專利名稱：一種蛇足石杉內生真菌及其產石杉堿甲的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及蛇足石杉內生真菌及其產石杉堿甲的應用。
背景技術：
老年癡呆癥是一種嚴重的、退行性腦疾患，由于其發病率高，至殘率高，給社會和家庭造成了嚴重的危害和巨大的負擔；治療老年癡呆癥是擺在當前社會的一大難題。石杉堿甲于1994年上市、是我國擁有自主知識產權的一種高效、安全的治療老年癡呆癥的藥物，與國外開發的同類藥物相比，具有不良反應少，價格低、服用量小等優點，具有廣闊的應用前景。目前，石杉堿甲主要來源于野生植物蛇足石杉全草，而蛇足石杉生長緩慢，生物量小，分布范圍較窄，石杉堿甲含量極低，在植物中僅含萬分之幾。由于植物原料來源的限制，每年只有30公斤的產量，使石杉堿甲自問世以來，其資源危機便形影不離。中國是石杉堿甲原料唯一出口國，資源已成為制約石杉堿甲臨床應用的瓶頸。由于石杉堿甲的結構特殊，其骨架中的橋環結構難以人工合成，目前所有化學合成方法均步驟復雜、合成條件苛刻、試劑昂貴、產率很低、很難實現工業化，而具有光學活性的石杉堿甲合成更為復雜；植物組織培養因無法消除其內在的微生物污染，同時由于該植物生長條件十分苛刻，所以至今都未能走出實驗室。植物內生真菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，它們寄生于健康植物組織內而不產生外在感染癥狀，并與宿主植物協同進化。內生真菌產生的代謝產物有很多是應用前景廣闊的新型生物活性產物。自從1993年Strobel等發現從短葉紅豆杉中分離出的內生真菌能夠合成抗癌成分紫杉醇以來，人們希望通過采用內生真菌發酵合成藥用成分。真菌具有易于培養，生長快的特點以及由于現代發酵工業和微生物育種技術的成熟，采用微生物工業化發酵生產石杉堿甲具有最大的可能性。目前已有報道，從蛇足石杉植物中分離到產石杉堿甲及其類似物的內生真菌，如專利CN 101195804A(黎萬奎，專利申請號:200610119149.7，內生枝頂孢霉)、CN101240304A(吳東才，專利申請號:200710003519.5，枝孢霉菌)、CN 101265451A(張晶等，專利申請號:200710086540.6，木霉菌)、CN 101942393A(朱篤等，專利申請號:200910186852.3，竹黃菌)等；以及龔玉霞(《蛇足石杉內生真菌的分離及生物活性初步研究》，安徽師范大學，碩士論文，2007，莖點霉)等。以上所有研究都表明，可以利用蛇足石杉內生真菌發酵生產石杉堿甲，但目前所分離到的產石杉堿甲菌株，都因產量太低，只有ng級，遠遠達不到mg級，而且存在菌種退化等問題，以至于無法實現大規模生產石杉堿甲，使得石杉堿甲的短缺問題仍然無法解決。本發明首次發現炭疽菌(Colletotrichum sp.)可以產石杉堿甲，希望通過進一步的研究如微生物育種學和發酵過程優化等手段，能夠得到產量高、穩定性好等要求的高產菌株，以達到工業化生產，進而通過工業化發酵生產技術來解決石杉堿甲藥源緊缺的問題，為石杉堿甲的臨床應用及研究提供有力的保證
發明內容
本發明的目的是提供一種供發酵生產石杉堿甲藥物的蛇足石杉內生真菌。為實現上述目的，本發明的技術方案為提供一株蛇足石杉內生真菌，命名為炭疽菌(Colletotrichum sp.) SY-1,其保藏單位、保藏號和保藏日期為:中國普通微生物菌種保藏管理中心:CGMCC5289,2011年9月23日；中國典型培養物保藏中心:CCTCC M 2011293，2011年08月19日。上述蛇足石杉內生真菌其基因組ITS特征堿基序列為SEQ ID NO:1。上述蛇足石杉內生真菌它的固體培養菌落特征為PDA培養基28°C培養，7天菌落直徑700X730mm，菌落正面呈同心圓狀，中央淡灰色，外層灰黑色，邊緣白色，絨毛狀，背面中央灰白色，外層灰黑色，邊緣灰白相間，呈放射狀，10天布滿整個平板，菌落呈一致的深灰色，背面灰黑色。上述蛇足石杉內生真菌它的顯微形態為:菌絲有隔，分支，分生孢子無色，單孢，圓筒形，兩端鈍圓，有1-2個油球，附著孢褐色，倒梨形。

