專利名稱：一種從土壤中分離純化大片段dna的方法
技術領域：
本發明涉及土壤微生物、生物化學及分子生物學領域，特別是從各種土壤中間接分離純化土壤微生物30kb以上大片段DNA用于構建宏基因組文庫，或者分離土壤微生物基因簇等。
背景技術：
土壤微生物是最有價值的天然產物來源，它們能提供了許多工業上十分重要的抗生素以及生物催化劑。各種微生物都有驚人的產生多樣化次級代謝產物的能力。Hammond估計地球上的微生物物種多達16X109，廣泛分布于各種生態系統中，其中，土壤無論從微生物數量和種類上都是首屈一指的生境。有人用科學的方法估計I克土壤中約有大于10000種不同的微生物，因此，土壤是微生物的大本營。但是，運用現有的技術，只有0.2% 2%的土壤微生物是可培養的，因此土壤中孕育著大量未被開發的生物基因資源。隨著基因組技術的發展，人們開始用分子生物學的方法來研究微生物間的進化關系和遺傳信息的功能關系。 環境基因組又稱多源基因組或宏基因組，是指從環境中提取總的DNA，對其進行遺傳學和功能學的研究。優點是不但可以原始地反映環境樣品中所有生物的遺傳多樣性，避開難培養這一技術瓶頸，而且可以把細胞外的DNA—并研究。通過環境基因組的方法可以獲得越來越多的DNA序列，且大都是新穎的未被純培養微生物的序列。運用環境基因組序列不但可以使我們逐漸了解微生物群落功能的復雜性，以及微生物間的相互作用關系，而且可以使我們深入了解未被純培養微生物的生理和生態特征。研究藥物發現相關的新穎基因，自然也要把目標鎖定在環境基因組中編碼新穎次級代謝產物的基因上。與其他基因工程技術不同，土壤環境基因組技術所需要的DNA片段不是來自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是來自完全未知的土壤樣品中，對其可能具有的潛在功能也并不知曉。在土壤總DNA中，編碼次級代謝產物的基因經常是成簇存在的，與同一個次級代謝產物相關的基因的生物合成區域和調節區域經常是緊密相連的。這些相連的基因使得克隆到載體中整個次級代謝產物途徑基因是一個連續的片段。在藥物發現中，生物合成基因和抗性基因也是連在一個片段上的，對于有毒的代謝產物，宿主可以通過共表達的抗性基因帶來的抗性機制來避免毒性。這一特點不但簡化了對外源片段進行剪切和修飾程序，而且使重組子的篩選更加方便，無疑為功能基因的克隆和表達提供了便利。因此，從土壤中提取和純化微生物的總DNA是關鍵性的第一步，因為DNA的純度和片段的大小直接決定了后續基因操作能否順利進行。用限制性內切酶部分降解從土壤中純化后的環境基因組DNA。典型大小片斷的選擇是通過脈沖場凝膠電泳完成，待酶切的DNA片段大小需要比插入片段至少長3倍，S卩如果需要較大的插入片段(> IOOkb)，就需要幾百kb的DNA，但如此長的DNA極易斷裂，所以需要使用新的方法獲得能滿足研究所需要的土壤大片段DNA。從土壤中分離提取DNA需要體現完整的基因多樣性，其方法主要有兩種:(I)對土壤樣品中的原位細胞進行裂解后直接提取核酸物質，然后對DNA進行純化；(2)從土壤樣品中分離細菌細胞，再對細胞進行裂解和純化。在多數研究中，前一種方法都不能產生長度>20kb的DNA片段，如果用于構建插入片段較長的環境基因組文庫，這種方法顯然不足以勝任。但使用第二種方法往往由于土壤性質和結構、含水量、pH、氣候變化以及生物活性等各種因素的影響，增加了微生物生存環境的復雜性。微生物分布于土壤顆粒小團聚體內或者大顆粒內部小團聚體中，并通過靜電引力、范德華力、氫鍵等微生物細胞與土壤顆粒之間的相互作用牢固的結合在土壤顆粒上，使得難以獲得完整的土壤微生物細胞。本發明就是針對如何使用間接法從土壤中分離微生物細胞并獲得能滿足于各種分子生物學研究所需要的高純度的大片段土壤DNA這樣的需要進行的。

