專利名稱：花生AhFatA蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及花生AhhtA蛋白及其編碼基因與應用，屬于分析生物學與生物技術領域。
背景技術：
高等植物酰基-ACP硫酯酶O^at)是一種終止脂肪酸合成的酶，可在質體游離脂肪酸的生物合成過程中將acyl-ACPs水解脫去ACP，產生游離的脂肪酸。1992年，Voelker 等指出FAT直接決定了脂肪酸從頭合成途徑中脂酰基鏈的長度(Voelker T A, Worrell A C, AndersonL. et al. Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants [J]. Science, 1992, 257 :72-74.)。花生酰基-ACP 硫酯酶對花生物種子中貯存態的脂肪酸種類和含量、從質體輸出脂肪酸的鏈長和飽和性都起著關鍵的作用。FatA的酶主要對18 I-ACP有活性，對18 O-ACP也有活性。1998年，Deborah J. Hawkins和Jean C. Kridl在莽吉柿種子cDNA中克隆到兩條FatA序列，在體外表達時，發現對C18:1-ACP有特異性的!^atAl也有很強的C18:0_ACP的特異性，構建了含莽吉柿!^atAl基因的轉基因油菜，結果在檢測菜籽油中脂肪酸的種類及其含量時，含量本應很低的硬脂酸竟然占油菜種子油脂總量的20%以上，這個結論充分說明了莽吉柿!^atAl有很強的 C18:0-ACP 的特異性(Hawkins D J, Kridl J C. Characterization of acyI-ACP thioesterase of mangosteen(Garcinia magostana)seed and high levels of stearate production in transgenic canola[J]. The Plant Journal,1998,13 (6))。目前已從向日葵、油菜、擬南芥、蓖麻、山竹等多種植物中獲得!^atA基因片段[M. J. Serrano-Vega · R. Garces · Ε. Marti nez-Force. Cloning, characterization and structural model of a FatA-type thioesterase from sunf1 ower seeds (Helianthusannuus L.). Planta (2005) 221 :868-880]。但是，國內外在目前的現有技術中對此基因的研究很少，在花生中尚沒有對!^atA基因的報道。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種花生AhhtA蛋白及其編碼基因與應用。一種花生Ahi^atA蛋白編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。一種插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。一種插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列載體的重組細胞。由上述花生Ahi^atA蛋白編碼基因表達的Ahi^atA蛋白，具有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列。上述花生Ahi^atA蛋白編碼基因、載體或重組細胞在花生品質改良中的應用。本發明從花生(Arachis hypogaea)中克隆的Ahi^atA蛋白編碼基因，這在國內外尚屬首例。該基因通過影響花生酰基-ACP硫酯酶的表達量，對花生種子中貯存態的脂肪酸種類和含量進行調節，同時還對花生種子中從質體輸出的脂肪酸的鏈長和飽和性進行調節。該基因在花生或其它油料作物種子中的過量表達，可增強其脂肪酸中C18:l脂肪酸的含量，進而提高種子中的含油量，實現花生或其它油料作物品質的改良，因此，具有重要的經濟效益和社會效益。


圖1半定量法表示花生Ahi^atA基因在花生根、莖、葉、花和種子中的表達情況。圖2半定量法表示花生Ahi^atA基因在花生果針入土后10天、20天、30天、40天、 50天、60天、70天的種子中的表達情況。圖3擬南芥種子脂肪酸氣象色譜檢測結果；其中FATA正義花生AhhtA正義基因轉化擬南芥后的第T3代轉基因擬南芥種子，AhFatA反義花生Ahi^atA反義基因轉化擬南芥后的第T3代轉基因擬南芥種子，WT 野生型擬南芥種子。
