專利名稱：鴨疫里默氏桿菌特異性pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家禽常見疾病領(lǐng)域檢測(cè)方法，尤其是鴨疫里默氏桿菌特異性PCR 檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)是鴨傳染性漿膜炎的病原菌， 該病是危害水禽養(yǎng)殖業(yè)，特別是養(yǎng)鴨業(yè)重要的疫病之一。家禽中以鴨最易感染，其中櫻桃谷鴨、番鴨、麻鴨、麗佳鴨等多品種的鴨均可發(fā)病。本病呈急性或慢性敗血癥過(guò)程，以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎以及部分干酪樣輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎為特征。發(fā)病率為 10% -90%，病死率高達(dá)80%，一年四季均可發(fā)生。世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎都有該病流行，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)鑒定RA通常檢測(cè)其培養(yǎng)特性、形態(tài)染色、生理生化特征、菌體的某些化學(xué)組成等表型指標(biāo)，但用表型指標(biāo)鑒定鴨疫里默氏桿菌存在不足。另外，傳統(tǒng)的鑒定方法操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于及時(shí)診斷病因、查病原和控制病情的蔓延。針對(duì)鴨疫里默氏桿菌這些特點(diǎn)，許多研究學(xué)者建立了一些檢測(cè)技術(shù)，如熒光抗體技術(shù)、ELLSA、免疫組化等相繼報(bào)道，但在實(shí)踐中都有不同程度的局限性。為了能快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)鑒定方法在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷的取得新進(jìn)展，是取代傳統(tǒng)檢測(cè)方法最具潛力的檢測(cè)方法之一，其中， PCR以其敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)成為分子生物學(xué)水平的重要檢測(cè)技術(shù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)方法。采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，更加具有實(shí)用性，檢測(cè)結(jié)果特異，結(jié)果判斷簡(jiǎn)單。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟步驟一，根據(jù)鴨疫里默氏桿菌的基因組DNA序列中g(shù)yrB基因的保守序列SEQ ID NO :1設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；所述引物為正向引物序列如SEQ ID NO :2所示；反向引物如SEQ ID NO :3所示；步驟二，提取樣品DNA，PCR法擴(kuò)增；PCR檢測(cè)體系具體為25μ L反應(yīng)體系具體為，10XPCR 緩沖液 2. 5μ L，25mmol/L 的 Mg 2. 0 μ L，2. 5mmol/L 的 dNTP L 0 μ L, Taq 酶 0. 25-1U，5 μ M引物對(duì)1 μ L，模板2_5 μ L，最后用雙蒸水補(bǔ)至25 μ L ；PCR檢測(cè)反應(yīng)程序 先95°C預(yù)變性5min，之后開始擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s ；30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結(jié)束；步驟三，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有鴨疫里默氏桿菌；所述判斷具體為如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的單一擴(kuò)增條帶，則說(shuō)明樣品中含有鴨疫里默氏桿菌；如果沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的單一擴(kuò)增條帶，則樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌。
所述的鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)方法，步驟三中，所述判斷的具體方法為檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在194bp位置是否存在單一擴(kuò)增條帶，如果存在，則說(shuō)明樣品中含有鴨疫里默氏桿菌；如果沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的單一條帶，則樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確，快速。避免了采用傳統(tǒng)鑒定方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率底、假陽(yáng)性較多等缺點(diǎn)。同時(shí)不用采用傳統(tǒng)方法中必須使用的抗血清，降低了檢測(cè)成本。本發(fā)明的檢測(cè)靶點(diǎn)具有單一特異性，檢測(cè)結(jié)果特異，結(jié)果判定簡(jiǎn)單。


圖1為實(shí)施例2中PCR檢測(cè)方法特異性評(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖；圖2為實(shí)施例3中PCR檢測(cè)方法靈敏評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1鴨疫里默氏桿菌PCR方法的建立通過(guò)生物信息學(xué)分析，從鴨疫里默氏桿菌基因組DNA序列中找到特異DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組及修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的gyrB基因，將之作為鴨疫里默氏桿菌檢測(cè)靶基因， 基因序列如SEQ ID NO 1所示；將該基因的DNA序列輸入到引物設(shè)計(jì)軟件I^rimer Premier 5. O中設(shè)計(jì)引物，設(shè)置 GC%范圍為40-60 %，產(chǎn)物大小范圍為150-300bp，從備選引物對(duì)中選擇出引物，引物序列如下(引物由上海英駿技術(shù)服務(wù)有限公司合成)GYRB-L :5，-AGAGCGAGAAGAAAAAACCT-3，(SEQ ID NO 2)；GYRB-R :5，-CTCCCATAAGCATAGAGAAGA-3，(SEQ ID NO 3)；步驟二，DNA模板的制備將鴨疫里默氏桿菌各種血清型的菌株分別接種至50ml的胰酶大豆肉湯液體培養(yǎng)基中，在37°C增菌12h后，取Iml菌液放入1. 5ml的離心管中，3000r/min離心lOmin，取上清液，再在12000r/min離心5min，收集菌體。用無(wú)菌雙蒸水重新懸浮菌體，離心洗洗后加入100 μ L無(wú)菌超純水，在沸水浴中煮15分鐘，立即取出，在_20°C放置30min ；37°C解凍后， 12000r/min離心5min，取上清液放置_20°C備用。步驟三PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)體系具體為25yL反應(yīng)體系具體為，10\ 0 緩沖液2.5“1^，2511111101/1 的 Mg 2. Ομ L，2. 5讓ol/L 的 dNTP 1. 0μ L, Taq 酶 0，25-1U，5 μ M 引物對(duì) 1 μ L，模板溶液取 2-5 μ L，最后用雙蒸水補(bǔ)至25 μ L。PCR檢測(cè)體系擴(kuò)增參數(shù)具體為先95°C預(yù)變性5min，之后開始擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結(jié)束。