發明內容
目前對土壤總DNA的提取方法有很多報道，主要可分為直接法(細胞原位裂解)和間接法(細胞回收)兩類。直接法是直接對樣品進行裂解后獲得DNA并進行純化；而間接法是先將微生物與土壤顆粒分離，隨后提取回收細胞中的DNA。在DNA得率、純度、代表性等方面，兩種方法各有優勢。直接法獲得的DNA產量比較高，并且偏嗜程度低，可以用于檢測環境中較為稀有的微生物。但這種方法對DNA造成剪切使片段變小，而且包含的雜質含量很高，如果再通過純 化的步驟是完全可以滿足分子生態研究的一些需要的，但是根本不可能用于構建土壤宏基因組文庫。間接提取法，即從土壤中回收細胞的方法最早是Faegrietal提出的，基于①充分分散土壤顆粒；②利用菌體細胞和土壤顆粒的浮力密度、沉降速率不同，離心分離；③細胞裂解DNA純化等幾個原則和步驟。間接法可以成功的回收48kb以上的大片段DNA且純度很高，但在構建土壤宏基因組文庫等一些科學實驗中，我們提取的大片段DNA往往必須同時滿足以下幾個要求:①片段要在300kb以上，因為相同的克隆數中片段大所構建的文庫包含的信息內容才大，才能夠多的涵蓋土壤中遺傳信息的內容純度高，尤其是不含或者少含抑制后繼實驗中酶活力的物質(土壤中的這類物質很多)回收的DNA中盡可能的包含土壤中所有微生物的遺傳信息。目前，間接法也有很多種，比如CsCl-EB密度梯度離心法，Nycodenz、Percoll、Metrizamide等常見的密度梯度離心介質法等?，F在的問題是:各種間接法都存在耗時長，產量比較低，操作很難掌握弊端，基本不能同時滿足以上構建土壤宏基因組文庫所必須的三個條件。針對這個現狀，本研究根據實際操作經驗總結出一套詳細的從土壤中獲得能滿足構建宏基因組文庫大片段DNA的方法，同時指出每個關鍵步驟操作中的注意事項和原理供大家根據自己的實際需要參考。本發明提供了一種詳細的間接法獲得土壤大片段DNA的操作方法。本發明提供了每個關鍵步驟的注意事項和原理，可以根據土壤種類以及微生物數量適當調整分離方法和分離步驟。本發明提供了可根據實際需要更改操作步驟的原理和方法。具體地，提供了根據土壤特性適當調整分離土壤微生物的方法，可以獲得土壤中大多數微生物，并濃縮到一定的濃度，可用于低熔點瓊脂糖包埋等方法原位裂解，經過脈沖電泳回收得到大片段DNA。本發明首先將土壤樣品過篩并溶解降低微生物與土壤顆粒之間的附著力后，通過差速離心或者密度剃度離心獲得土壤中的微生物個體，然后再調整成適當濃度的微生物溶液用低熔點瓊脂糖包埋并用溶菌酶和蛋白酶K等將細菌等微生物裂解并降解組蛋白等，使細菌等微生物的基因組DNA裸露出來，最后通過脈沖等電泳方式使各種大小的大片段DNA遷移出來，根據需要回收適合自己下一步工作的大片段DNA分子。本發明提供了每個關鍵環節的詳細步驟和原理，并提出了可以調整方案的建議和方法。