專利名稱：同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞及制法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種酶，編碼該酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，從前述重組宿主細胞中純化該酶的方法，以及包括上述酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，編碼該同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，從前述重組宿主細胞中純化該酶的方法，以及包括上述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。
背景技術：
甲基轉(zhuǎn)移酶是生命活動中起關鍵調(diào)節(jié)作用的酶，它可以將S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 上的甲基轉(zhuǎn)移到底物分子上，生成多種重要的含甲基生理活性物質(zhì)，達到功能調(diào)節(jié)的目的。 同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 1. 1. 10)是甲基轉(zhuǎn)移酶中的一種，可以用于同型半胱氨酸 (HCY)生化診斷試劑的配制，是一種關鍵原料酶。現(xiàn)有的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶主要從釀酒酵母中提取，存在酶產(chǎn)率低，純化困難、熱穩(wěn)定性差(保存溫度超過40°C即完全失活)等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶耐熱性差、產(chǎn)率低純化困難的缺點，提供一種耐熱性好、產(chǎn)率高且容易純化的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。本發(fā)明的第三個目的是提供包括所述核苷酸序列的重組載體。本發(fā)明的第四個目的是提供包括所述重組載體的重組宿主細胞。本發(fā)明的第五個目的是提供包括上述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發(fā)明的發(fā)明人付出了大量地創(chuàng)造性勞動，從白色念珠菌(Candida albicans SC5314)中得到本發(fā)明具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶， 并且利用隨機突變的方法得到本發(fā)明具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。并且本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，所得兩種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶都具有很好的耐熱性，能在寬的溫度范圍內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了一種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其中，所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2) SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者(3)對(1)或( 所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的功能不變的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述核苷酸序列的重組載體。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述重組載體的重組宿主細胞。本發(fā)明還提供了從前述重組宿主細胞中純化該酶的方法。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發(fā)明提供的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶具有耐熱性好的優(yōu)點。參見圖3可知，本發(fā)明的兩種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在40°C下于pH6. 0的緩沖液中靜置15分鐘后仍都具有60%以上的相對活性，其中，本發(fā)明具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在45°C下于pH6. 0的緩沖液中靜置15分鐘后仍都具有50%以上的相對活性。


圖1實施例1的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因純化的瓊脂糖凝膠鑒定照片；圖2實施例1的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在IPTG誘導后表達與純化的SDS-PAGE 鑒定照片，其中，M泳道為分子量標記，第1泳道為未受IPTG誘導的蛋白表達，第2泳道為 IPTG誘導后的蛋白表達，從中明顯可以看出，在第2泳道中，目標蛋白質(zhì)同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶得到了大量表達；圖3實施例1和2同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其中，所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2) SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，或者(3)對(1)或( 所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的功能不變的氨基酸序列。