屬(Gallicolumba),諸如姬地鳩屬(Geopelia),例如鵓鳩屬(Geotrygon),諸如鳳冠鳩屬(Goura)，例如山鳩屬(Gymnophaps),諸如新西蘭鳩屬(Hemiphaga),例如棕翅鳩屬(Leptotila),諸如巨地鳩屬(Leucosarcia),例如胃$鳩屬(Macropygia),諸如裸臉原鳩屬(Metriopelia),例如冠鳩屬(Ocyphaps),諸如小長尾鳩屬(Oena),例如斑尾鴻屬(Patagioenas),諸如褐果鳩屬(Phapitreron),例如果鳩屬(Ptilinopus),諸如印加地鳩屬(Scardafella),例如斑鳩屬(Streptopelia),諸如綠鳩屬(Treron),例如森鳩屬(Turtur),諸如哀纟鳥屬(Zenaida),例如冠冢雉屬(Aepypodius),諸如叢冢雉(Alectura),例如雉科(Phasianidae),諸如松雞亞科(Tetraoninae),例如鶴鶘科(Pelecanidae),諸如紅鸛科(Phoenicopteridae),例如鳳頭鶴踏科(Cacatuidae),諸如吸蜜鶴踏科(Loriidae),例如鶴踏科(Psittacidae),諸如鴯鹋科(Dromaiidae),例如小美洲能屬(Pterocnemia),諸如大美洲能屬(Rhea),例如能鳥科(Struthionidae)的細菌感染。在更優選的實施方式中，本發明的多肽、本發明的多核苷酸以及本發明的載體可用于治療選自由鴨、火雞和雞，優選產蛋母雞構成的組的禽類物種的細菌感染。技述為了檢測本發明的多肽或其免疫原性片段的存在，產生能夠特異性結合至所述多肽或其免疫原性片段的抗體是有用的。所述抗體可結合至單獨多肽上的任一表位。
在優選的實施方式中，所述抗體可以是源自血清的多克隆抗體或單克隆或重組抗體，其中抗體包含抗體的抗原結合片段諸如Fv、scFv、Fab、Fab’或F (ab) 2,多聚形式諸如二聚IgA分子或五價IgM,親和抗體或雙價抗體。在優選的實施方式中，本發明涉及IgA抗體，最優選為雞IgA抗體。因此，在優選的實施方式中，本發明涉及能夠特異性結合至SEQ ID No. 1、2或3的多肽的抗體。在另一優選的實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含與SEQ ID No. I至少70%的序列同一性的多肽的抗體，更優選與SEQ ID No. I有75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99 %的序列同一性。在又一優選實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含與SEQ ID No. 2至少70%的序列同一性的多肽的抗體，更優選與SEQ ID No. 2有75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性,例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。在另一優選實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含與SEQ ID No. 3至少70%的序列同一性的多肽的抗體，更優選與SEQ ID No. 3有75%的序列同一性，例如至少80%的序列同一性，諸如至少85%的序列同一性，例如至少90%的序列同一性，諸如至少95%的序列同一性,例如至少96%的序列同一性，諸如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，諸如至少99%的序列同一性。在另一優選的實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含SEQ ID No. 1、2和3中任一多肽的免疫原性片段的多肽的抗體，該片段由至少150個連續氨基酸組成，優選由至少200個連續氨基酸,更優選由至少300個連續氨基酸,更優選由至少500個連續氨基酸,更優選由至少750個連續氨基酸,更優選由至少1000個連續氨基酸,更優選由至少1250個連續氨基酸，更優選由至少1500個連續氨基酸,更優選由至少1750個連續氨基酸,更優選由至少2000個連續氨基酸組成。
