專利名稱：從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒及這種試劑盒的用途，確切講本發明涉及一種用于檢測犬糞是否存在細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)病原的檢測試劑盒和該試劑盒的用途。
背景技術：
細粒棘球絳蟲的幼蟲——細粒棘球蚴可感染多種動物(包括人)，可引起危害人類健康并阻礙畜牧業發展的人畜共患寄生蟲病，即細粒棘球蚴病，又稱囊型棘球蚴病或囊型包蟲病。目前細粒棘球絳蟲存在10個基因型，即Gl G10。在我國主要存在Gl和G6兩型，其中Gl型分布最廣，危害最為嚴重。犬科動物是細粒棘球絳蟲的終末宿主，成蟲寄生于其小腸內，蟲卵隨糞便排出，污染食物、飲水和周圍環境，構成主要傳染源。所以及時、準確地檢測流行區終末宿主棘球絳蟲的感染情況和對感染動物進行強制驅蟲，對控制棘球蚴病的流行、綜合防控措施實施和防治效果的評價等都具有十分重要的意義。在我國西北部地區，流浪犬或未實施定期驅蟲等措施的犬感染最為嚴重，是最主要的傳染源。目前，對細粒棘球絳蟲感染犬的檢測方法有常規檢測法(檳榔堿導瀉法和剖檢法)、糞DNA-PCR檢測法和糞抗原-ELISA檢測法(Boufana BS, et al. Evaluation of Three PCR assays for the identification of the sheep strain (Genotypel) of Echinococcus granulosus in canid feces and parasite tissues[J]. Am J Trop Med Hyg,2008,78(5) 777-783 ；Pierangeli NB, et al. Usefulness and validation of a coproantigen test for dog echinococcosis screening in the consolidation phase of hydatid control in Neuquen, Argentina [J], Parasitol Iht, 2010, 59 (3) =3M-399.)。但這些方法都存在一定的缺點，敏感性和特異性都較低，其中常規檢測法還具有感染人和周圍環境的危險。

發明內容
本發明提供一種可克服現有技術不足，從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒，以及用這種試劑盒配制相應試劑的方法和檢測方法。本發明的從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒中包括有四個特異引物，這四個特異引物分別是上游外部引物F3 :5' -TGGTTTTAGGTATTTGATTAGGT-3 ‘ (SEQ Na 1)； 下游外部引物 B3:5' -ACCACTACATACCAACACC-3 (SEQ Na 2)；上游內部引物FIP :5' -TAACC CAMCGTTACCACATCAAAAGAATTCTAGATTTTTGTCTACTATGGGTTGT-3 ‘ (SEQ Ns ；3)；下游內部引物 BIP 5' -ATACTGGTCATTATTTCGGCGGGAATTCCAAACAAAACAATCAACTTCAAC-3' (SEQ Ns 4)。為方便使用，本發明的試劑盒中還有LAMP反應液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、 標準陽性模板以及顯色劑。利用本發明的檢測試劑盒可以配制檢測犬糞便中細粒棘球絳蟲病原的試劑。本發明是一種環介導恒溫擴增技術(Loop-mediated isotheral amplificationmethod, LAMP)，這是一種類似于PCR的核酸分子檢測技術，但比PCR更特異、敏感、快速、簡單，且受糞DNA中PCR抑制因子影響較小，簡單的儀器如恒溫水浴鍋即可完成反應。然而到目前為止，尚無應用此方法在犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的報道。本發明為一種快速檢測犬糞便中細粒棘球絳蟲病原體的方法，敏感性高于PCR方法，同時不需要復雜的操作系統，在普通的實驗室就可進行；具有操作簡單、敏感性高、特異性強、快速等特點，因此存在潛在的實驗研究和極具潛力的臨床應用價值。


圖IA為采用本發明的LAMP擴增及顯色結果，其中1為呈淺綠色的陽性糞DNA ；2 為呈淺明黃色的陰性對照。圖IB為采用本發明的LAMP擴增及酶切電泳檢測結果，其中M :DNA標準分子量 DL1000 ；1 標準陽性糞DNA ；2 滅菌水空白對照。圖2為臨床樣品的檢測結果的電泳，其中M:DNA標準分子DL1000 ；1 標準陽性糞 DNA ；2 6 臨床樣品結果；7 陰性糞DNA ；8 滅菌水空白對照。
