專利名稱：H6亞型禽流感病毒rt-lamp試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及禽流感病毒檢測領域，尤其是一種H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑
品.ο
背景技術：
禽流感AI是被動物衛生組織(OIE)列為A類的一種急性烈性傳染病，國內也將其列為一類疫病。AI是由禽流感病毒AIV引起的，主要引發禽類的呼吸系統疾病，并以急性發病、高死亡率和產蛋率下降為特征。H6亞型AIV(H6 subtype avian influenza virus)雖然不是高致病性禽流感病毒，但是它在禽類間可以傳播，造成禽類的隱形感染，還有可能抗原漂移或轉變形成新的毒力更強的毒株，因此早期、快速、準確的診斷十分重要。常規的禽流感病毒診斷方法有病毒分離、血凝(HA)及血凝抑制(HI)試驗、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫組織化學以及免疫熒光技術(IF)等。然而，這些方法都存在檢測周期長、靈敏度不高、特異性不強、不適合基層活禽市場或者進出口大量樣本的檢測等。 如今，隨著進出口品種和類目增加，迫切需要適應基層和邊境口岸的簡便、快速檢測方法及試齊LU環介導的等溫核酸擴增在等溫條件下，即水浴鍋中就可完成擴增反應，不需要特殊儀器設備，如PCR儀等，檢驗周期很短，在一小時內即可完成反應。反應完成后，可直接通過加入熒光染料，通過肉眼觀察就能直接判斷反應結果。與其他的檢測技術相比，推廣應用難度較低。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種檢測簡便快速、靈敏度高、特異性強、儀器要求低、成本低廉的H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒，以適應基層和邊境口岸現場H6亞型禽流感的檢測。為解決上述技術問題本發明采用如下技術方案H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑反應液A 含有 IOX 等溫反應緩沖液、AMV 5U/y L, Rnasin 20U/y L, Bst DNA PoLymerase8U/μ LUOmM dNTP、25mM硫酸鎂、5Μ的甜菜堿、10 μ M的外引物1和外引物2、 30μΜ的內引物1和內引物2、40μΜ的環引物1和環引物2 ;10Χ等溫反應緩沖液含有 200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通X-100 ；外引物1 序列為 GGGAATCCCCAATGCGAC，外引物2 序列為 TCTACTCCTGCCCATGTACT，內引物 1 序列為 GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT，內引物 2 序列為 CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT，環引物1 序列為 TAGGTCTTTCCACTATAT，
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環引物2 序列為 CACTTATTGGATCAGGAGA ；反應液B 50 X SYBR Green I 熒光染料。反應液A每管23yL，其組成為2. 5yL IOX等溫反應緩沖液、1. 0 μ L AMV 5U/ μ LU. 0μ L Rnasin 20U/y LU. 0μ L Bst DNA PoLymerase 8U/y L>5y L 25mM硫酸鎂、 3. 5μ L 10mMdNTP,5y L 5M的甜菜喊、0.5yL 10 μ M 的夕卜弓 |物 1 禾口 0· 5 μ L 10 μ M 夕卜弓 |物 2、 LOyL 30 μ M的內引物1禾口 LOyL 30 μ M內引物2、0. 5 μ L 40 μ M的環弓丨物1禾口 0. 5 μ L 40 μ M環弓丨物2 ；反應液B每管2 μ L。本發明采用逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)技術，并根據Η6亞型AIV血凝素 (HA)基因序列(見序列表SEQ. ID. No. 1)的保守區八個位點設計了 LAMP的6條特異性引物，由此發明了用于快速檢測H6亞型禽流感病毒(AIV)的H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒。應用本發明的RT-LAMP試劑盒建立H6亞型禽流感病毒檢測方法，通過對家禽咽喉及泄殖腔棉拭子樣品的RNA提取，環介導等溫擴增、擴增產物的顯色檢測，從而檢測出H6亞型禽流感病毒。該法無需特殊儀器，只需在水浴鍋中進行，反應時間短，僅為一個小時，反應完成后，可直接通過肉眼觀察判定結果，實現了簡便、靈敏、快速地檢測H6亞型AIV。因而，特別適合基層和邊境口岸現場檢測H6亞型禽流感的需要，對該病的防控具有重要意義。