在又一優選的實施方式中，本發明涉及能夠結合至包含免疫原性片段的多肽的抗體，其中該片段可含有至多30個氨基酸取代，更優選至多25個取代，更優選至多20個取代，更優選至多15個取代，更優選至多10個取代，更優選至多5個取代，諸如4、3、2或I個取代。皿診斷性檢測試劑盒是實施與本發明相關的診斷方法的所有組分的集合。在優選的實施方式中，本發明涉及檢測試劑盒，其中在生物樣本中檢測到由卡氏桿菌屬的細菌物種的存在所引起的細菌感染的指示。所述指示可以是SEQ ID No. 1、2或3中任一多肽或其功能性變異體，或針對任一所述多肽的抗體的存在。在優選的實施方式中，可通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)來檢測所述多肽或抗體的存在。ELISA是用于檢測樣本中蛋白質或任何其他抗原的存在的定量技術。在ELISA中，將未知量的抗原固定至表面，隨后用特異性抗體沖刷表面，以便特異性抗體可結合至抗原。 將此抗體連接至酶，且在最終步驟中，添加用該酶可以使其轉化為某些可檢測信號的物質。存在有如下幾種類型的ELISA 間接ELISA夾心ELISA競爭ELISA反向ELISA其他基于免疫的分析法也可用于檢測樣本中的所述多肽或抗體，諸如化學發光免疫檢測及解離增強鑭系免疫分析法。本發明進一步涉及診斷檢測試劑盒，其用于檢測本發明的任一多核苷酸或對雞卡氏桿菌GtxA具有特異性的其他特定DNA或RNA序列的存在。因此，在優選的實施方式中，本發明涉及用于檢測所述多核苷酸的聚合酶鏈反應(PCR)或實時(RT)-PCR法。PCR是在若干數量級上擴增一段DNA并進而最終檢測出其單個或少量副本，從而產生特定DNA序列的數千個至數百萬個副本的技術。該方法依賴于熱循環、其由反復加熱及冷卻反應物以使DNA熔融以及進行DNA酶促復制的循環組成。含有與目標區域互補的序列的引物(短DNA片段)以及DNA聚合酶是使得選擇性及重復擴增成為可能的關鍵組分。隨著PCR進行，所產生的DNA本身可作為復制模板，從而開始使DNA模板呈指數擴增的鏈式反應。多肽、多核苷酸及表達載體的醫學用途作為類毒素疫苗的失活毒素通常用于治療和/或預防性治療細菌感染，主要用于獸醫應用，優選用于治療家禽群體。采用類毒素疫苗的目的在于調節免疫系統，以使其不對抗侵入的細菌而對抗由侵入的細菌產生的毒素。因此，本發明的GtxA多肽、編碼GtxA多肽的多核苷酸或表達載體可用于產生類毒素疫苗，其可用作治療和/或預防性治療由分泌GtxA毒素和/或類似毒素的細菌引起的病原性病況。在特定的實施方式中，對禽類提供被動免疫的劑量為每劑約O. 25ml疫苗。在另一實施方式中，劑量為每劑約0.4ml疫苗。在再一實施方式中，劑量為每劑約0.6ml疫苗。在一實施方式中，劑量為每劑約O. 5ml疫苗。在一個實施方式中，禽類是選自，但不限于，由鴨、火雞和雞所構成的組。在另一優選的實施方式中，禽類為產蛋母雞。本發明也提供對禽類施用本發明的疫苗，以保護禽類免受多種疾病侵襲的方法，這是通過將其他疫苗納入組合物中來完成的。本發明包括對禽類，優選為鴨、火雞或雞，更優選為產蛋母雞，接種疫苗以提供針對GtxA毒素的主動免疫。小雞和/或幼禽在生命早期接受疫苗接種，在約I天大或稍微更大些時(在出生第一周內)經單劑或兩劑疫苗接種。實現主動免疫的適當疫苗劑量可以在約O. 05ml至約O. 5ml范圍內變化。在特定實施方式中，疫苗劑量為約O. 05ml至約O. Iml0預期各禽類需要接受疫苗接種一次以上，諸如在1-3個月內接受兩次疫苗接種。為了終身保護例如產蛋母雞，可能需要每年再接種。在進一步的實施方式中，可以對禽類施用本發明的毒素或其免疫原性片段。同樣地，用作本發明的疫苗的GtxA毒素或其免疫原性片段的劑量范圍可為每劑每千克體重約 I μ g至每千克體重約1000 μ g,示例性范圍是每只動物每劑每公斤體重約10 μ g至每公斤體重約ΙΟΟμ go表I.引物列表。用于構建及驗證gtxA突變體的引物。下劃線為限制性位點。
引物名稱引物序列(5’-3’)__SEQIDNO
4240TATCGTCGACTATCCATCGCGGCATCAG7
