專利名稱：一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法
一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法
技術領域：
本發明涉及生物基化學品的生物制造和生物煉制領域，具體地說，是以玉米秸桿等木質纖維素為原料，在高溫條件下高效生物轉化木質纖維素生產高濃度和高光學純度乳酸的方法。
背景技術：
乳酸是合成多種化學品的重要中間體，可廣泛應用在食品、藥品、化妝品、制革、紡織、環保和農業生產中。目前最重要的用途是從L-乳酸生產可以取代聚乙烯和聚丙烯等聚合材料的可降解聚乳酸產品(Polymeric lactic acid,PLA)。這一可降解聚合材料產品已經大量工業化，是替代石油基聚合材料的最為重要的生物材料。隨著聚乳酸產品的廣泛應用，全球對乳酸的需求量也隨之增加。目前，主要通過化學合成和生物發酵兩種方法來生產乳酸，但以生物發酵法為主，全球大約90%的乳酸產量來源于生物發酵。發酵生產乳酸的原料可以是葡萄糖、蔗糖、糖蜜和淀粉等，工業上常用可溶性淀粉和糖蜜，但發酵法生產乳酸的成本約有70%米源于原料，因此，使用廉價的原料生產乳酸，可大大降低乳酸的生產成本。秸桿是糧食生產中的副產物，主要由纖維素、半纖維素和木質素三部分構成，其中可發酵性的纖維素和半纖維素約占秸桿干重的一半以上。我國的秸桿資源豐富，每`年的秸桿產量約為7億噸，但是由于缺乏合理的利用模式，這些秸桿通常被就地焚燒掉，從而造成了巨大的環境污染和交通安全。因此，利用儲量豐富、價格低廉的秸桿原料，采用生物發酵的方法生產乳酸具有廣闊的前景。利用玉米秸桿生產乳酸的工藝主要包括秸桿的預處理、預處理后秸桿的生物脫毒、脫毒后纖維素的酶解與乳酸發酵以及乳酸的分離等。近年來，利用木質纖維素原料發酵生產乳酸的研究多有報道。Cui等人(Bioresource Technology, 2011,102(2), 1831-1836)研究了在 37 °C 下，混合培養Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus brevis在3%固體含量下同步糖化與發酵玉米稻桿生產乳酸，最終得到的乳酸濃度為20g/L左右。Maas等人(AppliedMicrobiologyand Biotechnology，2008，78 (5)，751-758)在 50°C下，在 14.8% 固體含量下同步糖化與發酵小麥秸桿生產乳酸得到40.7g/L。陳樹林等(中國專利公開號CN101935618A)利用短乳桿菌發酵含可利用糖56.9g/L的木質纖維素稀酸水解液，在48h內產生39.lg/L的乳酸。王冬梅等(中國專利公開號CN1908184)利用黑曲霉進行第一次固態發酵64-72小時，發酵液過濾后濾液接種米根酶進行第二次液態發酵12-36小時，經過兩次發酵后，每IOOg干物質可以產生6-12g左右的乳酸。盡管目前對利用木質纖維素生產乳酸的研究很多，但是由于缺乏能夠處理高固體含量木質纖維素進行同步糖化與發酵的生物反應器，大多數研究都是在較低的固體含量下進行，發酵液中的乳酸濃度一般都低于50g/L，從而增加了后續乳酸分離的難度和成本。通常，大宗化學品在發酵液中的濃度低于100g/L，則此生產工藝不具有工業化的前景。此外，纖維素酶的最佳酶解條件是50°C，pH4.8左右，而乳酸發酵菌種的生長溫度一般都低于450C。因此，在常規的利用木質纖維素原料同步糖化與發酵生產乳酸的研究中，采用的溫度都低于40°C，使纖維素的酶解效率非常低，從而大大限制了乳酸的生產速率和產率。

