專利名稱：α-氨基酸酯水解酶突變體的制作方法
技術領域：
本發明與多肽有關，尤其與來源于大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-aeh的a_氨基酸酯水解酶突變體有關。
背景技術：
α-氨基酸酯水解酶(EC 3. 1. 1.43)相比青霉素酰化酶而言，具有諸多優點不受苯甘氨酸的抑制；對D型苯甘氨酸甲酯有構象選擇性，工業上可以直接使用消旋混合物，而不必先進行拆分；其最適反應PH比青霉素酰化酶低，也使反應體系中的底物和產物更穩定。長期以來，a-氨基酸酯水解酶的研究受到生物學家和藥學家的重視，有關a_氨基酸酯水解酶產酶菌株的分離、酶基因的鑒定及其在生物轉化中的應用也有一些報道。雖然a-氨基酸酯水解酶具有一系列優點，但酶的某些性質還需進一步優化以適應工業化的需要。對于一種具有經濟吸引力的酶法制備內酰胺抗生素工藝來說，理想的是合成/水解比率(S/H比率)要高。優選地，S/H比率高，且同時酶活性也足夠高。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于β-內酰胺抗生素的合成，生產效率高，不對β-內酰胺環有明顯水解作用，合成/水解比率高，酶活性也適于合成生產過程的α -氨基酸酯水解酶突變體。本發明是這樣實現的
本發明1、α -氨基酸酯水解酶突變體，其特征在于大腸桿菌的a-氨基酸酯水解酶脫氧核糖核酸的堿基序列見序列表中序列1，所編碼的多肽的氨基酸序列見序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸為丙氨酸，所述大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28-aehY175A 的分類命名大腸埃希氏菌，拉丁文名federidia cWi，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCC No. 4758。保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。應用于β—內酰胺抗生素的合成，合成水解比率為1. 9。其制備方法如下
(1)從大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28a-aeh中提取

圖1所示重組質粒pEI^8a_aeh，大腸桿菌BL21(DE3)/pET28_aeh的分類命名大腸埃希氏菌，拉丁文名Escherichia coli，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCC No. 4757，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-aeh的制備方法如下
a將黃單孢菌基因組用PCR方法擴增目的基因aeh，所用載體為pGEM_T，aeh的酶切位點為EcoRI和XholJf EcoRI-aeh-XhoI片段與載體pGEM_T連接，轉化入宿主菌JM109，選擇白色菌落，得重組質粒pGEM-T-aeh，
b將重組質粒pGEM-T-aeh和載體pET28a雙酶切，對線性化后的pET28a載體進行去磷酸化，用連接酶將aeh和載體pET28a連接，轉化入宿主菌JM109，得重組質粒pEI^8a-aeh，c從宿主菌JM109中提取重組質粒pET28a-aeh轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞， d培養轉化細胞，使重組質粒pET28a-aeh隨大腸桿菌BL21 (DE3)細胞一起大量擴增， e從擴增的細胞中篩選出含有重組質粒的pET28a-aeh細胞，即得大腸桿菌BL21 (DE3) / pET28_aeh。(2)設計1種定點突變引物，其核苷酸序列如下 正向引物GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG
反向引物CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC
向PCR薄壁反應管中添加如下組分
權利要求
1.α-氨基酸酯水解酶突變體，其特征在于大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的 α-氨基酸酯水解酶脫氧核糖核酸的堿基序列見序列表中序列1，所編碼的多肽的氨基酸序列見序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸為丙氨酸，所述大腸桿菌 BL21(DE3)/pET28-aeh Y175A的拉丁文名co/i，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCC No. 4758。
2.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于應用于β-內酰胺抗生素的合成。
3.根據權利要求1所述的突變體，其特征在于其制備方法如下(1)從大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-aeh中提取圖1所示重組質粒pET28a-aeh，大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-aeh的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCC No. 4757，大腸桿菌BL21 (DE3) /pET28-aeh的制備方法如下a將黃單孢菌基因組用PCR方法擴增目的基因aeh，所用載體為pGEM_T，aeh的酶切位點為EcoRI和XholJf EcoRI-aeh-XhoI片段與載體pGEM_T連接，轉化入宿主菌JM109，選擇白色菌落，得重組質粒pGEM-T-aeh，b將重組質粒pGEM-T-aeh和載體pET28a雙酶切，對線性化后的pET28a載體進行去磷酸化，用連接酶將aeh和載體pET28a連接，轉化入宿主菌JM109，得重組質粒pEI^8a-aeh， c從宿主菌JM109中提取重組質粒pET28a-aeh轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞， d培養轉化細胞，使重組質粒pET28a-aeh隨大腸桿菌BL21 (DE3)細胞一起大量擴增， e從擴增的細胞中篩選出含有重組質粒的pET28a-aeh細胞，即得大腸桿菌BL21 (DE3) / pET28-aeh,(2)設計1種定點突變引物，其核苷酸序列如下 正向 5' GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG3' 反向 5’ CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC3，，(3)在PCR儀中熱循環擴增質粒DNA， 熱循環儀中發生以下步驟.1.94°C2 分鐘.2.940C30 秒.3.58 0C30 秒.4.68 0C7. 4 分鐘.5.2-4 步X 15 次 72 0C 10 分鐘，(4)用限制性內切酶切割PCR儀產物，除去野生型質粒，過程如下向50ulPCR產物中加入2ul 10U/ul的DpnI，混勻，37°C孵育Ih去除野生型質粒，(5)用(4)得到的反應混合物轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)，(6)將(5)的培養物制備無細胞裂解液，(7)將無細胞裂解液用親和柱純化，即得突變體。
全文摘要
本發明為α-氨基酸酯水解酶突變體，解決已有α-氨基酸酯水解酶在合成抗生素中合成/水解比率不高的問題。大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的a-氨基酸酯水解酶脫氧核糖核酸的堿基序列見序列表中序列1，所編碼的多肽的氨基酸序列見序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸為丙氨酸，所述大腸桿菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的拉丁文名Escherichiacoli，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏編號CGMCCNo.4758。
文檔編號C12N15/70GK102533695SQ20111035590
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者葉麗娟, 李端華, 李進軍, 王輅, 趙晨 申請人:中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所