具體實施例方式實施例1花生Ahi^atA蛋白編碼基因的克隆，具體步驟如下1、5‘端序列確定根據GenBank數據庫中EST序列信息及山竹、葡萄、蕪菁、芥菜型油菜、擬南芥、萼苣花、紫蘇和德國鳶尾氨基酸比對確定所獲得的EST序列5’端包含AhFATA 基因起始密碼子ATG;2、花生未成熟種子總RNA獲得以魯花14花生未成熟種子為材料，采用改良CTAB 法提取魯花14未成熟種子總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA含量及質量；3、目的基因cDNA片段的獲取以獲得的魯花14未成熟種子總RNA為模板，采用 TaKaRa3 ‘-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 反轉錄合成 3 ‘RACE Ready cDNA ；4、設計引物根據GenBank數據庫中EST序列信息設計引物FA-f 5' -TTCGTCGGAGGAGTGTATC-3，，(SEQ ID NO.3)FA-r 5' -CTCTCAAGAACCCAACCAAT-3，，(SEQ ID NO. 4)以3 ‘RACE Ready cDNA為模板，進行PCR擴增，反應程序如下94°C預變性5min， 94°〇變性308，601復性308，721延伸lmin，35個循環后，72°C IOmin, PCR擴增結束后對 PCR產物進行電泳；5、電泳后用全式金生物公司膠回收試劑盒對目的基因進行回收，程序如下(1)紫外燈下用干凈、鋒利的手術刀割取盡量小的帶有目的條帶的瓊脂糖塊 (100mg-200mg)，置于 1. 5mL 離心管中；(2)以凝膠質量毫克數溶膠液體積微升數為1 3的比例加入Extraction Buffer，于恒溫金屬浴中50°C溫育lOmin，得混合液；(3)將步驟(2)制得的混合液全部轉至Spin column內，室溫6000rpm離心lmin，
棄去管內液體；(4)力口 500uL Extraction Buffer 于 Spin column 內，12000rpm 離心 lmin,棄去管內液體；(5)向 Spin column 內加 750uL Wash buffer，12000rpm 離心 lmin，棄去管內液體；(6)2000rpm 離心 lmin，將 Spin column 轉移至 1. 5mL 無菌離心管中；(7)超凈工作臺上晾干；(8)向 Spin column 內加 45uL Elution Buffer，室溫靜置 2min，12000rpm 離心 lmin,目的片段存在于離心管內的液體中。6、回收的目的片段與pGEM-T easy (購自Promoga公司)載體連接用T4 DNA Iigase (購自TaKafci公司)將目的基因片段與pGEM-T easy載體連接，連接體系為10X T4 DNA Ligastion Buffer IuL,目的 PCR片段 5uL，pGEM_T easy載體 luL,T4 DNA Ligase (3U/uL)luL，ddH20 2uL。16°C過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α。7、大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化(1)從37°C培養18 20h的培養基平板上挑取大腸桿菌DH5 α單菌落于30mL LB 液體培養基中，37°C，250r/min振蕩過夜培養；(2)按1/(50 100) (V/V)的量轉入新鮮LB液體培養基中，37°C振蕩培養至0D600 =0. 4 0. 6 ；(3)菌液轉移至無菌離心管種冰浴20min，使培養物冷卻至0°C，4°C，7000rpm離心 5min，收集菌體；(4)棄去上清，倒盡殘液，向沉淀中加入0. 6倍體積冰上預冷的lOOmmol/L CaCl2, 槍頭吸打混勻，冰浴20min ；(5)4°C，7000rpm離心5min，棄上清，向沉淀中加入IOOuL冰預冷的IOOmmol/L CaCl2，槍頭吸打混勻，置4°C冰箱備用，或將制備的感受態細胞加入20%無菌甘油，超低溫冰箱一70°C長期保存；(6)將IOuL帶目的片段的重組質粒加入到50uL大腸桿菌DH5 α感受態細胞中(體積不超過感受態的5% )，輕輕混勻，對照管不加，冰浴30min ；(7) 420C，熱激90s后迅速置于冰浴2 !Bmin ；(8)各加入 85OuL LB 液體培養基，37°C，I5O-I7Orpm 復活 45min ；(9)取200uL平鋪到含有氨芐青霉素(50mg/mL)和5_溴-4-氯-3-吲哚-β -d_半乳糖O0mg/mL)的LB固體平板上，用玻璃涂棒涂勻，37°C培養約3小時至菌液被完全吸收， 將平板倒置，37°C過夜后4°C保存平板；8、菌落PCR檢測陽性克隆配制好PCR反應液(不加模板)后用無菌牙簽挑取抗性平板上的白色單菌落， 在反應液中輕點幾下，進行菌落PCR，反應體系如下10X PCR buffer 3uL, dNTP (2. 