專利名稱：紫花苜蓿γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因及編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因，還涉及由該基因編碼的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達載體和細胞，同時還涉及一種培育紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿Y -生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因及其編碼的蛋白和含有該基因的表達載體及細胞在培育高α-生育酚含量的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
維生素E是一類人體所必需的脂溶性維生素，具有重要的生理功能。它能夠清除脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的自由基而穩(wěn)定保護生物膜的脂雙層，使細胞免受過氧化物的傷害。因而被作為一種有效的抗氧化劑廣泛地應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)中。大量動物實驗表明，在飼料中添加維生素E具有提高動物免疫力、改善肉質(zhì)、提高動物的繁殖性能、緩解動物應(yīng)激反應(yīng)等顯著效果。維生素E的生產(chǎn)主要通過化學(xué)合成和天然提取獲得?；瘜W(xué)方法合成的產(chǎn)品主要以醋酸酯的形式存在，副產(chǎn)物多且生物活性低。天然維生素E主要存在于植物中，在生理活性和安全性上明顯優(yōu)于合成維生素Ε。天然維生素E由8種生育酚異構(gòu)體組成。根據(jù)側(cè)鏈飽和度可分為生育酚和三烯生育酚兩大類。根據(jù)芳香環(huán)上甲基數(shù)目和位置的不同又分為α、β、Υ、δ-生育酚和α、β、Y、δ-三烯生育酚。這8種生育酚異構(gòu)體在植物中的含量及相對活性均不盡相同，α -生育酚的生物活性最高，并可被人體和動物體優(yōu)先吸收和利用，這是由于在肝臟中的運送α-生育酚的轉(zhuǎn)移蛋白優(yōu)先結(jié)合α-生育酚的特性所決定的。但是α-生育酚在植物中的含量相對較低，因此，大幅度提高植物(特別是牧草植物)中高活性α-生育酚含量，將具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益。研究植物維生素 E合成途徑發(fā)現(xiàn)，通過甲基轉(zhuǎn)移作用將Y-生育酚轉(zhuǎn)化為α-生育酚的Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶，可提高植物中α-生育酚的含量和比例。目前Υ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)從擬南芥、藍藻等中克隆得到，但至今未見從牧草植物(特別是苜蓿)中克隆分離到Y(jié)-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并將其轉(zhuǎn)化到牧草植物中來提高α-生育酚含量的報道。紫花苜蓿是我國乃至世界上最重要的豆科牧草，被譽為“牧草之王”。如果能夠克隆得到源自紫花苜蓿的Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并將其轉(zhuǎn)到包括紫花苜蓿在內(nèi)的牧草植物中，將能夠在提高動物免疫力、改善肉質(zhì)、提高動物的繁殖性能等方面具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對紫花苜蓿中維生素E合成途徑相關(guān)的分子生物學(xué)機制的研究，一方面提供了紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因及該基因編碼的蛋白，另一方面還提供了含有所述紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達載體和細胞，以及培育高α-生育酚含量的紫花苜蓿的方法，還提供了它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No:2所不的氣基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有Y -生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，其中，該基因具有SEQID No:1所不的核昔酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。本發(fā)明還提供了一種表達載體，其中，該表達載體含有本發(fā)明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細胞含有本發(fā)明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因。本發(fā)明還提供了一種培育紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將本發(fā)明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎校玫溅?生育酚含量高的紫花苜蓿細胞及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞在培育α -生育酚含量高的植物中的應(yīng)用。本發(fā)明從紫花苜蓿中克隆的Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因為提高主要牧草植物(特別是豆科植物，如紫花苜蓿)中α-生育酚的含量提供了基因資源，在基因工程改良牧草植物的研究中將發(fā)揮重要作用。


圖1顯示了實施例1中對紫花苜蓿植株進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化所用的插入有Y -生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因的PCAMBIA1302載體的結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種由紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No:2所不的氣基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有Y -生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，該蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所不的核昔酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因是發(fā)明人通過以下方法篩選得到的:根據(jù)截型苜蓿中已經(jīng)克隆的Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Genbank登記號為:ΒΤ051703)保守域設(shè)計引物(RT-PCR 引物為:F:5 ' -TCTCAGCCCTGTTCAAGC-3 ' ；R:5 ' -CAAAGGGAGACCAATCTG-3 ')，從紫花苜猜(Medicago sativa L.cv.Zhongmu N0.1,中苜一號，北京中畜東方草業(yè)科技有限責任公司)中進行擴增，回收預(yù)期大小為400bp的片段(跑電泳后回收此長度的片段)，將回收的片段連入PMD18-T Vector(Takara),測序:測序結(jié)果在NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLASTx分析；將分析結(jié)果中與Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶類有關(guān)的2條序列用DNAstar進行連續(xù)開放閱讀框(ORF)分析，發(fā)現(xiàn)I條具有連續(xù)的ORF (長度為404bp);用該序列設(shè)計特異引物(MsTMT-RT-F:5' -ACGGCCAGTTTGATCTAGTGT-3' ；MsTMT-RT-R:5/ -CTTCATTCGGGGCAAG-3')，且利用該序列設(shè)計5’ RACE弓丨物與3’ RACE引物，以紫花苜蓿葉片組織為材料，獲得其全長序列，具體步驟為:利用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)分別對該 EST 序列進行5’ RACE和3’ RACE克隆，最后獲得了該基因全長序列(SEQ ID N0:1)。其中，基因克隆的方法為分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)實驗操作，具體方法如下:RACE-ready cDNA 的合成A.準備基本液體:2.Ομ I 5Χ 第一鏈緩沖液，1.0μ I DTT (20mM), 1.0 μ IdNTPMix(IOmM)；B.制備用于 5，RACE 的 cDNA:2.75 μ I RNA, 1.Ομ I 5' -CDS Primer A ；制備用于3，RACE 的 cDNA:3.75 μ I RNA, 1.0μ I 3' -CDS Primer A ；C.將準備好的液體放于72°C 3分鐘，再放于42°C冷卻2分鐘，短暫離心收集液體；D.向 B 中 5， RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo ；E.制備5’ RACE和3，RACE-Ready cDNA反應(yīng)液:4.0 μ I的步驟A得到的緩沖液，