本領域人員公知，組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸殘基，按照側(cè)鏈極性可以分成四類1、非極性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、極性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸 (Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、帶正電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)；4、帶負電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見“生物化學”(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質(zhì)中如果發(fā)生同屬一個類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代lie，所述殘基在蛋白質(zhì)結構域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水囊袋結構的作用)沒有改變，因此對蛋白質(zhì)的立體結構并不會產(chǎn)生影響，因此仍然可以實現(xiàn)蛋白的功能。例如，本領域技術人員公知，Ala 禾口 Ser、Val 禾口 He、Asp 禾口 Glu、Ser 禾口 Thr、Ala 禾口 Gly、Ala 禾口 Thr、Ser 禾口 Asn、 Ala 禾口 Val、Ser 禾口 Gly、Tyr 禾口 Phe、Ala 禾口 Pro、Lys 禾口 Arg、Asp 禾口 Asn、Leu 禾口 lie、Leu 禾口 Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會影響蛋白的立體結構和功能。所述同屬一個類別的氨基酸殘基取代可以發(fā)生在同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶上的任意一個氨基酸殘基位置上。相反，不同類別的氨基酸殘基發(fā)生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列舉的取代規(guī)律，很可能會使蛋白的結構發(fā)生變化，功能出現(xiàn)差異。本發(fā)明提供的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶還可以進行修飾或突變，得到衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述“衍生的蛋白質(zhì)”指與具有上述氨基酸序列的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶存在氨基酸序列上的差異，或者有不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導的遺傳變異體。所述誘導變異體可以通過各種技術得到，如輻射或誘變劑等產(chǎn)生的隨機突變，也可以通過如定點突變法或其他已知分子生物學的技術獲得。所述“衍生的蛋白質(zhì)”還包括具有天然L型氨基酸的殘基的類似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、Y-氨基酸等)的類似物。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的蛋白的化學衍生形式，如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過將蛋白暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。優(yōu)選情況下，所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。本領域公知，組成蛋白質(zhì)的20種不同的氨基酸中，除Met (ATG)或Trp (TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆， 冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡并性，決定一個氨基酸的密碼子大多不止一個，三聯(lián)體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本領域人員根據(jù)公知的密碼子表，從本發(fā)明公開的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性不變的氨基酸序列，完全可以推導出能夠編碼它們的基因的核苷酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核苷酸序列，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約， 美國，第二版，1989)進行，通過修改本發(fā)明提供的核酸序列，得到與本發(fā)明所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性一致的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，本發(fā)明所述核苷酸序列為(1) SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或者(2) SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列；或者(3)對SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶功能不變。本發(fā)明提供的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明所提供的核苷酸序列和重組工程菌，可以很容易獲得模板和引物，利用PCR進行擴增獲得有關序列。序列較長時，可以進行兩次或多次PCR擴增， 然后將所得片段按正確次序拼接。