專利名稱：一種噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的計數方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物測定技術，具體屬于一種噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的計數方法。
背景技術：
噬菌蛭弧菌制劑是一種無毒副作用、無藥物殘留的綠色產品，內含豐富的具有獨特噬菌特性的噬菌蛭弧菌，是水產養(yǎng)殖中常用的水質微生物改良劑。然而，缺少質量標準是噬菌蛭弧菌制劑在開發(fā)研制中存在的主要問題之一，而導致質量標準缺乏的最大的問題之一就是活菌數與標簽不符，有些甚至難以檢測到活菌。因此，穩(wěn)定可靠的噬菌蛭弧菌制劑的計數方法無疑對噬菌蛭弧菌制劑正常生產及其質量控制具有重要的意義。目前，顯微鏡直接計數法、稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法等噬菌蛭弧菌制劑的傳統(tǒng)計數方法由于存在一些缺陷，使計數結果不穩(wěn)定。例如，顯微鏡直接計數法無法區(qū)分死菌體和活菌體，計數結果是死菌體和活菌體的總和；稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法因梯度稀釋使噬菌蛭弧菌濃度不斷降低，最終導致濃度低的噬菌蛭弧菌因檢測不到而使檢測結果不準確。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的計數方法。本發(fā)明提供的一種噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的計數方法，包括如下步驟1)樣品的制備無菌操作隨機稱取噬菌蛭弧菌粉lg，加入盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液，共設 3個平行樣；2)樣品的稀釋取3個平行樣，分別進行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10的稀釋母液，加入盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到1 103、1 IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9等稀釋度的稀釋液，每次稀釋時必須更換ImL玻璃移液管；3)培養(yǎng)將 1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9等的稀釋液置于轉速為200r/min、溫度為；35 37°C的溫控搖床中，培養(yǎng)M 32h ；以盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照；4)測定以盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照，無菌操作用ImL玻璃移液管分別吸取0. ImL孵育M 3 變渾濁的各稀釋液與大腸桿菌菌懸液同時加入0. 6%自來水軟瓊脂中65°C溫育，待凝固后置于30°C生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 48 72h，觀察有無噬菌斑的產生；將觀察有噬菌斑產生、且變渾濁的稀釋液所對應的稀釋度的倒數即為噬菌蛭弧菌粉的活菌含量(cfu/g)。本發(fā)明有效活菌總數定量測定的方法與顯微鏡直接觀察法、稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法相比更準確，克服了稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法因稀釋造成檢測不準確、以及顯微鏡直接觀察法無法區(qū)分死菌體、活菌體的弊端，可測定出噬菌蛭弧菌粉的有效活菌含量。
具體實施例方式實施例11材料與方法1.1實驗材料噬菌蛭弧菌粉BBM，通過自來水雙層瓊脂平板法測定的有效活菌含量為 3Xl(fpfu/g，購于山西省衛(wèi)氏魚康實業(yè)有限公司；ImL玻璃移液管、無菌玻璃涂布棒、1. 5% 自來水瓊脂平板、0. 6%自來水軟瓊脂(65°C溫育)、營養(yǎng)肉湯、50mL具塞離心管、載玻片，購于國藥集團化學試劑有限公司；大腸桿菌，購于TaKaRa公司；ImL玻璃移液管、營養(yǎng)肉湯、盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管、0. 6%自來水軟瓊脂(65°C溫育)，于 121°C條件下滅菌20min ；生化培養(yǎng)箱，購于日本三洋公司；漩渦振蕩儀，購于上海淇特分析儀器有限公司；溫控搖床，購于美國i^orma kientific公司。1. 2大腸桿菌菌懸液的制備1.3樣品的制備無菌操作隨機稱取噬菌蛭弧菌粉BBM lg，加入盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成樣品，即1 10的稀釋母液。實驗共有3個平行樣。1.4樣品的稀釋取3個平行樣，分別進行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10 的稀釋母液，加入盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2 的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U IO7U 108、 1 IO9等稀釋度的稀釋液，每次稀釋時必須更換ImL玻璃移液管。