發明內容本發明目的在于使用能夠處理高固體含量木質纖維素原料進行同步糖化與發酵的生物反應器，在溫度高達48°C和固體含量達30% (w/w/)的條件下同步糖化與發酵木質纖維素原料生產高濃度和高光學純度乳酸的方法。本發明的構思:一種高溫條件下高效生物轉化木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，具體地說是將發明人所在實驗室篩選分離的耐高溫的乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2，活化之后接種于能夠處理高固體含量木質纖維素原料進行同步糖化與發酵的生物反應器中，加入纖維素酶，乳酸片球菌把纖維素酶解生成的可發酵性糖同步轉化為乳酸；乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2可在48°C,pH5.5的條件下正常生長發酵，該條件與纖維素酶的最佳酶解條件(50°C、pH4.8)非常接近，因此可實現高效的同步糖化與發酵木質纖維素原料生產高濃度乳酸。基于可處理高固體含量木質纖維素原料固步糖化與發酵的生物反應器和耐高溫的乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2,本發明可以實現在高溫下生物轉化木質纖維素生產高濃度乳酸。本發明的目的是通過以下技術方案米實現的:一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其具體步驟為，(I)極低水用量的木質纖維素原料高溫稀酸預處理:取干基玉米秸桿，按2: I的固液比(w/w)加入濃度為5% (w/w)的稀硫酸，攪拌均勻后，浸泡12-16小時；然后按100%的裝填率(即將預處理反應器裝滿)將預浸好的玉米秸桿裝填入預處理反應器中進行預處理，溫度為190°C、1.2MPa，維持3分鐘；預處理結束后，迅速打開預處理反應器的排氣閥，使反應器內壓力迅速降至常壓；然后取出物料并冷卻至室溫，盛入塑料袋中備用；預處理方法包括稀酸預處理、機械預處理、堿法預處理、蒸汽爆破預處理、氨纖維膨爆預處理、熱水預處理、生物預處理等，優選稀酸預處理；對木質纖維素原料進行預處理可以破壞木質纖維素的固有結構，提高可酶解性；(2)預處理后木質纖維素原料的固態生物脫毒從Amorphotheca resinae ZNl斜而接一環抱子于PDA斜面培養基,25°C靜置培養3天后，用20mL無菌水將斜面上的孢子洗出，接入盛有200g稀酸預處理后且pH調整至6.0的玉米秸桿的生物脫毒反應器中，維持25°C、60%的濕度進行脫毒共培養3天；將上述脫毒共培養3天的200g秸桿接入盛有2000g稀酸預處理后且pH調整至6.0的玉米秸桿的生物脫毒反應器中，維持25°C、60%的濕度進行脫毒共培養3天；脫毒后將物料保存于_20°C冰箱中待用；生物脫毒所脫除的有害物質為木質纖維素在預處理過程中的一些降解產物，主要包括有機酸類如甲酸、乙酸，呋喃類如糠醛、羥甲基糠醛，酚類化合物如香蘭素、對羥基苯甲醛等；用于高濃度乳酸發酵的木質纖維素原料經過預處理和抑制物脫除的原料，抑制物脫除方法包括生物脫毒、水洗脫毒、過堿化處理(Overliming)、活性炭吸附、樹脂吸附等，優選生物脫毒。抑制物脫除可以除去預處理過程產生的對纖維素酶解和乳酸片球菌生長和發酵起抑制作用的化合物，從而提高纖維素轉化率和乳酸得率；(3)利用液體培養基培養乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2:液體培養基組分為葡萄糖10 50g/L,酵母粉I 10g/L,蛋白胨I 20g/L,硫酸銨0.1 10g/L，七水合硫酸鎂0.1 10g/L，四水合硫酸錳0.1 10g/L，磷酸二氫鉀0.1 20g/L，乙酸鈉I 10g/L，種子培養條件為:溫度30 50°C，轉速50 500rpm，時間12 36小時，0D_值I 10 ；OD600值是指含有菌體的溶液在600nm波長處的吸光值；乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2是發明人所在實驗室自行篩選分離的菌種。