上述蛇足石杉內生真菌菌株的培養及石杉堿甲提取分離方法:a、在無菌條件下，取少量菌絲，接入已滅菌的PDA固體培養基試管，于26°C 30 V活化培養72小時； b、取步驟a活化培養好的菌種，在無菌條件下，轉接入已滅菌的PDA固體培養基平板上，在26°C 30°C下培養10天；C、取培養好的如權利要求1所述的蛇足石杉內生真菌的菌絲體及其培養基切碎，放入具塞三角瓶中，加2%酒石酸浸泡24小時，超聲波處理I小時，過濾，濾液用2 4倍量的氯仿萃取2 5次,取酸水液用氨水調pH值到9 11，用3倍量的氯仿萃取2 5次，濃縮至干，用甲醇溶解，吹干，用磷酸鹽緩沖液水溶液溶解，加入C18固相萃取小柱分離，得石杉堿甲粗提物。本發明的有益效果為本發明所述的一株產石杉堿甲的蛇足石杉內生真菌-是從石杉科植物蛇足石杉活體中分離純化到的絲狀真菌，經過固體發酵，經HPLC、LC/MS檢測實驗證明該菌能夠產生與寄主植物相同的化合物石杉堿甲，是尋找石杉堿甲新藥源的一種重要的微生物，有較大的應用價值。該蛇足石杉內生真菌可在普通條件下培養，可以利用該微生物的特點以及現代發酵技術，達到工業化生產石杉堿甲，以解決石杉堿甲開發的瓶頸問題，同時可以挽救瀕臨滅絕的石杉堿甲自然資源。


圖1:為本發明的蛇足石杉內生真菌在40X10倍顯微鏡下觀察到的菌絲和孢子形態菌株顯微形態特征圖；圖2:為本發明所述的蛇足石杉內生真菌的菌落形態；圖3:本發明的蛇足石杉內生真菌生物堿成分色譜圖；圖4:石杉堿甲標準品色譜圖；圖5:為本發明所述的蛇足石杉內生真菌生物堿目標組分質譜圖，其分子離子峰分別為 m/z244.2/243.2/226.2 ；圖6:與石杉堿甲標準品質譜掃描圖，其分子離子峰分別為m/z244.2/243.2/226.2。
具體實施例方式為詳細說明本發明的技術內容、構造特征、所實現目的及效果，以下結合實施方式并配合附圖詳予說明。 本發明所述的蛇足石杉內生真菌是從蕨類植物蛇足石杉(huperziaserrata)植物活體中采用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經分類學鑒定為炭疽菌(Colletotrichum sp.)。該菌株命名為炭疽菌(Colletotrichum sp) SY-1,其保藏單位、保藏號和保藏日期為:中國普通微生物菌種保藏管理中心:CGMCC5289，2011年9月23日；中國典型培養物保藏中心:CCTCC M 2011293,2011年08月19日。實施例1a、請參閱圖1，為本發明菌株顯微形態特征圖，取本發明的產石杉堿甲的蛇足石杉內生真菌菌株，在無菌條件下，用竹簽挑取少量菌絲，接入已滅菌的PDA固體培養基試管，于28 °C活化培養72小時；b、取步驟a活化培養好的菌種，在無菌條件下，轉接入已滅菌的PDA固體培養基平板上，在28°C下培養10天；C、取培養好的菌絲體及其培養基切碎，放入具塞三角瓶中，加2%酒石酸浸泡24h，超聲一小時，過濾，取濾液用2-4倍量的氯仿萃取2-5次,取酸水液用氨水調pH值到9-11，用3倍量的氯仿萃取2-5次，濃縮至干，用甲醇溶解，吹干，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，加入C18固相小柱進行分離，得石杉堿甲粗提物，加甲醇溶解。PDA培養基制備:取馬鈴薯200g (去皮)切成小塊，放入IOOOml水中煮沸30min，過濾棄去馬鈴薯，濾液加水補至I升，加入葡萄糖20g瓊脂12g，pH值自然，高壓滅菌待用。HPLC 和 LC/MS 分析1、HPLC (高效液相色譜)條件:色譜柱:BDSHypersil C18 (4.6 X 250mm, 5um),流動相:甲醇:0.1% 甲酸水溶液(14: 86)，流速:lml/min，檢測波長:310nm ;柱溫:30°C，進樣量:20ul。2、LC/MS (液質聯用色譜)條件:色譜條件:色譜柱=XTerraMS C18 (2.1 X 50mm 5um)流動相:甲醇:0.1%甲酸，梯度洗脫:[time (min): D (methanal) ] =
