專利名稱：一種從人胚胎干細胞分化成神經細胞的方法
技術領域：
本發明涉及發育生物學、細胞生物學和細胞治療領域，更具體地涉及一種人胚胎干細胞定向分化技術，本發明提供了在體外將人胚胎干細胞誘導為神經細胞的新方法。
背景技術：
細胞移植治療神經系統疾病是當今生物醫學研究的一個熱門領域，盡管目前細胞治療已經取得很大進展，但由于細胞來源及供體短缺等因素，限制了其臨床應用的步伐，同時也帶來倫理道德的爭論。胚胎干細胞是能在體外培養的高度未分化細胞，具有多潛能性， 可以誘導分化成多種組織細胞。將胚胎干細胞定向誘導分化成特定類型的神經細胞，不但可以解決上述問題，還可以使供體細胞對不同神經系統疾病更具靶向性。胚胎干細胞體外分化為神經細胞的研究始于1981年，迄今為此，誘導胚胎干細胞分化為神經細胞的方法通常有無血清誘導法、全反式維甲酸誘導法、可溶性因子誘導法、基質細胞共培養法等。人胚胎干細胞定向分化面臨的一個關鍵問題就是分化效率和分化細胞的均勻性。胚胎干細胞在培養和分化過程中，如果細胞以懸浮方式培養時，它們會聚集形成球狀細胞團(擬胚體)。擬胚體一般具有外、中、內三胚層結構，且其體外生長分化能夠模擬正常胚胎的發育過程。目前，胚胎干細胞定向分化的研究很大部分都是圍繞這一基礎進行的。然而，這一方法也存在著諸多弊端，首先三胚層結構復雜，細胞種類多且分布不均；其次操作程序繁雜，前期需要制作擬胚體，后期還得篩選目的細胞。本發明的基本策略是使人胚胎干細胞在單細胞的狀態下盡快貼壁，避免其形成擬胚體狀態，不僅排除各胚層細胞之間復雜的相互作用的干擾，且使得所有的胚胎干細胞處于均一的分化環境。丁酸鈉屬于一類短鏈脂肪酸，它能夠抑制組蛋白脫乙酰基酶的活性，2003年 Geron公司研究人員發現丁酸鈉可通過擬胚體途徑誘導人胚胎干細胞定向分化為肝細胞， 隨后也有文獻報道丁酸鈉可誘導胚胎干細胞分化為胰腺細胞，這說明丁酸鈉抑制組蛋白脫乙酰化作用并不是針對某類細胞譜系特異基因所在的染色質特定區域，它只是隨機地松散染色質。本發明先利用丁酸鈉打破組蛋白乙酰化的平衡，促使染色質松散，從而抑制胚胎干細胞增殖，使其盡快進入分化狀態；結合單層直接貼壁分化方法并添加特定的誘導培養基， 即可在相對短的時間里獲得高比例的神經細胞。

發明內容
本發明目的是提供一種在體外將人胚胎干細胞誘導分化成神經細胞的新方法，所述方法是以丁酸鈉作為分化誘導劑，聯合神經誘導培養液，通過人胚胎干細胞直接單層貼壁、二步誘導途徑實現的。本發明所用細胞材料和試劑說明如下A，人胚胎干細胞(hESCs)本發明所述人胚胎干細胞可以以任何方式獲得，都可用于本發明，如各種文獻中公開確立的hESCs，保藏機構或者商家購買得到的hESCs，流產胚胎或不同發育階段的囊胚分離得到的hESCs均可，本發明采用的Hl人胚胎干細胞系購自WiCell Research Institute, Madison WI, USA.，NIH 編號 WA01，參見 http://wicell. org八B，培養液及試劑本發明所用培養液可在常用的細胞基本培養基的基礎上補充一種或多種成分而得到。可用于本發明的細胞基本培養基可以包括但不僅限于DMEM、MEM、RPMI1640, F_10、 F12、α MEM、KO-DMEM以及IMDM。這些培養基的配方是本領域所公知的，不僅在普通教科書和實驗手冊中有詳細描述，而且還可以直接以成品的形式從公司購買獲得。作為補充物的成分可以是任何維持或促進細胞生長的成分。他們可以包括但不限于氨基酸、維生素、蛋白、激素、金屬離子、微量元素、脂肪酸、糖等等。作為舉例，本發明可使用包含如下成分組合的培養基，除非另外指出，本發明所用試劑均購自invitrogen公司。(1)人胚胎干細胞培養液基本培養基K0-DMEM補充物(維持或促進細胞生長的營養物質)10% KO-血清替代物；10%胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；0. ΙπιΜβ-巰基乙醇；非必需氨基酸；10U/ml人白細胞抑制因子(LIF) ； 100U/ml青霉素；100ug/ml鏈霉素；4ng/ml人重組堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF) ；ρΗ7· 0 7. 4。(2)誘導培養基I:基本培養基DMEM補充物(維持或促進細胞生長的營養物質)15%胎牛血清；2mM L-谷氨酰胺；ImM硫代甘油(MTG) (sigma) ；非必需氨基酸；100U/ml青霉素；100ug/ml鏈霉素； ρΗ7· 0 7. 4。(3)誘導培養基II:基本培養基KO-DMEM補充物(維持或促進細胞生長的營養物質)50% Ν2/Β27 ；ImM硫代甘油(MTG) (sigma) ；2mM L-谷氨酰胺；0. ΙπιΜβ -巰基乙醇；1 %非必需氨基酸；10U/ml人白細胞抑制因子(LIF) ； 100U/ml 青霉素；100ug/ml 鏈霉素；ρΗ7· 0 7. 4。