一旦獲得了有關核苷酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關氨基酸序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉(zhuǎn)入基因工程菌中，然后通過常規(guī)的方法從增殖后的宿主細胞分離得到有關核苷酸序列。此外，還可用公知的人工化學合成的方法來合成有關核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述核苷酸序列的重組載體。本領域公知，所述重組載體一般包括空載體和插入該空載體的目的基因，所述目的基因為本發(fā)明所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述“空載體”(或稱“載體”)可選用本領域已知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等，本發(fā)明優(yōu)選所述空載體為Iac啟動子的載體， 更優(yōu)選所述空載體選自由PET系列載體(例如pET30a)、pUC19、pGEM和pBluescript所組成的載體組中。所述空載體可以包括多種常用的檢測標記(例如熒光標記、抗生素標記等報告基因)和酶切位點。重組載體構建可采用空載體本身多克隆位點的各種核酸內(nèi)切酶 (如對于pET30a可用NcoI和B10I等)進行酶切獲得線性質(zhì)粒，與采用相同核酸內(nèi)切酶切割的基因片段連接，獲得重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述重組載體的重組宿主細胞。可以通過本領域常規(guī)的方法將所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或者轉(zhuǎn)染到宿主細胞中， 如氯化鈣法化學轉(zhuǎn)化、高壓電擊轉(zhuǎn)化，優(yōu)選電擊轉(zhuǎn)化；所述宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞，優(yōu)選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母(如畢赤酵母)或各種動植物細胞，更優(yōu)選所述宿主細胞為本領域常用的基因工程菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。進一步優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)、BL21、TOPlO或者Dffia。最優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。所述宿主細胞的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件可以采用本領域常規(guī)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。并且大腸桿菌的培養(yǎng)基優(yōu)選包括0. 03-0. 3%的磷酸二氫鉀(或0.03-1. 5%磷酸二氫鈉)、0. 1-1%的磷酸氫二鈉(或磷酸氫二鉀)、0. 05-0. 5%的氯化銨(或0.05-1%的氯化鈉)、0. 01-0. 2%的硫酸鎂、0. 5-5%的酵母粉(酵母提取物)、0. 1-1%的蛋白胨(例如胰蛋白胨)、0. 001-2%的葡萄糖、2. 5% -10%的甘油、0. 1% -0.8%的乳糖、0. 1-2%的油酸、0. 1-1 %的卵磷脂，并且調(diào)節(jié)pH至6. 8 7. 2。優(yōu)選地，在培養(yǎng)所述宿主細胞為大腸桿菌 BL21(DE3)時，在初始培養(yǎng)基中接入5% 20%體積的0D600 = 2 4的LB種子，于37°C， 溶氧大于20%的條件下自然生長，使用氨水、硫酸調(diào)節(jié)pH6. 5 pH7. 3。當初始培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分耗盡時(即溶氧DO值升至40%時)降溫至32°C，按照60 100ml/L的比例加入補料液1開始誘導，并按照5 10ml/h/L的速率恒速補加補料液2，使用氨水調(diào)節(jié)pH。在誘導階段，每隔3士 1小時降低1 士0. 1°C，降至后恒溫至發(fā)酵結束。其中，本發(fā)明中用到的培養(yǎng)基配方依次如下種子培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。121°C滅菌20分鐘，滅菌冷卻后加入硫酸卡那霉素至終濃度50mg/L。
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發(fā)酵初始培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，磷酸氫二鉀6 12g/L、磷酸二氫鈉3 6g/ L、一水檸檬酸0. 2 lg/L、硫酸鎂0. 2 2g/L、微量元素母液1 10ml/L，調(diào)pH至6. 8 7.2，121°C滅菌20分鐘。接種前加入滅菌的葡萄糖至終濃度15 20g/L，使用氨水調(diào)pH 至6. 5 7. 3。加入硫酸卡那霉素至終濃度50mg/L。在初始培養(yǎng)基中磷酸鹽的比例為磷酸氫二鉀磷酸二氫鈉=2 1微量元素的配方為IOg FeSO4. 7H20, 2. 25g ZnSO4. 7H20, Ig CuSO4. 5H20, 0. 5gMnS04. 5H20, 0. 23g Na2B4O7. IOH2O, 2g CaCl2. 2H20，0. Ig (NH4) 6Mo7024，溶于 5M 鹽酸中。補料液1 酵母提取物250 士 50g/L、胰蛋白胨 100 士 20g/L、乳糖 10 士 2g/L，121°C 滅菌 20min。補料液2 甘油400 士 50g/L，121°C滅菌 20min。可以使用本領域常用的方法從重組宿主細胞中分離和純化同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。例如，離心分離培養(yǎng)基和重組宿主細胞，高壓勻漿破碎細胞、離心過濾去除細胞碎片， 親和層析純化同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶。對于分離純化所得的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物，可以使用本領域常用的方法進行純度鑒定。