-[5.00: 40.0]-[10.00: 100.0]-[15.0: 100.0]-[15.00: 10.0];流速:0.3ml/min ;柱溫:30°C ;進樣量:20ul ;質譜條件:離子源:ESI ;檢測方式:正離子檢測；采集方式:MS Scan ;檢測對象:石杉堿甲，m/z 243.2/244.2/226.2 ;毛細管電壓:2.71KV，錐孔電壓:42V，離子源溫度:120°C，脫溶劑溫度:200°C，脫溶劑氣流量:900L/hr。3、經過以上HPLC、LC/MS檢測，本發明中的蛇足石杉內生真菌通過發酵可以產石杉堿甲化合物，請參閱圖3、圖4、圖5、圖6。本發明所述的蛇足石杉內生真菌生物堿成分色譜圖如圖3所示，圖中所示的30.602min,是目標峰出峰時間與石杉堿甲標準品色譜圖如圖4,圖中所示的30.7min,是目標峰出峰時間， 兩者有一致的出峰時間。圖5為本發明所述的蛇足石杉內生真菌生物堿目標組分質譜圖，其分子離子峰分別為m/z244.2/243.2/226.2與石杉堿甲標準品質譜掃描圖如圖6，其分子離子峰分別為m/z244.2/243.2/226.2，可以認定兩者是同一組分為石杉堿甲。本發明所述的產石杉堿甲的蛇足石杉內生真菌-炭疽菌(Colletotrichum sp.)SY-1是從石杉科植物蛇足石杉活體中分離純化到的絲狀真菌，經過固體發酵，經HPLC、LC/MS檢測實驗證明該菌能夠產生與寄主植物相同的化合物石杉堿甲，是尋找石杉堿甲新藥源的一種重要的微生物，有較大的應用價值。以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在 本發明的專利保護范圍內。
權利要求
1.一種蛇足石杉內生真菌，命名為炭疽菌(Colletotrichum sp.) SY-1,其保藏單位和保藏號為:中國典型培養物保藏中心，CCTCC M2011293。
2.如權利要求1所述的蛇足石杉內生真菌，其特征在于，它的基因組ITS特征堿基序列為:ACCCTTTGTGACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTGACCCTCCCGGCCTCCCGCCCCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACGGCTGACGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGAAAAo
3.如權利要求1所述的蛇足石杉內生真菌，其特征在于，它的固體培養菌落特征為PDA培養基28°C培養，7天菌落直徑700X 730mm，菌落正面呈同心圓狀，中央淡灰色，外層灰黑色，邊緣白色，絨毛狀，背面中央灰白色，外層灰黑色，邊緣灰白相間，呈放射狀，10天布滿整個平板，菌落呈一致的深灰色，背面灰黑色。
4.如權利要求1所述的蛇足石杉內生真菌，其特征在于，它的顯微形態為:菌絲有隔，分支，分生孢子無色，單孢，圓筒形，兩端鈍圓，有1-2個油球，附著孢褐色，倒梨形。
5.如權利要求1所述的`蛇足石杉內生真菌提取石杉堿甲的方法:取培養好的菌絲體及其培養基切碎，放入具塞三角瓶中，加2%酒石酸浸泡24h，超聲一小時，過濾，取濾液用2-4倍量的氯仿萃取2-5次，取酸水液用氨水調pH值到9-11，用3倍量的氯仿萃取2-5次，濃縮至干，用甲醇溶解，吹干，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，加入C18固相小柱進行分離，得石杉堿甲粗提物。
6.如權利要求1所述的蛇足石杉內生真菌產石杉堿甲，制備石杉堿甲的應用。
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及蛇足石杉內生真菌及其產石杉堿甲的應用。本發明提供一種蛇足石杉內生真菌，其分類命名為炭疽菌(Colletotrichum sp.)SY-1，其保藏單位、保藏號和保藏日期為中國典型培養物保藏中心CCTCC M 2011293，2011年08月19日。該蛇足石杉內生真菌通過發酵，可以產生石杉堿甲化合物，利用該微生物產石杉堿甲的特點以及現代發酵育種技術，達到工業化生產石杉堿甲，以解決石杉堿甲開發的瓶頸問題，同時可以挽救瀕臨滅絕的石杉堿甲自然資源。
文檔編號C12P17/12GK103103134SQ20111035588
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月10日 優先權日2011年11月10日
發明者吳水生, 王明茲, 劉海元 申請人:吳水生