4242AGCTGAATTCAAGCAAGTGCTATTGCTACCG 8
4243AGCTGAATTCTTATGTCGGCGATCAAACAA 94245 TATGTCTAGAGGCGTTGGTGGATAAGAGAT 10kanR CGATAGATTGTCGCACCTGA11kanF TATGGAACTGCCTCGGTGA 1239F TGATGCAATCAAAGATAAAGTCG 135734R AATCGGCATTGGAGCTTTC 142871F AACCAAACCAATCCAAGGT 15
3270R_ATTGCCGTCTTTGCCTACTG_16_表II.用于在大腸桿菌中表達的構建體的引物列表。下劃線為限制性位點。粗體指示通過重疊延伸來拼接的重疊區域。
權利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含選自以下群組中的氨基酸序列a)SEQID No. 1、2 或 3 ; b)選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及 c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是所述序列中不超過30個所述氨基酸被如此改變。
2.如權利要求I所述的多肽，其為選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的序列的天然存在的等位基因變異體。
3.如權利要求I所述的多肽，其中所述多肽包含源自巴斯德桿菌科，更優選為源自卡氏桿菌屬，更優選選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組的氨基酸序列。
4.如權利要求I所述的多肽，其為在此描述的變異多肽，其中所選序列中指定的任一氨基酸被改變以提供保守性取代。
5.如權利要求I所述的多肽，其中所述信號肽由異源信號肽置換。
6.如權利要求I所述的多肽，其與SEQID No. I具有至少70%的序列同一性，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. I的序列的多肽。
7.如權利要求I所述的多肽，其與SEQID No. 2具有至少70%的序列同一性，更優選為至少75 %，更優選為至少80 %，更優選為至少85 %，更優選為至少90 %，更優選為至少95%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 2的序列的多肽。
8.如權利要求I所述的多肽，其與SEQID No. 3具有至少70%的序列同一性，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少95%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 3的序列的多肽。
9.如權利要求I所述的多肽，或其片段，其中所述片段包含至少150個氨基酸，優選為至少200個氨基酸，更優選為至少300個氨基酸，更優選為至少500個氨基酸，更優選為至少750個氨基酸，更優選為至少1000個氨基酸，更優選為1250個氨基酸，更優選為1500個氨基酸，更優選為1750個氨基酸，最優選為2000個氨基酸。
10.如權利要求I所述的多肽，其中所述多肽已經過特定修飾而移除毒性活性。
11.如權利要求I所述的多肽，其中所述變異體是具有生物活性的。
12.如權利要求11所述的多肽，其中生物活性為毒性，其中所述毒性包含在接受體內形成孔，更優選為細胞毒性，更優選為細胞溶解性細胞毒性，甚至更優選為溶血性細胞毒性。
13.如權利要求9至11所述的多肽，其中所述變異體具有免疫原性。
14.如權利要求9所述的多肽，其中所述片段與SEQID NO I相比含有不超過30個氨基酸取代，更優選為不超過25個，更優選為不超過20個，更優選為不超過15個，更優選為不超過10個，更優選為不超過5個，更優選為不含氨基酸取代。