例如，考馬斯亮藍法、凱氏定氮法、雙縮脲法、Iowry法、紫外吸收法、親和層析、酶活性、抗原抗體法、電泳分析(例如十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)、沉降分析、擴散分析、恒溶度法、蛋白質(zhì)譜等。在破碎細胞時一般都會生熱，通常需要在破碎細胞的同時進行降溫，破碎細胞過程完成后需要散熱，然后才能進行下一步的純化工作；由于本發(fā)明的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶耐熱性好，破碎細胞過程無需降溫過程，即便破碎細胞后破碎細胞液的溫度能達到40-45°C，無需散熱，仍然可以直接馬上進行下一步的提純步驟。例如向破碎后的細胞液加入氯化鈣，離心(，除去大部分膜蛋白與核酸；向離心所得上清中再加入鎳離子沉淀蛋白。所得沉淀的蛋白，可以采用以下配方復溶10 50mmol/L pH7. 0 8. 0磷酸鹽緩沖液、2 20mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和5 lOmmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)。此外由于本發(fā)明的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶耐熱性好，因此還可以采用將重組細胞破碎液在40-45°C加熱15-40分鐘，然后在 8000-15000rpm離心10-20min，來除去不耐熱的雜蛋白。優(yōu)選地，采用將重組細胞破碎液在 45°C加熱30min，IOOOOrpm離心15min，來除去大部分不耐熱的雜蛋白。更優(yōu)選地，按照下列步驟純化同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(1)發(fā)酵液調(diào)pH至7.0 8.0，600 900bar勻漿一次，使目標蛋白同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶釋放出來。(2)向勻漿液中加入30 IOOmM的氯化鈣，充分攪拌混勻，5000g離心20分鐘，去
除絕大部分核酸、細胞碎片，以及部分雜蛋白。(3)向離心上清中加入1 5mM鎳離子(各種鹽形式的鎳離子)，混勻，室溫下靜置1小時，5000g離心20min，絕大部分目的蛋白在沉淀中。(4)向沉淀中加入原體積1/5 1倍體積的復溶緩沖液攪拌30分鐘左右。IOOOOg 離心20分鐘。復溶緩沖液配方為10 50mM pH7. 0 8. 0磷酸鹽緩沖液(PB)，2 20mM NAD，5 IOmM EDTA。
(5)復溶上清經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后脫鹽。脫鹽緩沖液配方為10 50mMpH7. 0 8.0PB，2 5mM EDTA。本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。優(yōu)選情況下，本發(fā)明的試劑盒包括同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，而不包括核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞。更優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒包括同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞。可以用本領域常用的方法制備同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的干粉，只要該方法能夠得到同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的干粉，并且不破壞同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的干粉的活性即可。例如使用真空減壓濃縮器得到濃縮的酶液，然后使用冷凍干燥機干燥濃縮的酶液；或者使用真空減壓干燥器等設備。同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的干粉在使用時可以通過溶解于 PH5. 0-8. 0的緩沖液體系(例如醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液，優(yōu)選pH為5. 5-7. 0)中而轉(zhuǎn)化為液體形式。本發(fā)明的試劑盒還可以包括本領域常用于測定血清同型半胱氨酸的試劑盒的成分。對應于本發(fā)明的試劑盒中的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可以是液體形式或固體干粉形式，本發(fā)明的試劑盒中的其他成分也可以是液體形式和/或固體干粉形式。例如，當本發(fā)明的試劑盒為液體形式時，反應液中可以含有0.01-0. 5mol/L pH 8. OTris-Cl鹽緩沖液、 1000-10000U/L的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、100-10000U/L的腺苷同型半胱氨酸水解酶、 100-10000U/L的腺苷脫氨酶、l-100mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、l-20mmol/L的a_酮戊二酸、1000-100000U/L的谷氨酸脫氫酶、0. 2-2mmol/L的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉(NADH)和l-20mmol/L的三(2-羧乙基)膦氯化氫(TCEP)。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選含有0.01-0. 05mol/L pH 8.0 Tris-Cl鹽緩沖液、1000-10000U/L的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、100-1000U/L的腺苷同型半胱氨酸水解酶、1000-10000U/L的腺苷脫氨酶、l-15mmol/L 的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、1. 