0.25 μ I RNA 酶抑制劑(40U/ μ I)，1.0 μ I SMARTScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶(100U)；F.將步驟E中的液體加入到步驟C中，完成3’RACE-Ready cDNA合成反應(yīng)液的制備；將步驟E中的液體加入到步驟D中，完成5’ RACE-Ready cDNA合成反應(yīng)液的制備；G.將制備好的反應(yīng)液放于42°C中90分鐘，最后70°C中10分鐘，完成Ready-cDNA的合成。cDNA末端的快速合成H.準備基本液體:34.5μ I PCR 用水，5.0μ I IOXAdvantage 2PCR 緩沖液，
1.0μ I dNTP Mix(IOmM), 1.0μ I 50 X Advantage 2 聚合酶 Mix;1.制備用于 5’RACE 的 PCR反應(yīng):2.5μ I 5’RACE-ready cDNA，5.0 μ IUPM(IOX)，1.0μ I GSPl 5' -GTTGTAGGGATTCTTCATTCGGGGC-3' ；41.5 μ I 的步驟 H 中制備的緩沖液。制備用于3’RACE 的 PCR 反應(yīng):2.5μ I RACE-ready cDNA，5.0 μ IUPM(IOX)，1.0μ I GSP2 5' -TTGTTGGTGAGTTAGCACGGGTAGC-3' ；41.5 μ I 的步驟 H 中制備的緩沖液。RACE反應(yīng)體系為:94°C 30秒，72V 3分鐘，共5個循環(huán):94°C 30秒，70°C 3分鐘，72 0C 3分鐘，共5個循環(huán)；94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分鐘，共20個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物于1.0重量％的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，回收目的條帶，連接回收產(chǎn)物與pEGM T-Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒并測序，進行序列拼接，結(jié)果顯示該基因具有SEQ ID =No:1所示的核苷酸序列(1306bp)。本發(fā)明還提供了一種表達載體,其中，該表達載體含有具有以下核苷酸序列的基因:SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明提供的基因可以通過現(xiàn)有的方法構(gòu)建到表達載體中，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細胞含有具有以下核苷酸序列的基因:SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述細胞可以為單子葉植物的細胞，也可以為雙子葉植物的細胞，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄或苜蓿等的細胞。優(yōu)選為苜蓿細胞，更優(yōu)選為紫花苜蓿細胞。本發(fā)明還提供了一種培育α-生育酚含量高的紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將具有SEQ ID No:1所示的核苷酸的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎校玫溅?生育酚含量提高的紫花苜蓿細胞及轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)本發(fā)明所述將有本發(fā)明提供的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎械姆椒榛蚬こ填I(lǐng)域常規(guī)的方法，例如可以通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，之后將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞在培育α -生育酚含量高的植物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述植物為紫花苜蓿。實施例1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Y -生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(MsTMT)基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿植株一、材料與試劑1、植物材料供試苜猜品種為紫花苜猜(Medicago sativa L.cv.Zhongmu N0.1,中苜一號，北京中畜東方草業(yè)科技有限責任公司)。發(fā)芽7天的無菌苗子葉為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。2、農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒載體所用的農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌:LBA4404(北京天恩澤基因科技有限公司)農(nóng)桿菌培養(yǎng)基:
權(quán)利要求
1.一種由紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No:2所不的氣基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有Y -生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No:2所示的氨基酸序列。
3.一種紫花苜蓿Y-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一種表達載體,其特征在于,該表達載體含有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種轉(zhuǎn)基因細胞，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因細胞含有權(quán)利要求3所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細胞為紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因細胞。
8.一種培育紫花苜蓿的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求3所述的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎校玫溅?生育酚含量高的紫花苜蓿細胞及轉(zhuǎn)基因植株。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求5所述的表達載體、權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細胞在培育α-生育酚含量高的植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其 中，所述植物為紫花苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由紫花苜蓿γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白的編碼基因，以及含有該基因的表達載體和細胞，同時還涉及一種培育α-生育酚含量高的紫花苜蓿的方法和它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的紫花苜蓿γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因(MSTMT)在紫花苜蓿中的表達可以顯著提高紫花苜蓿中α-生育酚的含量。該基因的發(fā)現(xiàn)為提高主要牧草植物(特別是豆科植物，如紫花苜蓿)中α-生育酚的含量提供了基因資源，在基因工程改良牧草的研究中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/84GK103087999SQ201110343669
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者王學(xué)敏, 王贊, 高洪文, 賈慧麗 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所