本發明提供一種從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，所述方法為將人胚胎干細胞進行分離純化，獲得人胚胎干細胞單體，將人胚胎干細胞單體按1 5 X IO4個/cm2 的細胞密度接種進行單層貼壁誘導培養，所述誘導培養是以丁酸鈉結合誘導培養基I對人胚胎干細胞進行預誘導，再以誘導培養基II進行分化誘導培養，獲得神經細胞；所述誘導培養基I以DMEM為基礎培養基，還包含維持或促進細胞生長的營養物質；所述誘導培養基II 以KO-DMEM為基礎培養基，還包含維持或促進細胞生長的營養物質。進一步，優選所述人胚胎干細胞按3 X IO4個/cm2的細胞密度進行單層貼壁誘導培養。所述誘導培養基I以DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的營養物質15%胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG，1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。所述誘導培養基II以KO-DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的營養物質50% 的N2和B27血清替代物，15% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG, 1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。
所述丁酸鈉在誘導培養基I中的終濃度為1 10mM，優選1 5mM，更優選2. 5mM。所述誘導培養是以丁酸鈉結合誘導培養基I對人胚胎干細胞于37°C，5% CO2, 100%濕度條件下預誘導培養1 3天，傾去培養液，再加入誘導培養基II中繼續于37°C， 5% CO2,100%濕度條件下分化培養8 14天，獲得所述神經細胞。進一步，所述預誘導培養優選2天，分化誘導培養優選8 12天。進一步本發明從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法所述誘導方法包括如下步驟(1)人胚胎干細胞的擴增和純化；( 人胚胎干細胞單層貼壁及預誘導；C3)神經細胞的分化誘導形成，具體為(1)分離純化人胚胎干細胞；將人胚胎干細胞接種至0. 1 2%明膠包被的培養孔板中的小鼠成纖維飼養層細胞上，于人胚胎干細胞培養液中，37°C，5% C02，100%濕度條件下培養5 8天，獲得小鼠成纖維細胞和擴增后人胚胎干細胞的細胞混合物；獲得的細胞混合物于消化液中，37°C 消化5分鐘，獲得懸浮液并置于含人胚胎干細胞培養液的0. 1 2%明膠包被的培養瓶中， 37°C貼壁培養1 2h，小鼠成纖維飼養層細胞將貼壁，而人胚胎干細胞大部分仍懸浮于培養液中，收集培養液離心，棄去上清液后獲得擴增的人胚胎干細胞單體；所述消化液為終濃度0. 05%胰蛋白酶和終濃度0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液，所述人胚胎干細胞培養液以KO-DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的物質10% 1胎牛血清，10% KO-血清替代物，2mML-谷氨酰胺，0. ImM 2-β -巰基乙醇，1 %非必需氨基酸，10U/ml人白細胞抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和10U/ml堿性成纖維細胞生長因子，pH7. 0 7.4；(2)人胚胎干細胞單層貼壁及預誘導；將步驟(1)分離純化后的人胚胎干細胞單體以3 X IO4個細胞/cm2的密度接種于10 μ g/ml多聚賴氨酸包被的培養孔板上，于含2. 5mM 丁酸鈉的誘導培養基I中37°C，5% CO2,100%濕度條件下培養2天，傾去培養液；(3)神經細胞的誘導形成；步驟⑵所得的細胞于誘導培養基II中37°C,5% CO2,100%濕度條件下繼續分化培養10天，即獲得所述神經細胞。本發明所述方法獲得的神經細胞至少具有如下特征之一(1)具有典型的細胞體、軸突和樹突等細胞結構；(2)至少表達以下蛋白=NeuroD ^P β-tublin III ；(3)神經細胞占誘導細胞群體85%左右；(4)對外界刺激具有放電功能。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在相比現有的擬胚胎途徑或共培養誘導神經細胞的方法，本發明可克服其細胞異質程度大，分化效率低、不便實時觀察和操作，需要后期分選過程等弊端。具有操作簡便、誘導周期短(10 12天)、細胞分化均一度高(比例高達85% )等優點；丁酸鈉是一種短鏈脂肪酸分化誘導劑，它是通過抑制組蛋白脫乙酰基酶活性來介導細胞分化，本發明利用丁酸鈉預處理人胚胎干細胞抑制其增殖，促進其盡快進入分化狀態，在人胚胎干細胞單層貼壁(非擬胚體)的狀態下運用誘導培養基 II即可高效誘導其向神經細胞定向分化，神經細胞占誘導細胞群體85%左右，明顯高于目前文獻報道的誘導效率。電生理檢測發現該神經細胞具有驚厥樣放電功能。

