專利名稱：用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法
技術領域：
本發明涉及一種萃取發酵微生物胞內產物的方法，具體是一種用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法。
背景技術：
微生物發酵胞內產物通常在細胞內積累高產物濃度而導致產物抑制，主要解決方式是通過提高微生物的細胞密度以提高產物濃度。另一方面，胞內產物積累使得下游分離與純化過程中必須采用細胞破碎、溶劑提取等手段，增加了過程的復雜性和操作成本。采用在水-有機溶劑兩相系統中發酵以改變細胞膜的滲透性可以將細胞內的產物釋放到胞外環境，但有機溶劑對細胞膜的生物相容性和有機溶劑對胞內產物的萃取能力之間的存在矛盾。因此，利用有機溶劑的滲透萃取發酵技術難以實現。非離子表面活性劑在水溶液中形成膠束溶液。在一定溫度下，非離子表面活性劑膠束溶液自動發生相分離而形成表面活性劑濃縮相和表面活性劑稀溶液相。這一兩相系統稱為濁點系統。非離子表面活性劑溶液或者非離子表面活性劑溶液形成的濁點系統在萃取分離中的應用有很多報道。經對現有技術文獻比對，應用濁點系統技術在萃取微生物發酵胞外產物以解除產物對微生物的抑制已有相關報道[王志龍，戴澤文。濁點系統中萃取微生物發酵。酶與微生物技術，2010，46 :407-418。Wang Z，Dai Z. Extractive microbial fermentation in cloud point system. Enzyme Microbial Technology,2010, 46 :407-418],但應用非離子表面活性劑溶液及其形成的濁點系統在微生物發酵過程中改變細胞膜的滲透性以釋放胞內產物同時萃取產物的所謂滲透萃取發酵技術還沒有報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種萃取發酵微生物胞內產物的方法，利用非離子表面活性劑的水溶液及其形成的濁點系統，在微生物發酵胞內產物時將胞內產物滲透到細胞外發酵液且同時萃取細胞外發酵液中產物。為解決上述問題，本發明所述的萃取發酵微生物胞內產物的方法，具體是微生物發酵胞內產物時，以添加每升發酵液0. 2-128g的非離子表面活性劑濃度形成的非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統作為微生物的發酵介質，采用非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統作為微生物發酵胞內產物的發酵介質的目的是為了將細胞內的產物滲透到細胞外環境，從而提高微生物發酵的產物水平和調節微生物次級代謝產物的組成。同時通過萃取產物實現目標產物的濃縮和部分純化以簡化下游的分離純化過程。即實現微生物胞內產物的滲透萃取發酵。本發明中，采用非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統實現微生物胞內產物的滲透萃取發酵的關鍵在于改變細胞的滲透性同時維持微生物的生命活力。本發明涉及的非離子表面活性劑包括高分子聚合物，聚合物非離子表面活性劑以及通常應用的小分子非離子表面活性劑等。
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本發明的滲透萃取微生物發酵技術特別適合于微生物胞內產物的發酵。如細胞內酶的發酵、細胞內油脂、色素等有機小分子的發酵等。具體地，以紅曲霉菌發酵生產胞內色素作為具體實例。優選的，本發明利用非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統在微生物紅曲霉菌發酵生產紅曲色素中將胞內產物釋放到細胞外，同時萃取細胞發酵液中的紅曲色
ο本發明涉及的非離子表面活性劑包括聚氧乙烯類聚合物、甲氧基聚氧乙烯類聚合物、聚氧乙烯-聚氧丙烯類嵌段聚合物、小分子非離子表面活性劑等四類。其中，聚氧乙烯多聚物為(如市售的商業渠道得到PEG 4000, PEG 10000等)； 甲氧基聚氧乙烯類聚合物MPEG 5000 (Sigma)；共多聚物L64(浙江皇馬化學品公司)、 F68 (Sigma))。非離子表面活性劑為(山梨醇類(如span 20, Tween 80(上海試劑公司)； 脂肪醇聚氧乙烯醚類(Brij 30、(Fluka) ；Triton X 系列(如 Triton X-45, Triton X-114， Triton X-IOO(Fluka) ；Teritgol 系列(如 Tergitol TMN-3 (Fulka))等。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明通過在微生物發酵液中添加非離子表面活性劑，表面活性劑改變了細胞膜的滲透性。一方面，微生物細胞膜內的目標產物(濃度為Cb)能夠選擇性地滲透到細胞外環境(濃度為Cp)。這解除了細胞內產物的抑制作用，將顯著提高目標產物在發酵過程中的有效體積，從而顯著提高目標產物的產量， 同時調節了微生物次級產物代謝。例如添加非離子表面活性劑使紅曲色素中黃色素組成分率明顯增加。另一方面，細胞外發酵液中目標產物在非離子表面活性劑膠束溶液或其濁點系統中加溶在表面活性劑膠束中(濃度為Ce)，這一萃取過程濃縮了目標產物，進一步解除了產物的抑制，簡化了下游分離過程。這一過程的實現關鍵在于所選擇的非離子表面活性劑能夠影響細胞膜的滲透性而不至于影響微生物細胞的生長、合成次級代謝產物等生命過程，即維持微生物在表面活性劑膠束溶液及其所形成的濁點系統中的生物相容性。


圖1為滲透萃取發酵的原理圖；