15.如前所述的權利要求中任一項所述的多肽，其進ー步包含親和性標簽，諸如polyHis標簽、GST標簽、HA標簽、FLAG標簽、C-myc標簽、HSV標簽、V5標簽、麥芽糖結合蛋白標簽、纖維素結合域標簽、BCCP標簽、鈣調蛋白標簽、Nus標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶標簽、綠色滅光蛋白標簽、硫氧還蛋白標簽、S標簽、Strep標簽。
16.如權利要求15所述的多肽，其中任一親和性標簽是可切割的。
17.如權利要求I至16中任一項所述的多肽，其為失活的。
18.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽通過熱或輻射而失活。
19.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽為化學失活的，優選通過暴露于甲醛而化學失活。
20.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽是SEQID No. I的未酰化形式。
21.如權利要求17所述的多肽，其中所述多肽或其任一片段具有免疫原性。
22.如前所述權利要求中任一項所述的多肽，作為藥物的應用。
23.如權利要求22所述的應用，其用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。
24.如權利要求22或23所述的應用，其中所述細菌感染是在恒溫動物中。
25.如權利要求22或23所述的應用，其中所述恒溫動物為禽類物種。
26.如權利要求22或23所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨科，更優選為鴨屬、雁屬、潛鴨屬、麝鴨屬、黑雁屬或天鵝屬；鵒形目，更優選為燕尾鷗屬、噪鷗屬、鷗屬、白鷗屬或叉尾鷗屬；鸛形目，更優選為鸛科；鴿形目，更優選為鴿屬、地鳩屬、黃鳩屬、雞鳩屬、姬地鳩屬、鶉鳩屬、鳳冠鳩屬、山鳩屬、新西蘭鳩屬、棕翅鳩屬、巨地鳩屬、鵑鳩屬、裸臉原鳩屬、冠鳩屬、小長尾鳩屬、斑尾鴿屬、褐果鳩屬、果鳩屬、印加地鳩屬、斑鳩屬、綠鳩屬、森鳩屬或哀鴿屬；雞形目，更優選為冠冢雉屬、叢冢雉、雉科或松雞亞科；鵜形目，更優選為鵜鶘科；紅鸛目，更優選為紅鸛科；鸚形目，更優選為鳳頭鸚鵡科、吸蜜鸚鵡科或鸚鵡科；鶴鴕目，更優選為鴯鹋科；美洲鴕鳥目，更優選為小美洲鴕屬或大美洲鴕屬；能形目，更優選為鴕鳥科構成的組。
27.如權利要求22或23所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨、火雞及雞構成的組，優選為產蛋母雞。
28.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下群組中的核酸序列a)SEQID No. 4、5 或 6 ; b)選自由SEQID No. 4、5和6所構成的組的核苷酸的序列變異體，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少60%的序列同一性； c)由a)中的任一者的至少450個連續核苷酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一核苷酸改變為不同核苷酸，限制條件是所述序列中不超過90個所述核苷酸被如此改變； d)能夠在高嚴格條件下與跟SEQID No. 4、5或6互補的多核苷酸雜交的多核苷酸； e)編碼SEQID No. I、2或3的多肽的多核苷酸； f)編碼選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體的多核苷酸，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及 g)編碼由SEQID No. 1、2或3中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段的多核苷酸，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是所述序列中不超過30個所述氨基酸被如此改變。
29.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含天然存在的等位基因核酸變異體的核苷酸序列。