步驟四判斷標(biāo)準(zhǔn)所述判斷具體為取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，在2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，在紫外燈照射下進(jìn)行觀察，如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的194bp單一擴(kuò)增條帶，則說(shuō)明樣品中含有鴨疫里默氏桿菌；如果沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的194bp單一擴(kuò)增條帶，則樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌。結(jié)果取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，2 %的瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈照射下觀察到約 194bp單一擴(kuò)增條帶，說(shuō)明所建立的PCR能檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌。實(shí)施例2PCR特異性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)分別按照實(shí)施1中DNA模板提取方法和PCR檢測(cè)方法，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、短小芽孢桿菌、鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株(如表1所示，表中所示菌株均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過(guò)公開的渠道獲得的)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。特異性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果見圖1，陰性對(duì)照菌株和菌株編號(hào)請(qǐng)參見

。圖中 泳道 1-10 多殺性巴氏桿菌 Pasteurella. multiocida PM966，沙門氏菌 Salmonella CMCC 50083-4、金黃色葡萄球菌 Maphylococcus aureus ATCC 6538、大腸桿菌 Escherichia 046、鏈球菌 Mi^ptococcosis CMCC32223 株、短小芽孢桿菌 Bacillus subtil CMCC63202 株、鼠傷寒沙門氏Salmonella, typhimurium 50115-13株、都柏林沙門氏菌Salmonella, dulin 50761株、雞白痢沙門氏菌&ilmonella. pullorum50047_2株、鴨疫里默氏桿菌 Riemerella anatipestiferATCC 11845 株；泳道 11 :ddH20 ；泳道M :2000bp 分子量標(biāo)準(zhǔn)。從圖1中可知，除了鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 11845株外，其余細(xì)菌均沒(méi)有194bp特異擴(kuò)增條帶。表1特異性評(píng)價(jià)所用菌株及試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，根據(jù)鴨疫里默氏桿菌的基因組DNA序列中g(shù)yrB基因的保守序列SEQ ID NO=I 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物所述引物為正向引物序列如SEQ ID NO :2所示；反向引物如SEQ ID NO 3 所示；步驟二，提取樣品DNA，PCR法擴(kuò)增；PCR檢測(cè)體系具體為25 μ L反應(yīng)體系具體為， 10XPCR 緩沖液 2. 5 μ L, 25mmol/L 的 Mg 2. 0 μ L, 2. 5mmol/L 的 dNTP 1. 0 μ L，Taq 酶 0. 25-1U，5 μ M引物對(duì)1 μ L，模板2_5 μ L，最后用雙蒸水補(bǔ)至25 μ L ；PCR檢測(cè)反應(yīng)程序 先95°C預(yù)變性5min，之后開始擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s ；30個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72°C延伸lOmin，降溫至12°C，結(jié)束；步驟三，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有鴨疫里默氏桿菌；所述判斷具體為如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的單一擴(kuò)增條帶，則說(shuō)明樣品中含有鴨疫里默氏桿菌；如果沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的單一擴(kuò)增條帶，則樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)方法，其特征是，步驟三中，所述判斷的具體方法為檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在194bp位置是否存在單一擴(kuò)增條帶，如果存在，則說(shuō)明樣品中含有鴨疫里默氏桿菌；如果沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的單一條帶，則樣品中不含有鴨疫里默氏桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鴨疫里默氏桿菌PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟根據(jù)鴨疫里默氏桿菌基因組DNA序列中g(shù)yrB基因的保守序列SEQ ID NO1設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；提取樣品DNA，PCR法擴(kuò)增；凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷樣品是否含有鴨疫里默氏桿菌；所述判斷具體為如果電泳結(jié)果出現(xiàn)相應(yīng)的單一擴(kuò)增條帶，則說(shuō)明樣品中含有鴨疫里默氏桿菌；如果沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的單一擴(kuò)增條帶，則樣品中不含該菌。采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌，檢測(cè)時(shí)間短，成本底，檢測(cè)結(jié)果特異，結(jié)果判定簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102417929SQ20111036934
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者朱德康, 汪銘書, 王雪平, 程安春, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)