首先指出了微生物和土壤顆粒的分離是成功分離土壤大片段的第一個關鍵環節，并提供了可行的幾種方法和步驟。其次指出了差速離心或剃度離心過程中的注意事項，指明了離心速度和土壤溶液濃度之間的關系影響到土壤微生物的回收效率。低熔點瓊脂糖包埋和原位裂解也是關鍵環節，指出了包埋的濃度和原位裂解的注意事項和可行的方法。本發明提供了脈沖電泳或者普通電泳獲得適當大小DNA片段的方法。脈沖電泳可以獲得超大DNA片段，并可以適當酶切后獲得具有特定酶切端口的適合連接到載體的大片段DNA。普通電泳步驟相對簡單，但獲得的片段較小，也可以滿足一些后繼的工作需要。具體地，本發明提供的獲得土壤大片段DNA的方法如下:1.本發明闡述了從土壤中分離細菌等微生物的方法步驟:根據實際的操作并結合已經公開的方法總結出了切實可行的一套高效分離土壤微生物的方法。能得到土壤中大多數微生物菌體，去除大多數會影響后繼工作的土壤腐殖質、腐殖酸、重金屬離子等。2.低熔點瓊脂糖包埋、原位裂解:調整獲得的土壤微生物濃度，用低熔點瓊脂糖包埋并制成一定大小的膠條后用溶菌酶和蛋白酶K等將細菌等微生物裂解并降解組蛋白等，使細菌等微生物的基因組DNA裸露出來并不受外力剪切而斷裂。

3.電泳回收大片段DNA:將包含有大片段DNA的低熔點瓊脂糖的膠條通過脈沖場電泳或者普通場電泳遷移出來，并根據需要回收適當大小的DNA片段。依據本發明提供的原理和通過實施本發明的具體方法并結合需要調整操作步驟，可以達到以下預期效果:1.提供了一種從各類土壤中間接法獲得土壤中微生物大片段DNA的方法，獲得的DNA可以用于構建宏基因組文庫和分離各種基因的后繼分子生物學等的科學研究工作。2.本發明提供的獲得土壤大片段DNA的方法與常規方法相比具有詳細、可操作性強、操作步驟依據需要可調等特點。


圖1:脈沖電泳分離土壤微生物大片段DNA的效果圖:A為脈沖電泳分子量對照，B為包埋低熔點瓊脂糖膠塊，箭頭所指為對應的分子量大小。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。實施例一:土壤微生物的獲得1.采集新鮮的土壤樣品過80目銅篩。
2.稱取100克過篩的土樣并加入250毫升冰預冷的蒸餾水，在冰浴下用旋渦攪拌器攪拌3次，每次30秒，間隔停頓30秒。3.700-1000轉/分鐘，4攝氏度離心5分鐘，收集上清夜。4.沉淀在經兩次重懸并離心，合并所有上清夜。5.10000轉/分鐘，4攝氏度離心5分鐘，棄上清夜，沉淀用10毫升磷酸緩沖液重懸。6.將10毫升Nycodenz (1.3克/毫升)溶液小心加入土壤懸液底部，10000轉/分鐘，4攝氏度離心30分鐘。7.小心收集Nycodenz- 土壤懸液之間的白色細胞層，加入4倍以上體積的磷酸緩沖液10000轉/分鐘，4攝氏度離心20分鐘去除含有Nycodenz的上清夜。注意事項:1.必須采集新鮮的土壤樣品用于分離土壤微生物。未經與空氣充分接觸而喪失部分水分和在分離微生物前未破壞土壤微環境的土壤比較適合作為樣品。主要原因是微生物與土壤之間的附著力是決定回收效率的關鍵因素，完全或者部分風干的土壤中微生物與土壤顆粒的附著力大大增加，往 往導致在回收微生物的過程中，微生物與土壤顆粒一起因為離心而沉淀下去。其次，土壤在被擾動后土壤中的微生物失去微環境的屏蔽保護作用，進而原生動物大量吞食細菌等微生物導致在微生物在回收之前大量損失。