專利名稱：從犬糞便中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒及這種試劑盒的用途，確切講本發明涉及一種用于檢測犬糞是否存在房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis)病原的檢測試劑盒和該試劑盒的用途。
背景技術：
多房棘球絳蟲的成蟲主要寄生于犬、狼、狐貍等犬科動物的小腸中，蟲卵隨糞便排出體外，感染人和多種嚙齒動物，并寄生于其肝臟等器官，引起泡型棘球蚴病。人的多房棘球蚴病危害嚴重，病死率極高，又稱“蟲癌”，嚴重威脅我國西部廣大牧民的生命與健康。因此，建立一種快速有效的多房棘球絳蟲感染犬糞DNA的檢測試劑盒對預防、控制和治療該病具有重要的意義。然而，已有的檢測方法如常規的病原學檢測法(檳榔堿導瀉法和剖檢法)、糞 DNA-PCR 檢測法和糞抗原 ELISA 檢測法(Dinkel A, et al. Detection of Echinococcus multilocularis in the definitive host :coprodiagnosis by PCR as an alternative to Necropsy[J],J Clin Microbiol,1998,36 (7) :1871-1876. ；Eckert J. Predictive values and quality control of techniques for the diagnosis of Echinococcus multilocularis in definitive hosts. Acta Trop, 2003,85 (2) : 157-163.)都存在一定的缺點，敏感性和特異性都較低，其中常規檢測法還具有感染人和周圍環境的危險。

發明內容
本發明提供一種可克服現有技術不足，從犬糞便中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒，以及用這種試劑盒配制相應試劑的方法和檢測方法。本發明的從犬糞中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒中包括有四個特異性引物，這四個特異引物分別是上游外部引物F3 :5' -gTgTgTTgCTATATTgCTTgT-3‘ (SEQ N2 1)；下游外部引物B3:5' -AACTTTAACAACATACACCTAgT-3‘ (SEQ Ns 2)；上游內部引物FIP :5' -T TAACCAACCAATAACAACCCAgTgAATTCgTggTgTTAgTTATTTggTTAgg-3 ‘ (SEQ Mj ；3)和下游內部引物 BIP 5 ‘ -ATgTgACgTTTggTgTggTAgTTAgAATTCAAgAACCACCAAAATAATgTCT-3 ‘ (SEQ Na 4)。為方便使用，本發明的從犬糞中檢測多房棘球絳蟲的試劑盒中還可有LAMP反應液、引物混合物、Bst DNA聚合酶、標準陽性模板以及顯色劑。利用本發明的試劑盒可配制用于檢測犬糞便中多房棘球絳蟲病原的試劑。本發明的從犬糞便中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒的使用方法是從犬糞便中提取DNA，分別配制LAMP反應液和引物混合液，將所得到的犬糞便DNA與LAMP反應液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后進行LAMP擴增反應，在反應產物中入顯色劑或對反應產物進行電泳，根據反應產物是否顯色或在電泳中是否有梯度條帶確定被檢樣品是否有多房棘球絳蟲病原。
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本發明是一種新型的DNA擴增技術——環介導的恒溫擴增技術(Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP)。此方法比PCR更特異、敏感、快速、簡單，且受糞 DNA中PCR抑制因子影響較小，簡單的儀器如恒溫水浴鍋即可完成反應。到目前為止，尚無應用此方法在犬糞便中檢測多房棘球絳蟲病原的報道。本發明為一種快速檢測犬糞便中多房棘球絳蟲病原體的方法，敏感性高于PCR方法，同時不需要復雜的操作系統，在普通的實驗室就可進行；具有操作簡單、敏感性高、特異性強、快速等特點，因此存在潛在的實驗研究和極具潛力的臨床應用價值。