30.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼源自卡氏桿菌屬，更優選為選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組的氨基酸序列的核酸序列。
31.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述編碼的多肽與SEQID No. 4具有至少60 %的序列同一性，更優選為至少65 %，更優選為至少70 %，更優選為至少75 %，更優選為至少80 %，更優選為至少85 %，更優選為至少90 %，更優選為至少85 %，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 4序列的多核苷酸。
32.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述編碼的多肽具有與SEQID No. 5具有至少60%的序列同一性，更優選為至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80 %，更優選為至少85 %，更優選為至少90 %，更優選為至少85 %，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 5序列的多核苷酸。
33.如權利要求28所述的多核苷酸，其中所述編碼的多肽具有與SEQID No. 6具有至少60%的序列同一性，更優選為至少65%，更優選為至少70%，更優選為至少75%，更優選為至少80%，更優選為至少85%，更優選為至少90%，更優選為至少85%，更優選為至少98%，更優選為具有所述SEQ ID No. 6序列的多核苷酸。
34.如權利要求28至33中任一項所述的多核苷酸，其經最優化以在大腸桿菌中表達。
35.如權利要求28至34中任一項所述的多核苷酸，作為藥物的應用。
36.如權利要求35所述的應用，其用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。
37.如權利要求35或36所述的應用，其中所述細菌感染是在恒溫動物中。
38.如權利要求35或36所述的應用，其中所述恒溫動物為禽類物種。
39.如權利要求35或36所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨科，更優選為鴨屬、雁屬、潛鴨屬、麝鴨屬、黑雁屬或天鵝屬；鵒形目，更優選為燕尾鷗屬、噪鷗屬、鷗屬、白鷗屬或叉尾鷗屬；鸛形目，更優選為鸛科；鴿形目，更優選為鴿屬、地鳩屬、黃鳩屬、雞鳩屬、姬地鳩屬、鶉鳩屬、鳳冠鳩屬、山鳩屬、新西蘭鳩屬、棕翅鳩屬、巨地鳩屬、鵑鳩屬、裸臉原鳩屬、冠鳩屬、小長尾鳩屬、斑尾鴿屬、褐果鳩屬、果鳩屬、印加地鳩屬、斑鳩屬、綠鳩屬、森鳩屬或哀鴿屬；雞形目，更優選為冠冢雉屬、叢冢雉、雉科或松雞亞科；鵜形目，更優選為鵜鶘科；紅鸛目，更優選為紅鸛科；鸚形目，更優選為鳳頭鸚鵡科、吸蜜鸚鵡科或鸚鵡科；鶴鴕目，更優選為鴯鹋科；美洲鴕鳥目，更優選為小美洲鴕屬或大美洲鴕屬；能形目，更優選為鴕鳥科構成的組。
40.如權利要求35或36所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨、火雞及雞構成的組，優選為產蛋母雞。
41.包含權利要求28至34中任一項所述的多核苷酸的載體。
42.如權利要求41所述的載體，其進ー步包含有效連接至所述多核苷酸的啟動子。
43.如權利要求41或42所述的載體，其中所述啟動子選自由原核啟動子所構成的組。
44.如權利要求43所述的載體,其中所述啟動子包含轉錄起始位點及RNA聚合酶結合位點。
45.如權利要求43所述的載體,其中所述啟動子包含Pribnow盒或其部分。
46.如權利要求43所述的載體，其中所述啟動子包含-35元件或其部分。
47.如權利要求41或42所述的載體，其中所述啟動子選自由真核啟動子所構成的組。
48.如權利要求47所述的載體,其中所述啟動子包含轉錄起始位點及RNA聚合酶結合位點。
49.如權利要求47所述的載體，其中所述啟動子包含TATA盒。