2-10mmol/L的a_酮戊二酸、1000-10000U/L的谷氨酸脫氫酶、 0. 3-1. 5mmol/L的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉和1-lOmmol/L的三(2-羧乙基)膦氯化氫(TCEP)。本發(fā)明液體形式的試劑盒組分可以通過冷凍干燥技術，結合減壓蒸餾技術、 反滲透技術及超濾技術等，制備成試劑干粉。所述干粉可以在檢測待測標本前用選自去離子水、蒸餾水和雙蒸水的溶劑復溶至所述試劑的原有體積。本發(fā)明的試劑盒可以包括記載有上述各種組分使用方法和用量的說明書。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照試劑盒說明書的記載根據(jù)現(xiàn)有技術配制即可。適于使用本發(fā)明所述試劑盒的待測標本可以是動物體(包括人體)健康狀態(tài)下以及病理狀態(tài)下的血液自然凝固后析出的血清。下面結合實施例進一步說明本發(fā)明，除非特別說明本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基均為市售商品。制備實施例1
cooes] A) ammm^mMm^j^m^mmmn (即獲f導序歹！丨ι所示 射亥苷 序歹u)Α-1)白色念珠菌(Candida albicans SC5314)(購自 ATCC MYA-2876)的培養(yǎng)白色念珠菌培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基為2%的葡萄糖、的蛋白胨、0.5%的酵母膏和 2%的瓊脂，121°C20min滅菌(如無特殊說明，本文中“ ％ ”指重量百分比)。白色念珠菌培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基為2%的葡萄糖、的蛋白胨和0.5%的酵母膏，121°C 20min滅菌。
白色念珠菌SC5314在以上所述固體平板上活化，活化過程即在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時，然后將菌落接種到以上酵母液體培養(yǎng)基中；30°C條件下培養(yǎng)對小時。A-幻白色念珠菌基因組DNA的提取取步驟1)獲得的培養(yǎng)物，在室溫下IOOOOrpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于 400 μ 1 裂解緩沖液中(2% (v/v) Triton X-100,1 % (m/v) SDS, IOOmM NaCl, IOmM Tris-Cl (ρΗ8· 0)，ImM EDTA (ρΗ8· 0))，加入與細胞體積相等的酸洗玻璃珠，和400 μ 1酚/氯仿。冰浴，劇烈振動5X30s。IOOOOrpm離心lOmin，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。加0. 6倍體積異丙醇或2倍體積乙醇，顛倒混勻，室溫放置lOmin。IOOOOrpm離心lOmin，棄上清。加入500 μ 1 75%乙醇，渦旋，IOOOOrpm離心anin，棄上清。將沉淀在空氣中干燥lOmin，加入 50 μ 1 TEdOmM Tris-Cl (ρΗ8· 0)，ImM EDTA (ρΗ8· 0))溶解。力口 1 μ 1 的 10mg/ml 的 RNase， 37°C下消化30min。得到基因組DNA。A-3)擴增同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因本發(fā)明人設計的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因引物如下同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因正向引物(SAMF) (SEQ ID NO 5)ATCGCCATGGGACGTGTTCAGGATATTTTAG ；附近有 NcoI 酶切位點。同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因反向引物(SAMR) (SEQ ID NO 6)ATCGCTCGAGCTATTGGTTGATCAATTGTGCAAC ；附近有 XhoI 酶切位點。擴增條件為20mMTris-HCl (pH 8. 8) UOmM KClUOmM(NH4)2SO4,2mM MgS04、0. 1% Triton Χ_100、50μΜ dATP、50yM dGTP、50yM dTTP、50yM dCTP、400nM 引物 SAMF、400nM 引物SAMR、1.5U Pfu DNA聚合酶(Promega，USA)，20ng基因組DNA加入反應體系，用無菌水調(diào)至反應體積達50 μ L。擴增反應程序為將上述反應體系在95°C下反應5分鐘，然后進行30個循環(huán)的 "950C 30秒、55°C 30秒和72°C 2分鐘”，最后在72°C下保持10分鐘。將得到的PCR擴增基因產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，并用QIAGEN快速提取凝膠試劑盒回收936bp左右單一條帶的DNA片段。B)重組載體的構建將步驟A)得到的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因經(jīng)NcoI和B10I雙酶切4h，與同樣經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切4h的pET30a載體，通過使用T4DNA連接酶連接二者，構建成同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶重組表達載體。ο 重組in本對宿t細朐,mmnPiJkmnmm^mm,mmm挑取在LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)16小時的大腸桿菌BL21 (DE3)的單菌落，于液體LB培養(yǎng)基中在37°C、150rpm的搖床再培養(yǎng)16小時。