圖IA為本發明的LAMP擴增及顯色結果，其中1為陽性糞DNA，2為陰性對照。圖IB為LAMP擴增及酶切電泳檢測結果，其中M為DNA標準分子量DL1000，1為標準陽性糞DNA，2為滅菌水空白對照。圖2為臨床樣品的檢測結果的電泳圖，其中M為DNA標準分子DL1000，1為標準陽性糞DNA ；2 5分別為臨床樣品結果，6為陰性糞DNA，7為滅菌水空白對照。
具體實施例方式以下結合實施例說明。在本實施例中，所用的從犬糞便中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒包括有 2XLAMP反應液、由四條引物構成的混合物、Bst DNA聚合酶、標準陽性模板及顯色劑，其中的四個特異引物分別是上游外部引物F3 :5' -gTgTgTTgCTATATTgCTTgT-3‘ (SEQ Nsl)； 下游外部引物 B3 5 ‘ -AACTTTAACAACATACACCTAgT-3 ‘ (SEQ Na 2)；上游內部引物 FIP 5' -TTAACCAACCAATAACAACCCAgTgAATTCgTggTgTTAgTTATTTggTTAgg-3' (SEQ Ns ；3)和下游內部引物 BIP 5' -ATgTgACgTTTggTgTggTAgTTAgAATTCAAgAACCACCAAAATAATgTCT-3' (SEQ Ns 4)，其中2 X LAMP 反應液包括40mmol/L Tris-HCl (pH 8. 8)，20mmol/L KCl，16mmol/L MgSO4, 20mmol/L (NH4)2SO4jO. 2% (v/v) Tween 20，1· 6mol/L Betaine 和 2· 5mmol/L dNTP ；引物混合物包括40pmol/L上游內部引物FIP，40pmol/L下游內部引物BIP， 5pmol/L上游外部引物F3，5pmol/L下游外部引物B3 ；顯色劑為STORGreen I。本發明的具體檢測過程如下1對陽性糞DNA樣品進行擴增1)多房棘球絳蟲感染犬陽性糞DNA的制備陽性糞便的獲得將多房棘球蚴感染犬，40天后剖檢感染犬分別收集糞便(含有蟲卵)和成蟲，將糞便于-70°C凍存1周。陽性糞DNA的制備根據糞DNA提取試劑盒說明書提取糞DNA。2) 2 X LAMP反應液的制備①1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)的配置稱取 91g Tris 置于燒杯中，加入 400mL 去離子水，充分溶解，用HCl調節pH值至8. 8，定容于500mL，備用；②配置2 X LAMP反應液前按表1所示配方配置90mL混合液表 1
權利要求
1.從犬糞中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒，其特征在于試劑盒中包括有四個特異性引物，這四個特異引物分別是SEQ Na USEQ Na 2, SEQ Na 3, SEQ Ns 4。
2.根據權利要求1所述的從犬糞中檢測多房棘球絳蟲的試劑盒，其特征在于試劑盒中有LAMP反應液、弓丨物混合物、Bst DNA聚合酶、標準陽性模板以及顯色劑。
3.權利要求1或2所述的試劑盒在配制檢測犬糞便中檢測多房棘球絳蟲的試劑的用途。
4.權利要求1所述的從犬糞便中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒的使用方法，其特征是從犬糞便中提取DNA，分別配制LAMP反應液和引物混合液，將所得到的犬糞便DNA與 LAMP反應液、引物混合液和Bst DNA聚合酶混合后進行LAMP擴增反應，在反應產物中入顯色劑或對反應產物進行電泳，根據反應產物是否顯色或在電泳中是否有梯度條帶確定被檢樣品是否有多房棘球絳蟲病原。
全文摘要
本發明公開一種用于檢測犬糞是否存在房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis)病原的LAMP檢測試劑盒和該試劑盒的用途。本發明的從犬糞中檢測多房棘球絳蟲病原的試劑盒中包括有四個特異性引物，這四個特異引物分別是上游外部引物SEQ №；下游外部引物SEQ №2；上游內部引物SEQ №3和下游內部引物SEQ №4。本發明可以快速檢測出犬糞便中是否有多房棘球絳蟲病原體，其敏感性高、操作簡便、特異性強、快速等特點。
文檔編號C12Q1/68GK102433378SQ20111034647
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者倪興維, 婁忠子, 李宏民, 賈萬忠, 閆鴻斌 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所