50.如權利要求47所述的載體，其中所述啟動子包含至少ー個任一真核轉錄因子的結合位點。
51.如權利要求41或42所述的載體，所述載體為病毒載體或質粒載體。
52.如權利要求51所述的載體，所述質粒載體為真核質粒載體或原核質粒載體。
53.如權利要求41或42所述的載體，所述載體選自由源自包括慢病毒、HIV、SIV、FIV、EAIV和CIV的逆轉錄病毒科的載體構成的組。
54.如權利要求41或42所述的載體，選自由a病毒、腺病毒、腺相關病毒、桿狀病毒、HSV、冠狀病毒、牛乳頭瘤病毒、Mo-MLV的載體構成的組，優選為腺相關病毒。
55.如權利要求41至54中任ー項所述的載體，作為藥物的應用。
56.如權利要求41至54中任ー項所述的載體，其用于治療和/或預防性治療由細菌感染引起的疾病、失調或任何損傷。
57.如權利要求55或56所述的應用，其中所述細菌感染是在恒溫動物中。
58.如權利要求55或56所述的應用，其中所述恒溫動物為禽類物種。
59.如權利要求55或56所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨科，更優選為鴨屬、雁屬、潛鴨屬、麝鴨屬、黑雁屬或天鵝屬；鵒形目，更優選為燕尾鷗屬、噪鷗屬、鷗屬、白鷗屬或叉尾鷗屬；鸛形目，更優選為鸛科；鴿形目，更優選為鴿屬、地鳩屬、黃鳩屬、雞鳩屬、姬地鳩屬、鶉鳩屬、鳳冠鳩屬、山鳩屬、新西蘭鳩屬、棕翅鳩屬、巨地鳩屬、鵑鳩屬、裸臉原鳩屬、冠鳩屬、小長尾鳩屬、斑尾鴿屬、褐果鳩屬、果鳩屬、印加地鳩屬、斑鳩屬、綠鳩屬、森鳩屬或哀鴿屬；雞形目，更優選為冠冢雉屬、叢冢雉、雉科或松雞亞科；鵜形目，更優選為鵜鶘科；紅鸛目，更優選為紅鸛科；鸚形目，更優選為鳳頭鸚鵡科、吸蜜鸚鵡科或鸚鵡科；鶴鴕目，更優選為鴯鹋科；美洲鴕鳥目，更優選為小美洲鴕屬或大美洲鴕屬；能形目，更優選為鴕鳥科構成的組。
60.如權利要求55至56所述的應用，其中所述禽類物種選自由鴨、火雞及雞構成的組，優選為產蛋母雞。
61.一種分離的宿主細胞，其經如所述權利要求41至54中任一項中的所述載體轉化或轉導。
62.如權利要求61所述的宿主細胞,選自由大腸桿菌、酵母菌屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、Sf9 昆蟲細胞構成的組；更優選為 CH0、CH0-Kl、HEI193T、HEK293、C0S、PC12、HiB5、RN33b 或BHK細胞。
63.能夠生產權利要求53或54中任ー項的傳染性病毒粒子的包裝細胞系。
64.ー種抗體，其能夠特異性結合至具有選自以下群組中的氨基酸序列的分離的多肽a)SEQID No. 1、2 或 3 ; b)選自由SEQID No. 1、2和3構成的組的氨基酸序列的序列變異體，其中所述變異體與所述SEQ ID No.具有至少70%的序列同一性；以及 c)由a)中的任一者的至少150個連續氨基酸所組成的片段，其中所選序列中指定的任一氨基酸改變為不同氨基酸，限制條件是所述序列中不超過30個所述氨基酸被如此改變。
65.如權利要求64所述的抗體，其中所述抗體為禽類抗體，優選為雞抗體。
66.如權利要求64所述的抗體，其中所述抗體為多克隆、血清源性抗體或單克隆或重組抗體。
67.如權利要求64所述的抗體，其中抗體包含抗體的抗原結合片段諸如Fv、scFv、Fab、Fab’或F(ab)2,多聚形式諸如ニ聚IgA分子或五價IgM,親和抗體或雙價抗體。
68.一種使權利要求I至21中任一項所述的分離的多肽失活的方法，其中所述方法包含使用熱或化學品，優選為甲醇，或其中所述方法包含以未酰化形式表達所述多肽。
69.如權利要求68所述的方法，其中所述失活的多肽具有免疫原性。
70.ー種疫苗組合物，包含權利要求I至21中任一項所述的分離的多肽。
71.ー種疫苗組合物，包含權利要求28至34中任一項所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸以裸DNA或以載體形式使用。
72.如權利要求70和71所述的疫苗組合物，進ー步包含一種或多種適合的佐劑、賦形齊U、乳化劑或載體。
73.如權利要求70和71所述的疫苗組合物，進ー步包含來自對權利要求26所述的禽類物種具病原性的病毒或微生物的至少ー種其他抗原。