取Iml所得液體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml 新鮮液體LB培養(yǎng)基中，在37°C搖床上以250-300rpm的轉(zhuǎn)速劇烈振蕩培養(yǎng)2. 5小時。吸取 1. 5ml培養(yǎng)好的菌液至1. 5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘后，在4°C、3000g下離心5分鐘。棄去上清，加入100 μ 1在冰上預冷的0. lmol/L的CaC12溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，在冰放置20分鐘。然后在4°C、3000g下離心5分鐘，棄去上清，加入100 μ 1 在冰上預冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，得到感受態(tài)的宿主細胞。取200 μ 1上述感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)置于1. 5ml離心管中，加入體積為10μ 1的pET30a溶液(其中pET30a含量為40ng)輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。然后在 42°C水浴中熱擊90秒，接著迅速置于冰上冷卻5分鐘。向離心管中加入Iml LB液體培養(yǎng)基(不含卡那霉素)，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的卡那霉素抗生素抗性基因。將上述菌液搖勻后取100 μ 1涂布于含Kan的LB篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)20小時。在篩選平板上出現(xiàn)了大腸桿菌的菌落，即pET30a已經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，得到了本實施例的重組宿主細胞——大腸桿菌BL21 (DE3)pET30a。P)重組宿主細胞的培養(yǎng)將上述步驟C)獲得的帶有編碼同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的對應大腸桿菌BL21(DE3)克隆在LB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)至生長對數(shù)生長期(0D600 = 2)，接種于 3L初始培養(yǎng)基，即在初始培養(yǎng)基中接入10%體積的0D600 = 2的LB種子液，于37°C，溶氧大于20%的條件下自然生長，使用氨水、硫酸調(diào)節(jié)pH6. 5 pH7. 3。當初始培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分耗盡時(即溶氧DO值上升至40%時)降溫至32°C，按照60 100ml/L的比例加入補料液1開始誘導，并按照5 10ml/h/L的速率恒速補加補料液2，使用氨水調(diào)節(jié)pH。在誘導階段，每隔3士 1小時降低1 士0. 1°C，降至后恒溫至發(fā)酵結束(即發(fā)酵液中同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活大于200KU/L，其中所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活參照后附的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法來測定)。其中，本發(fā)明中用到的培養(yǎng)基配方依次如下種子培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。121°C滅菌20分鐘，滅菌冷卻后加入硫酸卡那霉素至終濃度50mg/L。發(fā)酵初始培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，磷酸氫二鉀8g/L、磷酸二氫鈉4g/L、一水檸檬酸0. 5g/L、硫酸鎂lg/L、微量元素母液5ml/L，調(diào)pH至7. 0，121°C滅菌20分鐘。接種前加入滅菌的葡萄糖至終濃度18g/L，使用氨水調(diào)pH至7. 0。加入硫酸卡那霉素至終濃度50mg/ L0在初始培養(yǎng)基中磷酸鹽的比例為磷酸氫二鉀磷酸二氫鈉=2 1微量元素的配方為IOg FeSO4. 7Η20、2· 25g ZnSO4. 7H20、Ig CuSO4. 5Η20、0· 5gMnS04. 5Η20、0· 23g Na2B4O7. IOH20,2g CaCl2. 2H20 和 0. Ig (NH4) 6Mo7024，溶于 5M 鹽酸中。補料液1 酵母提取物250g/L、胰蛋白胨100g/L、乳糖10g/L，121°C滅菌20min。補料液2 甘油400g/L，121°C滅菌 20min。Ε)蛋白產(chǎn)物的分離提純將步驟D)得到的發(fā)酵液調(diào)整pH至7. 0-8. 0，用SOObar高壓勻漿機破碎重懸的細胞，先將破碎細胞液在45°C下加熱30min，使目標蛋白釋放出來。向勻漿液中加入50mM的氯化鈣，充分攪拌混勻，5000g離心20分鐘，去除絕大部分核酸、細胞碎片，以及部分雜蛋白。向離心上清中加入4mM鎳離子(硫酸鎳)，混勻，室溫下靜置1小時，5000g離心20min，絕大部分目的蛋白在沉淀中。向沉淀中加入原體積1倍體積的復溶緩沖液攪拌30分鐘左右。IOOOOg離心20分鐘。復溶液配方為40mM pH7. 5PB, IOmM NAD,8mM EDTA0復溶上清經(jīng) 0. 45 μ m濾膜過濾。所得濾液再用葡聚糖凝膠G-25層析柱(S^hadex G-25)脫鹽。所述脫鹽緩沖液配方為40mM pH7.5的PB，4mM EDTA。再用脫鹽緩沖液平衡好的層析柱上上樣，其中樣品溶液的流速為5ml/min，然后用脫鹽緩沖液以15ml/min的流速洗脫2個柱體積。收集洗脫下的液體共500毫升。所收集的液體在普通冰箱中-10°C下冷凍2小時，然后再-40°C深冷冰箱預凍8小時，在德國科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷凍干燥機中，以真空度0. 04mbar、安全壓力0. IOOmbar且冷阱溫度_60°C的條件凍干25小時。然后等物料溫度與凍干機隔板溫度差為零，并且觀察在15秒內(nèi)壓力指示不變時，結束凍干。