所述的發酵菌種為乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2,此菌可在溫度50°C, pH 5.5的條件下快速發酵葡萄糖生成高濃度乳酸，此條件與纖維素酶的最適酶解條件相同，利用此菌種發酵木質纖維素原料生產高濃度乳酸，可以在同一反應器內實現木質纖維素糖化和乳酸發酵過程的高度同步和集成；所述菌株為乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2,但本發明所涉及的菌種不限于所提供的菌種，還包括能夠發酵生產乳酸的其他菌種，如Lactobacillusrhamnosus,Lactobacillus delbrueckii等，以及通過誘變、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株；(4)發酵罐中同步糖化與發酵生產乳酸:本發明使用的適合于同步糖化與發酵的反應器為自行設計，詳細結構參見Zhang等人(Biotechnology and Bioengineering, 2010,105, 718-728)發表的文獻。該新型生物反應器由罐體、加料口、放料口、無菌空氣入口、氣體分散器、pH電極、溶氧電極、溫度電極、功率測定儀和一個新型螺帶式攪拌槳組成。反應器容積為5L，攪拌槳由正螺旋螺帶槳、渦輪/翼型攪拌槳和底槳，正螺旋螺帶槳通過支撐桿固定在攪拌軸上，并自上而下盤旋在攪拌軸周邊；渦輪/翼型攪拌槳設置于正螺旋螺帶槳形成的框體內，固定在正螺旋螺帶槳的上下兩個端部之間的攪拌軸上；底槳固定在攪拌軸的底端，緊貼罐體底部。將步驟(2) (3)培養獲得的發酵菌種和原料加入到適合于同步糖化與發酵的反應器，調整到所需的固體含量(15-45%，《/ )，加入營養鹽，以及纖維素酶，在481:，？!1 5.5的條件下同步糖化與發酵木質纖維素原料生產乳酸；所述的木質纖維素的干基質量占發酵罐中添加的所有物質總質量的質量分數為10 50%，纖維素酶為5 30FPU/g DM,發酵溫度30 50°C ;所述的營養鹽相對于發酵罐中總的液體體積的濃度分別是酵母提取物0.1 10g/L，硫酸銨0.1 10g/L，七水合硫酸鎂0.1 10g/L，磷酸二氫鉀0.1 20g/L。乳酸球菌在發酵罐中發酵溫度30 50°C ;木質纖維素干基質量占發酵罐中添加的所有物質總質量的質量分數為15 45%;纖維素酶量為5 30FPU/gDM ;發酵pH 4.5
6.5，發酵時間為24 96小時；FPU為纖維素酶濾紙酶活，DM (Dry matter)是指木質纖維素干物質。所述的木質纖維素原料選自固體秸桿原料或者固體秸桿處理物；其中:
所述的木質纖維素原料選自玉米秸桿、麥秸、稻草、木屑、能源植物或者林業廢棄物中，優選玉米秸桿。所述的木質纖維素原料處理物選自采用稀酸、蒸汽爆破、氨氣爆破、生物法方式預處理后的玉米秸桿、麥秸、稻草、木屑、能源植物、林業廢棄物中的一種。所述的乳酸，包括游離態的乳酸，以及調節發酵pH所生成的乳酸鹽，如乳酸鈉，乳酸鈣，乳酸銨等。與現有技術相比，本發明的積極效果是:(I)本發明以木質纖維素為原料發酵生產乳酸，基質成本低廉，來源廣泛，充分利用了可再生資源，“不與人類爭糧，不與糧爭地”，能夠滿足乳酸不斷擴大的市場需求；(2)本發明使用自行設計的適合于木質纖維素原料高固體含量同步糖化與發酵的反應器，有效解決了高粘度體系的混合和傳質問題，為在高固體含量下發酵纖維素原料生產高濃度乳酸提供了保障，進而降低了分離純化工段的成本；(3)本發明可以在溫度高達48°C的條件下以木質纖維素為原料生產乳酸，可以有效提高纖維素的酶解效率，減少纖維素酶用量，減少冷卻水的使用，從而降低生產成本；此夕卜，高溫也可以降低發酵過程染菌的風險；(4)本發明以木質纖維素為原料高效發酵生產乳酸，可以借鑒現有纖維乙醇生產相關技術，實現從木質纖維素生產高附加值的聚乳酸，實現基于木質纖維素的大宗精細化學品生物煉制。

圖1實施例1發酵過程曲線圖；圖2實施例2發酵過程曲線圖。
具體實施方式以下提供本發明一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法的具體實施方式
。實施例1清參見附圖1，烘干的玉米秸桿與稀硫酸溶液混合至含水量33% (w/w)，硫酸濃度