圖1是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法特異性日光下觀察結果圖。圖2是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法特異性紫外光下觀察結果圖。圖1和圖2中1雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)，2雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)， 3雞毒支原體(MG)，4新城疫病毒(NDV)，5 Hl亞型禽流感病毒(AIV)，6 H3亞型禽流感病毒 (AIV)，7H5亞型禽流感病毒(AIV)，8H7亞型禽流感病毒(AIV)，9H9亞型禽流感病毒(AIV)， 10H6亞型禽流感病毒AIV。圖3是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法特異性瓊脂糖凝膠電泳結果圖，圖中M DL2000DNA分子量標準，1空白對照，2雞傳染性支氣管炎病毒 (IBV)，3雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)，4雞毒支原體(MG)，5新城疫病毒(NDV)，6H1亞型禽流感病毒(AIV)，7H3亞型禽流感病毒(AIV)，8H5亞型禽流感病毒(AIV)，9H7亞型禽流感病毒(AIV)，10H9亞型禽流感病毒(AIV)，11H6亞型禽流感病毒AIV。圖4是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法敏感性日光下觀察結果圖。圖5是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法敏感性紫外光下觀察結果圖。圖4和圖5中1-7分別為以下不同濃度的H6亞型禽流感病毒RNA Ing/管， IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，0. Ipg/ 管，0. Olpg/ 管，Ifg/ 管。圖6是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法敏感性瓊脂糖凝膠電泳結果圖，圖中M DL2000 DNA分子量標準，1空白對照，2-8分別為以下不同濃度的H6 亞型禽流感病毒 RNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，0. Ipg/ 管，0. Olpg/ 管，Ifg/管。圖7是應用本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的檢測方法靈敏度瓊脂糖凝膠電泳結果圖，圖中M DL2000DNA分子量標準，1空白對照，2-8分別為以下不同濃度的 H6 亞型禽流感病毒 RNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，0. Ipg/ 管，0. Olpg/ 管，Ifg/管。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
，對本發明H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒作進一步詳細說明。一、H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒的配制<1> 反應液 A每管23yL，其組成為2.5yL IOX等溫反應緩沖液、1. 0 μ L AMV 5U/ μ L, 1. 0 μ LRnasin 20U/y LU. 0μ L Bst DNA PoLymerase 8U/y L>5y L 25mM 硫酸鎂、3. 5 μ L 10mMdNTP,5y L 5M 的甜菜堿、0.5yL 10 μ M 的夕卜弓 |物 1 禾口 0. 5 μ L 10 μ M 夕卜弓 |物 2、1. 0 μ L 30μΜ的內引物1禾口 1. 0μ L 30μΜ內引物2、0. 5μ L 40口] 的環弓|物1禾口0.5口1^ 40 μ M環引物2。其中，IOX等溫反應緩沖液含有200mM pH值為8. 8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1 %曲拉通X-100。外引物1 序列為 GGGAATCCCCAATGCGAC(見序列表 SEQ. ID. No. 2)，外引物2 序列為 TCTACTCCTGCCCATGTACT (見序列表 SEQ. ID. No. 3)，內引物 1 序列為 GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT (見序列表 SEQ. ID. No. 4)，內引物 2 序列為 CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT (見序列表 SEQ. ID. No. 5)，環引物1 序列為 TAGGTCTTTCCACTATAT (見序列表 SEQ. ID. No. 6)，環引物2 序列為 CACTTATTGGATCAGGAGA(見序列表 SEQ. ID. No. 7)。<2> 反應液 B每管2 μ L，其組成為50 X STOR Green I熒光染料。二、應用本發明Η6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒檢測Η6亞型禽流感病毒的方法(以下簡稱RT-LAMP檢測法)主要步驟為<1>家禽咽喉、泄殖腔棉拭子樣品的RNA提取取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于500 μ L生理鹽水中，然后將棉拭子充分捻動，在試管壁上擠壓干凈后，以6000r/min離心15min，取上清250μ L，加入500μ L TRIzol LS reagent，混勻后室溫靜置lOmin，加入200 μ L氯仿，輕微振蕩混勻，4°C、12000r · min-1離心IOmin,取上清約500 μ L，加入500 μ L異丙醇，混勻后室溫靜置lOmin, 12000r .min-l離心lOmin，沉淀干燥后懸于適量的DEPC處理水中，即為待檢RNA備用。<2>H6亞型禽流感病毒環介導等溫擴增