74.如權利要求73所述的疫苗組合物，其中所述病毒或微生物選自由傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、雞貧血因子、禽類呼腸孤病毒、禽肺炎病毒、雞痘病毒、禽腦脊髄炎病毒、雞敗血支原體、副雞嗜血桿菌、多殺性巴斯德菌和大腸桿菌構成的組。
75.如權利要求70所述的疫苗組合物，其中所述多肽與SEQID No. I的未酰化形式相同。
76.如權利要求70所述的疫苗組合物，其中所述多肽或其任何片段具有免疫原性。
77.如權利要求70和71所述的疫苗組合物，進ー步包含活的、減毒的雞卡氏桿菌。
78.一種將權利要求70至77中任一項所述的疫苗施與權利要求26所述的禽類物種的方法，其中所述疫苗通過肌肉內或皮下注射，透過例如食物或水口服，氣霧劑，在例如足或翼部劃痕，滴眼劑或經卵內投藥來施用。
79.如權利要求78所述的方法，其中所述禽類物種接種疫苗至少一次，諸如至少兩次，例如至少三次。
80.如權利要求78和79中任一項所述的方法，其中各疫苗劑量每劑含有每千克體重約I U g至每千克體重約IOOOii g的蛋白質，優選為每劑每公斤體重約IOii g至每公斤體重約100 u go
81.如權利要求78和79中任一項所述的方法，其中，其中疫苗的各單位劑量為約0.Iml至約2ml，諸如約0. 25ml至約lml，例如約0. 5ml。
82.如權利要求I至21所述的多肽，作為診斷性標記的應用。
83.—種診斷禽類物種的病原性細菌卡氏桿菌感染的方法，所述方法包含檢測權利要求I至9中任一項所述的多肽，檢測針對所述多肽的抗體，或檢測權利要求28至33中任一項的多核苷酸。
84.如權利要求83所述的方法，其中所述病原性細菌是來卡氏桿菌屬，更優選為選自由雞卡氏桿菌、卡氏桿菌基因種I及卡氏桿菌基因組2構成的組。
85.如權利要求83所述的方法，其中所述方法包含針對所述多肽的抗體的檢測，優選其中所述抗體為IgA。
86.—種檢測權利要求I至9所述的多肽的試劑盒，所述試劑盒包含至少ー種能夠結合所述多肽的結合蛋白，所述結合蛋白連接至固體支持物。
87.如權利要求86所述的試劑盒，所述試劑盒包含另ー結合蛋白，其中一種結合蛋白連接至可檢測部分。
88.如權利要求86所述的試劑盒，其中所述固體支持物為微粒。
89.如權利要求86所述的試劑盒，其中所述結合蛋白是針對權利要求I至9中任ー項所述的多肽的抗體。
90.如權利要求86所述的試劑盒，其中所述試劑盒能夠檢測所述多肽的量。
91.一種檢測針對權利要求I至9中任一項所述的多肽的抗體的試劑盒，其中所述試劑盒包含已固定至固體表面的所述多肽。
92.如權利要求91所述的試劑盒，其中所述抗體為IgA型。
93.ー種轉基因敲除微生物，其中內源基因已被破壞而消除功能性gtxA的表達和/或分泌，且其中所述微生物所展現的致病性相對于同一種類的野生型微生物而言有所降低。
94.如權利要求93所述的微生物，其中所述微生物為雞卡氏桿菌。
95.如權利要求93或94所述的微生物，其中所述gtxA基因已被破壞。
96.如權利要求93或94所述的微生物，其中所述gtxBD基因已被破壞。
全文摘要
本發明涉及動物健康且特別是由卡氏桿菌屬(Gallibacterium spp)，包括雞卡氏桿菌(Gallibacterium anatis)、卡氏桿菌基因種1(Gallibacterium genomospecies 1)和卡氏桿菌基因種2(Gallibacterium genomospecies 2)所引起的新細菌性家禽疾病的病原體領域。本發明提供來自卡氏桿菌物種的新型RTX毒素，將該新型毒素稱為GtxA(卡氏桿菌毒素)。此外，本發明提供GtxA的氨基酸及核苷酸序列，包含失活類毒素或類毒素片段的疫苗，以及免疫禽類來預防該疾病的方法及禽類的雞卡氏桿菌感染的診斷方法。
文檔編號A61K39/102GK102781954SQ201080045643
公開日2012年11月14日 申請日期2010年10月7日 優先權日2009年10月9日
發明者博迪爾·瑪麗·克里斯滕森, 安德斯·麥基·玻約森 申請人:哥本哈根大學
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