2.5% (w/w), 190°C預處理3min ;預處理后物料調節pH至5.5,含水量60% (w/w),加入生物脫毒所用菌種Amorphotheca resinae ZN1,25°C固態培養7天；收獲物料，物料在115°C下滅菌20分鐘，冷卻后加入發酵罐中，調節發酵罐中固體含量為25% (w/w)，纖維素酶用量為15FPU/gDM，50 V預先糖化8h，5M氫氧化鈉控制發酵過程pH在5.5，48 °C下發酵72小時，最終乳酸濃度81.80g/L。實施例2清參見附圖2，烘干的玉米秸桿與稀硫酸溶液混合至含水量33% (w/w)，硫酸濃度
2.5% (w/w), 190°C預處理3min,預處理后物料調節pH到5.5,含水量60% (w/w),加入生物脫毒所用菌種Amorphotheca resinae ZN1,25°C固態培養7天；收獲物料，物料在115°C下滅菌20分鐘，冷卻后加入發酵罐中，發酵罐中固體含量為質量分數30%，纖維素酶用量為15FPU/gDM，50°C預先糖化8h， 5M氫氧化鈉控制發酵過程pH在5.5，48°C下發酵72小時，最終乳酸濃度101.60g/L。本發明所涉及的木質纖維素原料不限于玉米秸桿，還可以為麥秸、稻草、木屑、能源植物或者林業廢棄物中的一種；木質纖維素處理物選自采用稀酸、蒸汽膨爆、液氨膨爆、生物法預處理后的麥秸、稻草、木屑、能源植物、林業廢棄物中的一種。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護 范圍內。
權利要求
1.一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，具體步驟為， (1)極低水用量的木質纖維素原料高溫稀酸預處理: 取干基玉米秸桿，按2: I的固液質量比加入質量濃度為5%的稀硫酸，攪拌均勻后，浸泡12 16小時；然后按100%的裝填率(即將預處理反應器裝滿)將預浸好的玉米秸桿裝填入預處理反應器中進行預處理，溫度為190°C、1.2MPa，維持3分鐘；預處理結束后，迅速打開預處理反應器的排氣閥，使反應器內壓力迅速降至常壓；然后取出物料并冷卻至室溫，盛入塑料袋中備用； (2)預處理后木質纖維素原料的固態生物脫毒 從Amorphotheca resinae ZNl斜面接一環抱子于PDA斜面培養基,25°C靜置培養3天后，用20mL無菌水將斜面上的孢子洗出，接入盛有200g稀酸預處理后且pH調整至6.0的玉米秸桿的生物脫毒反應器中，維持25°C、60%的濕度進行脫毒共培養3天；將上述脫毒共培養3天的200g秸桿接入盛有2000g稀酸預處理后且pH調整至6.0的玉米秸桿的生物脫毒反應器中，維持25°C、60%的濕度進行脫毒共培養3天；脫毒后將物料保存于_20°C冰箱中待用； (3)利用液體培養基培養乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2: 液體培養基組分為葡萄糖10 50g/L，酵母粉I 10g/L，蛋白胨I 20g/L，硫酸銨0.1 10g/L，七水合硫酸鎂0.1 10g/L，四水合硫酸錳0.1 10g/L，磷酸二氫鉀0.1 20g/L，乙酸鈉I 10g/L，種子培養條件為:溫度30 50°C，轉速50 500rpm，時間12 36小時，0D600值I 10 ; 0D600值是指含有菌體的溶液在600nm波長處的吸光值； (4)發酵罐中同步糖化與發酵生`產乳酸: 將步驟(2) (3)培養獲得的發酵菌種和原料加入到適合于同步糖化與發酵的反應器，調整到所需的固體質量百分比為15 45%，加入營養鹽，以及纖維素酶，在48°C，pH 5.5的條件下同步糖化與發酵木質纖維素原料生產乳酸。
2.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的發酵菌種為乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiDQ2,此菌可在溫度50°C,pH 5.5的條件下快速發酵葡萄糖生成高濃度乳酸，此條件與纖維素酶的最適酶解條件相同，利用此菌種發酵木質纖維素原料生產高濃度乳酸，可以在同一反應器內實現木質纖維素糖化和乳酸發酵過程的高度同步和集成。