具體實施例方式以下給出本發明的一個實施例。在本實施例中，所用的從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒包括有 2XLAMP反應液、由四條引物構成的混合物、Bst DNA聚合酶、標準陽性模板及顯色劑，其中的四個特異引物分別是上游外部引物F3 :5' -TGGTTTTAGGTATTTGATTAGGT-3‘ (SEQ Nsl)； 下游外部引物 B3 5' -ACCACTACATACCAACACC-3 (SEQ Na 2)，上游內部引物 FIP 5' -TAACC CAAACGTTACCACATCAAAAGAATTCTAGATTTTTGTCTACTATGGGTTGT-3 ‘ (SEQ Ns ；3)，下游內部引物 BIP 5' -ATACTGGTCATTATTTCGGCGGGAATTCCAAACAAAACAATCAACTTCAAC-3' (SEQ Ns 4)，其中2 X LAMP 反應液包括40mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8)，20mmol/L KCl，16mmol/L MgSO4, 20mmol/L (NH4)2SO4jO. 2% (v/v) Tween 20，1· 6mol/L Betaine 和 2· 5mmol/L dNTP ；引物混合物包括40pmol/L上游內部引物FIP，40pmol/L下游內部引物BIP， 5pmol/L上游外部引物F3，5pmol/L下游外部引物B3 ；顯色劑為STORGreen I。本發明的具體檢測過程如下1對陽性糞DNA樣品進行擴增1)制備標準陽性糞DNA:陽性糞便的獲得將細粒棘球蚴感染犬，2個月后剖檢感染犬分別收集糞便(含有蟲卵)和成蟲，將糞便于_70°C凍存1周。陽性糞DNA的制備根據糞DNA提取試劑盒說明書提取糞DNA。2)制備2 X LAMP反應液①1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)的配置稱取 91g Tris 置于燒杯中，加入 400mL 去離子水，充分溶解，用HCl調節pH值至8. 8，定容于500mL，備用；②配置2 X LAMP反應液前按表1配方配置90mL混合液表 權利要求
1.從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒，其特征在于試劑盒中包括有四個特異性引物，這四個特異引物分別是SEQ Na USEQ Na 2, SEQ Na 3, SEQ Ns 4。
2.根據權利要求1所述的從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒，其特征在于試劑盒中有LAMP反應液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、標準陽性模板以及顯色劑。
3.權利要求1或2所述的試劑盒在配制檢測犬糞便中細粒棘球絳蟲病原的試劑的用途。
4.權利要求1所述的從犬糞便中檢測細粒棘球絳蟲病原的試劑盒的使用方法，其特征是從犬糞便中提取DNA，分別配制LAMP反應液和引物混合液，將所得到的犬糞便DNA與 LAMP反應液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后進行LAMP擴增反應，在反應產物中入顯色劑或對反應產物進行電泳，根據反應產物是否顯色或在電泳中是否產物有梯度條帶確定被檢樣品是否有細粒棘球絳蟲病原。
全文摘要
本發明公開一種用于檢測犬糞是否存在細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)病原的LAMP檢測試劑盒和該試劑盒的用途。本發明的試劑盒中包括有四個特異引物，這四個特異引物分別是上游外部引物SEQ №1；下游外部引物SEQ №2；上游內部引SEQ №3；下游內部引物SEQ №4。為方便使用，本發明的試劑盒中還有LAMP反應液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、標準陽性模板以及顯色劑。本發明可快速檢測出犬糞中是否存在細粒棘球絳蟲病原，敏感性高、操作簡便、特異性強。
文檔編號C12Q1/68GK102363808SQ20111034644
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者倪興維, 婁忠子, 李宏民, 賈萬忠, 閆鴻斌 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所