圖1為本發明神經細胞分化誘導流程圖；圖2為本發明神經細胞的免疫細胞化學結果，A為誘導12天的神經細胞β-tublin III免疫細胞化學結果，B為相差圖；圖3為本發明神經細胞的Wfestern blot分析；圖4為本發明神經細胞的流式細胞分析，B為本發明神經細胞，A為同型對照；圖5為本發明神經細胞的電生理檢測；
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此所述誘導培養基I以DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的營養物質15%胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG，1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。所述誘導培養基II以KO-DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的營養物質50% 的N2和B27血清替代物，15% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG, 1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。所述人胚胎干細胞培養液以KO-DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的物質 10% 1胎牛血清，10% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，0. ImM 2-β -巰基乙醇，1 %非必需氨基酸，10U/ml人白細胞抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和10U/ml 堿性成纖維細胞生長因子，PH7. 0 7. 4 ；實施例1 神經細胞分化誘導(1)分離純化人胚胎干細胞；將人胚胎干細胞接種至0. 明膠包被的培養孔板中的小鼠成纖維飼養層細胞上，于人胚胎干細胞培養液中，37°C，5% C02，100%濕度條件下培養6天，獲得小鼠成纖維細胞和擴增后人胚胎干細胞的細胞混合物；獲得的細胞混合物于消化液中，37°C消化5分鐘，獲得懸浮液并置于含人胚胎干細胞培養液的明膠包被的培養瓶中，37°C貼壁培養 1. 5h，小鼠成纖維飼養層細胞將貼壁，而人胚胎干細胞大部分仍懸浮于培養液中，收集培養液離心，棄去上清液后獲得擴增的人胚胎干細胞單體；所述消化液為終濃度0. 05%胰蛋白酶和終濃度0. 02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液；(2)人胚胎干細胞單層貼壁及預誘導；將步驟(1)分離純化后的人胚胎干細胞單體以3 X IO4個細胞/cm2的密度接種于10 μ g/ml多聚賴氨酸包被的培養孔板上，于含2. 5mM 丁酸鈉的誘導培養基I中37°C，5% CO2,100%濕度條件下預誘導培養2天，傾去培養液。(3)神經細胞的誘導形成；步驟⑵所得的細胞于誘導培養基II中37°C,5% CO2,100%濕度條件下繼續分化培養10天，即獲得所述神經細胞；上述步驟的流程圖如圖1。實施例2 神經細胞的檢測1、免疫組化
步驟(1)將實施例1方法獲得的神經細胞加入3ml預熱至35°C，用杜氏磷酸緩沖液 (DPBS)漂洗細胞兩次，每次:3min ；(2)加入:3ml 4%多聚甲醛固定液，室溫固定30min ；(3) DPBS 漂洗 3 次，每次!3min。用含去垢劑(Triton X-100)的 DPBS 在 37°C 溫育30分鐘。(4)加入3ml含5%山羊血清的DPBS (封閉液)，室溫下作用30min。(5)用槍頭吸棄封閉液后，加入1 500稀釋的鼠抗人β-tublin III單抗 (Millipore 公司)。4°C過夜(18h 以上)。(6)用槍頭吸棄一抗反應液，用DPBS漂洗3次，每次5min。(7)加入1 200稀釋的羊抗鼠熒光二抗(Millipore公司)，37°C避光溫育lh。(8)用槍頭吸棄第二抗體反應液后，用DPBS漂洗兩次，每次5min。(9)雙蒸水漂洗2次，熒光顯微鏡(Nikon)下觀察并拍照記錄，如圖2顯示，A為誘導12天的神經細胞β -tublin III免疫細胞化學結果，B為相差圖。2、Western-blot 分析收集實施例1方法誘導0天，2天，7天，12天(整個誘導過程的時間)的神經細胞， 用4°C預冷的磷酸緩沖液PBS洗三次后，加入裂解液(50mMTris-HCl，pH8. 