3.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的菌株為乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2,但本發明所涉及的菌種不限于所提供的菌種，還包括能夠發酵生產乳酸的其他菌種，如Lactobacillusrhamnosus,Lactobacillus delbrueckii等，以及通過誘變、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。
4.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的木質纖維素的干基質量占發酵罐中添加的所有物質總質量的質量分數為10 50%，纖維素酶為5 30FPU/g DM,發酵溫度30 50°C。
5.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的營養鹽相對于發酵罐中總的液體體積的濃度分別是酵母提取物0.1 10g/L，硫酸銨0.1 10g/L，七水合硫酸鎂0.1 10g/L，磷酸二氫鉀0.1 20g/L。
6.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，乳酸球菌在發酵罐中發酵溫度30 50°C ;木質纖維素干基質量占發酵罐中添加的所有物質總質量的質量分數為15 45%;纖維素酶量為5 30FPU/gDM ;發酵pH 4.5 6.5，發酵時間為24 96小時；FPU為纖維素酶濾紙酶活，DM是指木質纖維素干物質。
7.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的木質纖維素原料選自固體秸桿原料或者固體秸桿處理物；其中: 所述的木質纖維素原料選自玉米秸桿、麥秸、稻草、木屑、能源植物或者林業廢棄物中； 所述的木質纖維素原料處理物選自采用稀酸、蒸汽爆破、氨氣爆破、生物法方式預處理后的玉米秸桿、麥秸、稻草、木屑、能源植物、林業廢棄物中的一種。
8.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的乳酸，包括游離態的乳酸，以及調節發酵PH所生成的乳酸鹽，為乳酸鈉，乳酸鈣，乳酸銨。
9.如權利要求1所述的一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，其特征在于，所述的生物反應器由罐體、加料口、放料口、無菌空氣入口、氣體分散器、pH電極、溶氧電極、溫度電極、功率測定儀和一個新型螺帶式攪拌槳組成，攪拌槳由正螺旋螺帶槳、渦輪/翼型攪拌槳和底槳，正螺旋螺帶槳通過支撐桿固定在攪拌軸上，并自上而下盤旋在攪拌軸周邊；渦輪/翼型攪拌槳設置于正螺旋螺帶槳形成的框體內，固定在正螺旋螺帶槳的上下兩個端部之間的攪拌軸 上；底槳固定在攪拌軸的底端，緊貼罐體底部。
全文摘要
本發明涉及一種高溫條件下由木質纖維素生產高濃度乳酸的方法，具體步驟為，極低水用量的木質纖維素原料高溫稀酸預處理(1)預處理后木質纖維素原料的固態生物脫毒；(2)利用液體培養基培養乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2；(3)發酵罐中同步糖化與發酵生產乳酸；(4)將步驟(2)(3)培養獲得的發酵菌種和原料加入到適合于同步糖化與發酵的反應器，調整到所需的固體含量，加入營養鹽，以及纖維素酶，在48℃，pH 5.5的條件下同步糖化與發酵木質纖維素原料生產乳酸。本發明的優點在溫度48℃的條件下以木質纖維素為原料生產乳酸，提高纖維素的酶解效率，減少纖維素酶用量，減少冷卻水的使用，降低生產成本，并降低發酵過程染菌的風險。
文檔編號C12R1/01GK103103224SQ20111035564
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日 公開號201110355643.發明者鮑杰, 趙凱, 楚德強, 張建 申請人:華東理工大學