在裝有23111^反應液4管中加入2111^待檢1 織，于60-651恒溫水浴中放置60111士11。<3>擴增產物的顯色反應在上述反應管中加入1 μ L反應液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變為翠綠色，則說明樣品中含有Η6亞型禽流感病毒；如果顏色仍為橙色，說明待檢樣品中不含Η6亞
型禽流感病毒。三、RT-LAMP檢測法的特異性和敏感性試驗利用優化好的RT-LAMP 反應體系，以 Η1、Η3、Η5、Η7、Η9 亞型 AIV 及 NDV、IBV、ILTV、 MG核酸為待檢樣品進行檢測，檢驗RT-LAMP方法的特異性。將制備好的H6AIV RNA按10倍倍比稀釋，并用Beckman UV-800紫外分光光度計測定稀釋后各個梯度的RNA濃度，分別為 lng、lOOpg、10pg、lpg、0. lpg、0. Olpg、Ifgo 對各濃度 RNA 用 RT-LAMP 方法進行擴增，并用一步RT-PCR方法同時進行擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果確定該方法的敏感度。如圖1至圖3所示，特異性試驗結果表明H6亞型AIV RT-LAMP的特異性良好。如圖1所示，加入STOR Green I染料后H6亞型AIV陽性樣品呈綠色，顯示為陽性。IBV、ILTV、 MG,NDV,Hl亞型AIV、H3亞型AIV、H5亞型AIV、H7亞型、AIV H9亞型AIV為成橙紅色，顯示為陰性。如圖2所示，將其放置紫外線下，陽性產物管發出很強的綠色熒光，而陰性管不發出綠色熒光；如圖3所示，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性產物出現特異性的梯狀條帶，陰性產物無條帶出現。如圖4至圖7所示，敏感性試驗結果表明RT-LAMP方法對H6亞型AIV病毒的RNA 的最小檢測限為0. Olpg,而常規RT-PCR對H6亞型AIV病毒的RNA的最小檢測限為lpg， LAMP法的靈敏度是RT-PCR方法的100倍。四、臨床樣品檢測在活禽市場采集62份棉拭子樣品，用雙抗(青-鏈霉素組合)磷酸鹽緩沖液(PBS) 處理后接種雞胚尿囊腔，收取24-96小時死亡或未死亡雞胚尿囊液，進行病毒分離。同時對 62份棉拭子樣品進行RNA抽提，利用上述建立的H6AIV RT-LAMP方法、傳統RT-PCR方法及病毒分離法進行檢測，驗證RT-LAMP方法的可靠性。結果如表1 在選取的62份臨床樣品中，用RT-LAMP方法檢測到6份陽性，用 RT-PCR檢測到5份陽性。病毒分離到6株H6亞型AIV病毒陽性樣品。RT-LAMP方法的檢測結果與病毒分離結果符合率為100%。表1H6亞型AIV臨床樣品檢測結果
權利要求
1.一種H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒含有以下試劑反應液 A 含有 IOX 等溫反應緩沖液、AMV 5U/y L、Rnasin 20υ/μ L、Bst DNA PoLymerase8U/ μ LUOmM dNTP、25mM硫酸鎂、5Μ的甜菜堿、10 μ M的外引物1和外引物2、30μΜ的內引物 1和內引物2、4(^11的環引物1和環引物2;所述IOX等溫反應緩沖液含有200mMpH值為 8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和曲拉通 X-100 ；所述外引物1序列為GGGAATCCCCAATGCGAC， 所述外引物2序列為TCTACTCCTGCCCATGTACT，所述內引物 1 序列為 GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT， 所述內引物 2 序列為 CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT， 所述環引物1序列為TAGGTCTTTCCACTATAT， 所述環引物2序列為CACTTATTGGATCAGGAGA ； 反應液B 50 X STOR Green I熒光染料。
2.根據權利要求1所述的H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒，其特征在于所述反應液A每管23yL，其組成為2. 5yL IOX等溫反應緩沖液、1. 0 μ L AMV 5U/y LU. 0μ L Rnasin 20U/y LU. 0μ L Bst DNA PoLymerase 8U/y L,5y L 25mM 硫酸鎂、3. 5 μ L IOmM dNTP,5y L 5Μ的甜菜堿、0. 5yL 10 μ M的夕卜弓|物1禾口 0. 5 μ L 10 μ M夕卜弓|物2、1. 0 μ L 30 μ M的內引物1禾口 1. 0μ L 30 μ M內引物2、0. 5μ L 40 μ M的環引物1禾口 0. 5 μ L40 μ M環引物2 ；所述反應液B每管2 μ L。
全文摘要
本發明公開了一種H6亞型禽流感病毒RT-LAMP試劑盒，它采用逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)技術，并根據H6亞型AIV血凝素(HA)基因序列的保守區八個位點設計了LAMP的6條特異性引物。應用本發明及其建立的檢測方法，解決了現有技術的檢測周期長、靈敏度不高、特異性不強、操作復雜、儀器要求高等缺陷，特別適合基層和邊境口岸現場檢測H6亞型禽流感的需要，對該病的防控具有重要意義。
文檔編號C12R1/93GK102344972SQ20111034771
公開日2012年2月8日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者劉加波, 周辰瑜, 龐耀珊, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所