2.依據土壤種類的不同，只要是可以降低微生物與土壤顆粒之間黏著力或者提高土壤微生物回收效率，蒸餾水可以被磷酸緩沖液、Tris緩沖液、TENP緩沖液、生理鹽水、或者0.1% SDS溶液等代替。不同的土壤其粘性、pH值、有機質的含量、腐殖質的含量等有很大的差異，微生物與土壤之間的黏著力是由土壤的性質和微生物表面分泌的物質決定的。各種緩沖液代替蒸餾水是為了保證微生物不會因為在分離過程中環境的土壤改變而導致細胞破裂死亡，或者直接利用離子之間的作用弱化微生物與土壤顆粒之間的黏附力。3.離心轉速的選擇可以根據土壤顆粒大小調整。粘性較大的土壤顆粒較小，可以選擇較低的轉速，因為轉速高了導致大量土壤顆粒沉積而達不到分離微生物的目的。4.Nycodenz溶液的使用。在添加Nycodenz溶液的時候一定不能擾動Nycodenz溶液和土壤溶液之間的分界線，具體操作的時候可以使用移液管等吸取適量的Nycodenz溶液，然后將移液管小心插入土壤溶液的底部后緩慢將Nycodenz溶液釋放出來。離心結束不要使用阻力，讓轉頭自己停下來。小心吸去上層溶液后再回收白色細胞層。Nycodenz價格昂貴，如果土壤顆粒較大或者腐殖質等物質較少，也可以只用差速離心的方式直接分離，省去Nycodenz的過程。實施例二:微生物細胞的低熔點瓊脂糖包埋1.配置I %的低熔點瓊脂糖溶液，所用溶液種類與重懸分離獲得的微生物種類容易一致，加熱溶解后保存在45攝氏度水浴中備用。2.用血清計數板等方法將獲得的土壤微生物菌液調整濃度，達到2*108個菌體/毫升，將上述I %的低熔點瓊脂糖溶液與調整好濃度的菌液等體積混合，并快速灌裝入2毫米*1.5毫米*5毫米的膠條模塊中，將模塊置于4攝氏度冷卻后取出保存與含有I微摩爾濃度的EDTA溶液中備用。注意事項:
1.將菌液調整到適合的濃度。濃度太高不利于微生物的原位裂解，濃度太低不能回收到大量的DNA。調整的方法可以使用血清計數板或者細胞流量計等工具。2.膠條的制作。厚度和寬度比較重要，長度可以根據操作的方便調整。太厚或者太寬不利于被固定的微生物細胞與溶菌酶的充分接觸。實施例三:微生物的原位裂解1.取出在I微摩爾濃度的EDTA溶液中備用的膠條，放置于4攝氏度預冷的蒸餾水中浸泡，同時緩慢的晃動，當中更換蒸餾水3次，最后一次用裂解液浸泡。2.取出膠條后用含有I毫克每毫升溶菌酶的裂解液于37攝氏度反應I小時，同時緩慢的晃動，裂解液的體積至少是膠塊的10倍。期間可以補加溶菌酶或者更換含有溶菌酶的裂解液。3.被裂解的膠條取出后用4攝氏度預冷的蒸餾水輕輕沖洗幾次后再用蛋白酶溶液浸泡一段時間。然后用至少4倍于膠塊體積含有I毫克每毫升蛋白酶的蛋白酶溶液于55攝氏度降解蛋白質16小時以上，同時緩慢的晃動。期間可以補加蛋白酶或者更換含有蛋白酶的蛋白酶溶液。4.反應完后取出膠條儲存于4攝氏度pH8.0的50毫摩爾EDTA溶液中備用。注意事項:1.每一步驟中緩慢的晃動是為了提高酶與大分子之間的接觸機會，加速反應的過程，但是一般不會超過40轉每分鐘。轉速的高低和反應液的體積成正比，只要不會使轉動的膠塊因碰撞或者摩擦破裂就可以。