具體實施例方式以下實例將對本發明作進一步說明。本實施例以本發明技術方案為前提進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。本實施例涉及微生物菌種Monascus anka為公開的已有菌種，可以通過中國工業微生物菌種保藏中心獲得(保藏編號CICC 5013)，也可以通過商家購買獲得。該微生物菌株通過常規的固態發酵或深層液態發酵可以獲得微生物次級代謝產物紅曲色素。紅曲色素其主要組成成分為黃色素、橙色素和黃色素，是疏水性化合物，主要分布在微生物細胞內。 紅曲色素在我國已經有上千年的應用歷史，是天然的食品色素添加劑。采用現代發酵技術具有重要的工業化價值。如圖1所示，為本發明滲透萃取發酵的原理圖。其中，種子斜面培養為PDA培養基(1L水中土豆汁200g，葡萄糖20g，瓊脂15_20g)在30度條件下培養2天。種子活化培養基為(1L水中玉米粉 30g，NaN0s3g, KH2P044g, FeSO4 · 7H200. Olg)，在 30度、110轉/分的搖床中培養2天。發酵培養基為(1L水中玉米粉 70g，KH2P045g, CaCl2O. lg，FeSO4 · 7H200. Olg)，調節 pH到4，在30度、110轉/分的搖床中培養，6-8天。產物紅曲色素包括紅色素、橙色素和黃色素等主要組分。對應細胞內產物濃度和細胞外產物濃度分別在520nm、470nm和410nm處用分光光度法測定。細胞外產物濃度通過離心后適當稀釋直接測定。細胞內產物濃度采用等發酵液體積的乙醇浸泡細胞1小時離心后適當稀釋上清液測定色素的吸光度。黃色素、橙色素、紅色素的色素濃度分別表示為410， 470和510納米下的光密度值。實施例1在聚合物PEG 4000添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為10，6和9。實施例2在聚合物PEG 10000添加量為0. 4g/100ml,的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為10，7和8。實施例3在聚合物MPEG 5000添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為5，4和5。實施例4在聚合物非離子表面活性劑F68添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應 7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為5，4和6。實施例5在聚合物非離子表面活性劑L64添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應 7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為6，5和5. 5。實施例6在非離子表面活性劑Tween 80添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7 天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為5，5和4。實施例7在非離子表面活性劑Span 20添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7 天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為4，3和4。實施例8在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為16，8和15。實施例9在非離子表面活性劑Triton X-114添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為3，2和3。實施例10在非離子表面活性劑Triton X_45添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為4，3和4。實施例11在非離子表面活性劑TMN-3添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為3，2和3。實施例12在非離子表面活性劑Brij 30添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7 天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為0，0和0。實施例13在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應6天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為12，6和11。實施例14在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應8天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為17，9和16。實施例15在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為0. 4g/100ml的條件下按常規條件反應9天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為18，9和17。實施例16在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為0. 2g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為14，6和12。實施例17在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為0. 8g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為27，16和18。實施例18在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為1. 6g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為38，21和22。