5mM each) 2. 5uL, Mg2+2uL, Taq (5U/uL) 0. 5uL,引物 L-F(IOuM) IuL,引物 L-R(IOuM) IuL, ddH20 20uL。擴增程序為94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin, 35個循環后，72°C lOmin，擴增結束后取lOuLPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；9、質粒DN A提取用天根公司質粒小提試劑盒，具體步驟如下(1)挑取菌落PCR陽性的菌落接種于30mL含有氨芐青霉素(50ug/mL)的LB液體培養基中，37°C，180rpm，過夜培養；
(2)取1. 5mL過夜培養的菌液加入1. 5mL離心管中；(3)常溫下12，OOOrpm離心lmin，棄去上清液；(4)加250uL溶液Pl，重懸細菌體沉淀(重懸后沒有細菌團塊)；(5)加250uL溶液P2，上下翻轉4 6次使菌體充分裂解，反應時間不超過5分鐘；(6)力Π 350uL溶液P3，立即溫和地上下翻轉離心管4 6次，溶液應該出現絮狀物， 但不會出現局部沉淀；(7)于 12，OOOrpm 離心 IOmin ；(8)離心后得到的上清液轉移到Spin column內，于6，OOOrpm離心lmin，并棄去
收集管內液體；(9)向Spin column內加750uL漂洗液Pff,于12，OOOg離心30 60秒，并棄去接液管內液體后，再次加入650uL Wash Buffer,于12，OOOg離心30 60秒，棄去接液管內液體；(10) 12，OOOg離心2min，將Spin column轉移到無菌的1. 5mL離心管中，室溫晾干；(11)向 Spin column 內加 50uL Elution Buffer，室溫靜置 lmin ；(12)于12，OOOg離心lmin (1. 5mL離心管內溶液中含有質粒DNA)；10、對提取的質粒DNA進行酶切驗證，陽性質粒送山東省農科院高新技術研究中心測序；11、目的基因全長序列獲得根據GenBank數據庫中公布的5 ‘端EST序列及測序獲得的3 ‘端序列拼接后得到目的基因全長序列，并設計全長序列擴增引物AhFatA-f 5' -CTACCATGGAATGTTGAAGGTTTCAT-3，，(SEQ ID NO. 5)AhFatA-r 5' -CATCACGTGGATCATAATCTTGAAGCT-3，，(SEQ ID N0. 6)擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s，72°C延伸lmin，35 個循環后，72°C IOmin,按上述步驟5 9進行操作后獲得花生脂酰-ACP硫脂酶基因全長序列，命名為花生Ahi^atA蛋白編碼基因。經測序，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例2Ah!^itA基因的序列信息與特性分析花生Ahi^atA蛋白編碼基因全長1650bp，開放閱讀框為1119bp，位于189_1307bp 處。BioXM軟件分析表明Ahi^atA基因共編碼372個氨基酸。根據PR0SITE SCAN數據庫分析花生Ahi^atA基因編碼的氨基酸，發現此序列包含N端糖基化位點(N-glycosylation site, PS00001)；環磷酸腺苷和環磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶磷酸化位點(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, PS00004)；蛋白激 Bl C 舞酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site, PS00005)；酪蛋白激酶 II 磷酸化位 ^ (Casein kinase Ilphosphorylation site, PS00006) ； (Tyrosine kinase phosphorylation site, PS00007) :N_ 端十四燒酰化位點(N-myristoylation site, PS00008)；微體C-末端定位信號(Microbodies C-terminal targeting signal，PS00342)。