2.溶菌酶的裂解液配方:IOmM Tris (pH 8.0), 50mMNaCl, 0.1 % Sarkosyl ,0.2%sodium deoxycholate。蛋白酶溶液配方:1% Sarkosyl,0.5M EDTA。3.溶菌酶的裂解液和蛋白酶溶液的配制可以依據所使用溶菌酶和蛋白酶種類特點調整，只要是能更好的發揮所使用酶的裂解微生物細胞和降解蛋白質的功能就可以。實施例四:大片段DNA的電泳回收1.以常規的方法制膠，用0.5 X TBE制備一塊I %的瓊脂糖凝膠。2.以一干凈的解剖刀，切下膠孔之間的瓊脂糖凝膠，從而得到一個大的上樣孔，必
須平整。3.向加樣孔中加入少量熔化的瓊脂糖凝膠以完全密封加樣孔的底部，讓膠凝固。4.將已經消化的膠條塊從反應管中轉移到加樣孔中，壓緊膠條。5.在大加樣孔旁邊的泳道中加入PFGE λ ladder。6.以熔化的膠封住所有加樣后的孔，使之凝固。7.將膠從灌制架上取下，除盡底板上的膠。8.將膠放入脈沖電泳槽中，電泳槽內裝入已經冷卻到12°C的新鮮0.5XTBE09.以下列參數跑膠:6v/cm, included anglel20, initial switch time I 秒，final switch time 40 秒，ramping 線性，18_20hr,通常是跑膠過夜。10.將膠塊的兩邊切下。11.對兩塊邊膠進行EB染色30min，放于紫外燈箱中打開電源觀察。12.在兩個邊條的計劃回收大小片段前后處各作一小切口標記。13.關閉電源，在工作臺上放一干凈的塑料墊片，將未染色的中心條帶放在兩個邊膠條之間以便重新拼膠，切下含有需要大小片段的膠塊。注意事項:1.注意不要將中心膠條暴露于紫外燈下以免損傷DNA。2.可以根據需要將各種大小不同的DNA片段都回收，不一定只是含有100_350kb的膠塊。3.在電泳回收前也可以用適量濃度的限制性內切酶切出特定的切口，然后電泳回收后直接連接 到載體構建宏基因組文庫。
權利要求
1.一種用于從土壤中分離大片段DNA的方法。首先分離獲得土壤微生物細胞，然后利用低熔點瓊脂糖包埋固定，裂解微生物細胞后脈沖電泳分離各種大小的DNA片段，最后回收所需要大小的DNA片段。
2.一種根據權利要求1的用于分離純化土壤微生物細胞的方法，其特征在于弱化微生物細胞與土壤顆粒之間的粘連，提高回收土壤微生物細胞的效率，其中各種溶液試劑的選擇在于依據土壤特性的不同而隨之調整。
3.一種根據權利要求1的用于固定、裂解土壤微生物細胞，降解細胞中蛋白質使微生物核酸裸露出來便于電泳分離的方法，其特征在于去除能抑制溶菌酶和蛋白酶作用的各種抑制物，提高DNA回收效率的方法運用。
4.一種根據權利要求1的用于回收大分子DNA的方法,其特征在于一次電泳可以同時大量回收分子量不同的各種DNA分子。
全文摘要
本發明涉及土壤微生物、生物化學及分子生物學領域，特別是從各種土壤中間接分離純化土壤微生物30kb以上大片段DNA用于構建宏基因組文庫，或者分離土壤微生物基因蔟等。本發明針對目前利用間接法從土壤中分離微生物細胞并獲得滿足于各種分子生物學研究等所需要高純度的大片段土壤DNA非常困難這樣的需要進行的，并提供了一種滿足獲得高純度、片段大的提取土壤微生物DNA的高效方法。
文檔編號C12N15/10GK103103180SQ201110355658
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者張偉 申請人:新疆師范大學