凍干所得蛋白質(zhì)的量為12克。凍干蛋白在冷凍條件下密封保存。取少量凍干樣品，參照后附的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活測定方法測得酶活為100U/lmg。采用《蛋白質(zhì)電泳試驗技術》(郭堯君，132-145頁，科學出版社，1999年)記載的 SDS-PAGE電泳的方法測定出本實施例的蛋白質(zhì)的分子量為36KD，并且根據(jù)《生物化學》(王鏡巖等，高等教育出版社，2002，見168頁)記載的蛋白質(zhì)一級結構的測定方法(分肽段測定)，測得本實施例的蛋白質(zhì)有330個氨基酸殘基(參見SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列)， 與由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)結果一致。照以下方法測丨定同型半胱射舌+牛:試劑一稱量3g的TRIS用400ml的去離子水溶解，加上0. 1435g的ZnSO4. 7H20， 然后用鹽酸調(diào)整PH至7. 5，此時為50mM Tris-HCl含有ImM鋅離子，向此溶液中添加IOOmM KCl。反應試劑向試劑一的溶液中分別添加5mM同型半胱氨酸(HCY)和5mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(現(xiàn)配現(xiàn)用)。反應原理
權利要求
1.一種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為(1)SEQID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者(3)對(1)或( 所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代， 但其同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的功能不變的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其中，所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
3.一種編碼同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為編碼權利要求1或2所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為(1)SEQID NO :2所示的核苷酸序列；或者(2)SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列；或者(3)對SEQID NO :2或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶功能不變。
5.根據(jù)權利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為SEQID NO :2或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
6.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體由空載體和插入該空載體的目的基因組成，所述目的基因為權利要求3-5中任意一項所述的編碼同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述空載體選自由pET系列載體、 pUC19、pGEM和pBluescript所組成的載體組中。
8.—種重組宿主細胞，其特征在于，所述重組宿主細胞含有權利要求6或7所述的重組載體。
9.根據(jù)權利要求8所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌 BL21(DE3)、BL21、T0P10 或者 DH5a。
10.一種從權利要求8或9所述的重組宿主細胞中純化同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，所述方法采用將重組細胞的破碎液在40-45°C加熱15-40分鐘，然后在 8000-15000rpm離心10_20min，以除去不耐熱的雜蛋白。
11.一種檢測血清同型半胱氨酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下(a)-(d) 中的至少一種(a)權利要求1或2所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；(b)權利要求4-6中任意一項所述的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列；(c)權利要求6或7所述的重組載體；(d)權利要求8或9所述的重組宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列為(1)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，或者(3)對(1)或(2)所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的功能不變的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼所述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，從前述重組宿主細胞中純化該酶的方法，以及包括上述同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發(fā)明的同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶耐熱性好、穩(wěn)定性很高。
文檔編號C12N1/21GK102391999SQ20111034364
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權日2011年11月3日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司