用ProtParam預測編碼蛋白的物理化學性質，推測其分子式C1835H2938N538O558S17， 分子量為42009. 8，等電點為6. 73，理論推導半衰期為30h，不穩定參數是39. 15，屬于穩定蛋白。該蛋白中含量相對較多的氨基酸是Leu(9. )，Arg(8.9% )，Val(8.9% )，Gly(7. 5%),Ser(7.0% ),Glu(7.0% )；并且該蛋白中不含Pyl和kc。總的帶正電荷殘基為(Arg+Lys) :48總的帶負1電荷的殘基為(Asp+Glu) :49。該蛋白親水性平均數為-0. 365， 預測該蛋白為疏水性蛋白。用SignalP 3. (Server進行預測，表明該蛋白不含信號肽序列， 為非分泌性蛋白。以TMHMM2program為基礎的跨膜結構預測表明該蛋白不含跨膜結構。采用在線HNN網站預測花生Ahi^atA蛋白二級結構，表明該蛋白含有34. 14%的 α -螺旋，20. 97%的β -折疊以及44. 89%的無規則卷。用3D-JIGSAW預測花生Ahi^atA蛋白的三級結構，結果表明該蛋白呈緊密的球狀結構。實施例3單鏈cDNA的獲得及Ahi^atA在魯花14不同組織中的表達模式分析分別以魯花14的根、莖、葉、花、種子和魯花14果針入土后10天、20天、30天、 40 天、50 天、60 天、70 天種子的總 RNA 為材料，利用 PrimeScript 1st Strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa)試劑盒反轉錄的cDNA為模板，根據GenBank中β -actin序列設計 1對引物F 5 ‘-GCAGGGCGTGATTTAACTG-3，，(SEQ ID NO. 7)R 5 ‘-CTCCGATCCAGACACTGTACT-3，. (SEQ ID NO. 8)以β -actin為內參基因進行半定量RT-PCR分析硫脂酶基因Ahi^atA在魯花14不同組織中的表達量。AhhtA引物AhFatA-RT-F 5 ‘-CAATAAGACTGCCACCGT-3，，(SEQ ID NO. 9)AhFatA-RT-R 5 ‘-TCAAGAACCCAACCAAT-3，，(SEQ ID NO. 10) PCR 反應條件為: 940C 5min，后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C Imin 進行四個循環；最后 72°C lOmin，反應結束后， 進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示Ahi^aU在魯花14花生各部位中都有表達，其中種子中表達量最高，在葉、花中表達量次之，在根中表達稍低，在莖中幾乎不表達(如圖1所示)；AhhtA在花生果針入土后第10天到第70天都有表達，其中第10天表達量較低，第30 天表達量最高(如圖2所示)。實施例4花生Ahi^atA基因正反義表達載體的構建(1)根據分離出的花生AhhtA基因核苷酸序列，設計引物正義正向引物5，—CTACCATGGAATGTTGAAGGTTTCAT—3'(SEQ ID N0. 11)正義反向引物5，—CATCACGTGGATCATAATCTTGAAGCT—3'(SEQ ID N0. 12)反義正向引物5，—CTACACGTGAATGTTGAAGGTTTCAT—3'(SEQ ID N0. 13)反義反向引物5，—CATCCATGGGATCATAATCTTGAAGCT—3'(SEQ ID N0. 14)(2)以花生種子總RNA反轉錄的cDNA為模板，進行PCR反應。反應程序如下 模板 cDNAl μ L, 2 Xpfu MixlO. OyL, primerl (IOum) 0. 5 μ L, primer2 (IOum) 0. 5 μ L, ddH208. 0 μ L。PCR 反應條件為94°C 預變性 5min，94°C變性 30s，55 °C 復性 30s，72 °C 延伸 lmin，35個循環后，72°C IOmin結束反應。