實施例19在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為3. 2g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為49，23和M。實施例20在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為6. 4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為48，21和22。實施例21在非離子表面活性劑Triton X-100添加量為12. 8g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為37，17和18。實施例22在非離子表面活性劑Triton X-100和Triton X_45以復配比例為4 6且添加量為4g/100ml的條件下按常規條件反應7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為53，25和26。該細胞外溶液系統在發酵溫度下發生相分離而形成濁點系統，其中表面活性劑濃縮相的黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為108，42和35，而表面活性劑稀
6相中黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為8，3和5。實施例23在不添加非離子表面活性劑的條件下，常規水溶液的對照系統中按常規條件發酵 7天得到細胞外黃色素，橙色素，紅色素的光密度分別為8，6和10。對比實施例19，20和21 等的實驗結果，添加非離子表面活性劑不但使胞外紅曲色素的產量明顯增加，而且明顯提高了紅曲色素中黃色素的分率。以上是本發明優選實施例的描述，應當理解的是，本發明的實施并不局限于上述的情形，本發明特別適合于細胞內產物的發酵過程，如細胞內微生物酶的生產、細胞內有機小分子物質的生產以及細胞內油脂類化合物的生產等，可以有效地解除胞內產物抑制，提高微生物發酵產物的濃度和調節微生物發酵次級代謝產物的組成。從而提高了微生物發酵的體積產率和提高了胞內產物發酵、產物釋放等過程的效率。盡管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細介紹，但應當認識到上述的描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容后，對于本發明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發明的保護范圍應由所附的權利要求來限定。
權利要求
1.一種用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法，其特征在于微生物發酵胞內產物時，以添加非離子表面活性劑濃度形成的非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統作為微生物的發酵介質，將細胞內的產物滲透到細胞外環境，提高微生物發酵的產物水平，同時實現微生物胞內產物的滲透萃取發酵。
2.根據權利要求1所述的采用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法，其特征在于所述的胞內產物的滲透萃取發酵，包括利用非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統將微生物紅曲霉菌發酵生產紅曲色素的胞內產物釋放到細胞外，同時萃取微生物發酵液中的紅曲色素。
3.根據權利要求1或2所述的用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法，其特征在于所述非離子表面活性劑包括高分子聚合物，聚合物非離子表面活性劑以及小分子非離子表面活性劑中一種或者多種。
4.根據權利要求3所述的用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法， 其特征在于所述非離子表面活性劑包括聚氧乙烯多聚物、甲氧基聚氧乙烯類聚合物、共多聚物L64、F68，以及山梨醇類、脂肪醇聚氧乙烯醚類、Triton X系列、Teritgol系列中一種或多種。
5.根據權利要求4所述的用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法， 其特征在于所述非離子表面活性劑濃度的范圍在0. 2-128g/L發酵液。
6.根據權利要求1或2所述的用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法，其特征在于所述非離子表面活性劑提高微生物發酵的產物濃度，同時調節微生物次級代謝產物的組成。
7.根據權利要求6所述的用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法， 其特征在于所述非離子表面活性劑提高了胞外紅曲色素的濃度和提高了紅曲色素中黃色素的分率。
全文摘要
本發明公開了一種用非離子表面活性劑滲透萃取發酵微生物胞內產物的方法，具體是微生物發酵胞內產物時，以添加非離子表面活性劑濃度形成的非離子表面活性劑膠束溶液或其形成的濁點系統作為微生物的發酵介質，將細胞內的產物滲透到細胞外環境，提高微生物發酵的產物水平，同時實現微生物胞內產物的滲透萃取發酵。本發明特別適合于細胞內產物的發酵過程，如細胞內微生物酶的生產、細胞內有機小分子物質的生產以及細胞內油脂類化合物的生產等，有效地解除了胞內產物抑制，提高了微生物發酵產物的濃度和調節了微生物發酵次級代謝產物的組成。從而提高了微生物發酵的體積產率和提高了胞內產物發酵、產物釋放等過程的效率。
文檔編號C12P1/02GK102443605SQ20111034641
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者王志龍, 胡志強 申請人:上海交通大學