1.5 培養(yǎng)將1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9等的稀釋液置于轉速為200r/min、溫度為35 37°C的溫控搖床中，培養(yǎng) 24 32h。以盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照。1.6 測定以盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照，無菌操作用 ImL玻璃移液管分別吸取0. ImL孵育M 3 變渾濁的各稀釋液與大腸桿菌菌懸液同時加入0. 6%自來水軟瓊脂(65°C溫育)中，待凝固后置于30°C生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 72h，觀察有無噬菌斑的產生。將觀察有噬菌斑產生、且變渾濁的稀釋液所對應的稀釋度的倒數即為噬菌蛭弧菌粉的活菌含量(pfu/g)。2實驗結果實驗結果見表1。實驗結果表明，稀釋度為1 10 1 IO9的噬菌蛭弧菌粉BBM 在孵育M 32h后渾濁，而且稀釋度為1 10 1 IO8在自來水雙層瓊脂平板上可觀察到典型的噬菌斑；然而，稀釋度為1 IO9的噬菌蛭弧菌粉BBM在孵育M 3 后雖然渾濁，但在自來水雙層瓊脂平板上未觀察到典型的噬菌斑。因此，噬菌蛭弧菌粉BBM的有效活菌含量為IO8 lOYfu/g，與通過自來水雙層瓊脂平板法測定的噬菌蛭弧菌粉BBM有效活菌含量的數量級高1個數量級。表1噬菌蛭弧菌粉BBM有效活菌總數的測定結果
稀釋度是否渾池有無噬菌斑
1 10是有—
1 IO2是有
1 IO3是有
1 IO4是有
1 IO5是有
1 IO6是有
1 IO7是有
1 IO8是有
1 IO9是無3 結論本實驗有效活菌總數的定量方法與顯微鏡直接觀察法、稀釋倒自來水雙層瓊脂平 板法相比更準確，克服了稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法因稀釋造成檢測不準確、以及顯微 鏡直接觀察法無法區(qū)分死菌體、活菌體的弊端，可測定出噬菌蛭弧菌粉BBM的有效活菌含 量。其原理是將待測樣品經過適當稀釋之后，其中的噬菌蛭弧菌充分分散成單個細胞，然后 在10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯中通過孵育培養(yǎng)而生長繁殖，從而形成肉眼可見的渾濁液，再 進ー步通過噬菌斑檢測確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的噬菌蛭弧菌，最后確定待測樣 品的有效活菌總數。
權利要求
1. 一種噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的計數方法，其特征在于，包括如下步驟1)樣品的制備無菌操作隨機稱取噬菌蛭弧菌粉lg，加入盛有9mL10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液，共設3個平行樣；2)樣品的稀釋取3個平行樣，分別進行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取 ImL 1 10的稀釋母液，加入盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9等稀釋度的稀釋液，每次稀釋時必須更換ImL玻璃移液管；3)培養(yǎng)將1 10 的稀釋母液以及 1 IO2U IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9等的稀釋液置于轉速為200r/min、溫度為35 37°C的溫控搖床中，培養(yǎng) 24 32h ；以盛有9mL 10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照；4)測定以盛有9mL10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對照，無菌操作用ImL玻璃移液管分別吸取0. ImL孵育M 3 變渾濁的各稀釋液與大腸桿菌菌懸液同時加入0.6%自來水軟瓊脂(65°C溫育)中，待凝固后置于30°C生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 48 72h，觀察有無噬菌斑的產生；將觀察有噬菌斑產生、且變渾濁的稀釋液所對應的稀釋度的倒數即為噬菌蛭弧菌粉的活菌含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的計數方法，是將待測樣品經過適當稀釋之后，其中的噬菌蛭弧菌充分分散成單個細胞，然后在10倍稀釋的無菌營養(yǎng)肉湯中通過孵育培養(yǎng)而生長繁殖，從而形成肉眼可見的渾濁液，再進一步通過噬菌斑檢測確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的噬菌蛭弧菌，最后確定待測樣品的有效活菌總數。本發(fā)明的方法與顯微鏡直接觀察法、稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法相比更準確，克服了稀釋倒自來水雙層瓊脂平板法因稀釋造成檢測不準確、以及顯微鏡直接觀察法無法區(qū)分死菌體、活菌體的弊端。
文檔編號C12Q1/08GK102352405SQ20111034733
公開日2012年2月15日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權日2011年11月7日
發(fā)明者何珊, 衛(wèi)若鵬, 曹海鵬 申請人:山西衛(wèi)氏魚康實業(yè)有限公司, 山西省生物獸藥飼料工程技術研究中心(有限公司)