取5yL PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，切膠回收，連接PGEM-T easy載體(購自progenia公司)，轉化大腸桿菌DH5 α， 藍白斑篩選后挑取白色菌落在LB液體培養基中搖菌，提取質粒DNA進行序列測定，具體方法同實施例1中步驟5 10。(3)用NcoI和RnlI兩個限制性內切酶將花生Ahi^atA正反兩個基因從pGEM_T easy載體上切下，與同樣經NcoI和PmlI酶切的pCAMBIA3301載體(購自cambia公司)連接，連接產物轉化DH5 α感受態細胞，然后在含卡那霉素的LB固體平板上培養，對菌落進行PCR鑒定和質粒DNA的酶切分析。將構建好的正反義表達載體轉化農桿菌LBA4404。實施例5農桿菌轉化擬南芥(1)挑取轉化后的農桿菌單克隆于含50μ g/ml卡那霉素的YEP液體培養基中， 28°C、200rpm振蕩培養至0D_ = 0. 6，離心收集菌體，5 %蔗糖溶液(0. 02% Silwet L-77) 溶液懸浮沉淀，得滲透液；(2)將盛花期擬南芥花序浸入步驟(1)制得的滲透液中，浸泡5分鐘；(3)收獲經浸泡花序的擬南芥的種子并在篩選培養基上篩選，得到抗性植株；(4)培育步驟(3)制得的抗性植株，獲得Tl代純合株系種子并種植于培養室，2月后觀察生長狀況。實施例6轉基因擬南芥的獲得(1)收獲實施例4種植的擬南芥的種子，種植該種子并收獲第二代種子；(2)萌發少量第二代種子，通過提取DNA進行PCR檢測、Southern雜交方法，驗證轉基因植株，獲得轉基因擬南芥；(3)測定轉基因擬南芥種子中脂肪酸的含量。表1為經氣象色譜檢測的擬南芥種子中脂肪酸含量。表 1
C16:0C16:lC18:0C18:lC18:2C18:3C20:0C20:lC20:2C20:3WT2.077.953.913.7329.3717.52.8520.371.810.45FatA 正2.018.072.0218.8530.5615.212.4319.491.150.21FatA 反2.357.84.511.729.8517.563.0720.12.320.75注WT 為野生型擬南芥種子；FatA正轉正義花生Ahi^atA基因得T3代轉基因擬南芥種子；FatA反轉反義花生Ahi^atA基因得T3代轉基因擬南芥種子。由表1可看出，與野生型相比，轉正義Ahi^atA的擬南芥種子中C18:1含量增加了 4. 92%，進而使擬南芥種子中C18:2含量也稍有升高；轉反義Ahi^atA的擬南芥種子中 C18:l 含量下降了 2. 03%，而其它脂肪酸如 C16:0、C16:1、C18:0、C18:2、C18:3、C20:0 無明顯變化。表明過量表達花生硫脂酶基因AhhtA可以有效提高轉基因作物中脂肪酸中C18:l 的含量，同時可有效提高種子含油量。對于改良作物品質，提高生物量具有重要的意義。
權利要求
1.一種花生Ahi^atA蛋白編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。
3.一種插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列載體的重組細胞。
4.權利要求1所述花生Ahi^atA蛋白編碼基因表達的Ahi^atA蛋白，具有SEQID NO. 2 所示氨基酸序列。
5.權利要求1所述的花生Ahi^atA蛋白編碼基因、權利要求2所述的載體或權利要求3 所述的重組細胞在花生品質改良中的應用。
全文摘要
本發明涉及花生AhFatA蛋白及其編碼基因與應用，屬于基因工程技術領域。一種花生AhFatA蛋白編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示由上述花生AhFatA蛋白編碼基因表達的AhFatA蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。本發明為下一步在花生中對AhFatA基因進行過量表達及抑制表達研究，提高花生種子含油量和實現花生品質改良的研究奠定基礎。
文檔編號C12N1/15GK102492704SQ201110368839
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月18日 優先權日2010年11月30日
發明者單雷, 唐桂英, 張斌, 彭振英, 李蘭, 畢玉平, 陳高 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心