0,150mM NaCl, 100 μ g/ml PMSF, 1 % TritonX-100)冰上裂解 30min，12000g 離心 5min，去除細胞碎片后，取 50 μ g樣品與上樣緩沖液(上海生物工程有限公司)混合，煮沸5min，進行10%的SDS-PAGE 膠進行電泳，轉硝酸纖維素膜(Pall Corporation)，將膜在含5%脫脂奶粉的TBSTdOmM Tris-HCl，pH7. 5，150mM NaCl,0. 05% Tween-20)中室溫下封閉 Ih，隨后加入鼠抗人NeuroD 和β -tublin III 一抗，抗鼠IgG-HRP 二抗，ECL化學發光試劑(Invitrogen公司)檢測， 如圖2所示。圖3中顯示神經細胞特異標志(NeuroD和β-tublin III)表達量隨著誘導時間延長而增加，胚胎干細胞特異標志0ct4因細胞分化而消失。β -actin為內參。3、流式細胞分析(1)實施例1方法誘導12天的神經細胞，200 X g離心5min后用4°C DPBS漂洗兩次。(2)重懸于0. 5ml的4°C的4%多聚甲醛中，18- °C溫育10分鐘。間歇地渦旋管子以維持單細胞懸液。(3) DPBS 漂洗 2 次，每次 3min。200Xg 離心 5min。(4)用含去垢劑(Triton X-100)的 DPBS 在 37°C溫育 30 分鐘。(5) 200Xg離心5min，棄上清后加入3ml含5%山羊血清的DPBS (封閉液)，室溫下作用30min。(6)200\8離心5!1^11，棄上清后加入1 40稀釋的FITC標記過的β-tublin III 單抗(Thermo公司)；加抗體稀釋液作為同型對照。室溫孵育2小時。(7) 200 X g離心5min，棄上清，用DPBS漂洗2次，每次5min。(8) 200 X g離心5min，棄上清后每管用200_400uL的DPBS重懸細胞，上流式細胞儀(FACSCalibur，BD公司)進行檢測分析。
圖4中B顯示誘導細胞中神經細胞比例約占85%，A圖為同型對照。4、電生理檢測培養皿中的培養測試腔內加入150 μ 1的10μ g/ml多聚賴氨酸表面處理液，37°C 培養箱中放置M小時，然后用滅菌雙蒸水將培養皿漂洗3次，鋪入實施例1獲得的神經細胞，37°C、5% CO2培養3天，再對神經細胞進行無鎂細胞外液37°C處理3h。采用LAPS芯片系統(浙江大學開發)檢測誘導出的神經細胞電位，結果如圖5所示。無鎂細胞外液主要成分145mMNaCl, 2. 5mM KCl，IOmM Hepes,2mM CaCl2, IOmM 葡萄糖，0. 002mM甘氨酸，pH 7. 3，并用葡萄糖調節滲透壓至325mM。圖5中顯示神經細胞經無鎂誘導后驚厥樣電位信號(上)及自發電位信號(下)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述方法為將人胚胎干細胞進行分離純化，獲得人胚胎干細胞單體，將人胚胎干細胞單體按1 5X IO4個/cm2 的細胞密度接種進行單層貼壁誘導培養，所述誘導培養是以丁酸鈉結合誘導培養基I對人胚胎干細胞進行預誘導，再以誘導培養基II進行分化誘導培養，獲得神經細胞；所述誘導培養基I以DMEM為基礎培養基，還包含維持或促進細胞生長的營養物質；所述誘導培養基II 以KO-DMEM為基礎培養基，還包含維持或促進細胞生長的營養物質。
2.如權利要求1所述的從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述人胚胎干細胞按3 X IO4個/cm2的細胞密度進行單層貼壁誘導培養。
3.如權利要求1所述的從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述誘導培養基I以DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的營養物質15%胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG，非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。
4.如權利要求1所述的從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述誘導培養基II以KO-DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的營養物質50%的N2和B27血清替代物，15% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，ImM MTG，1 %非必需氨基酸，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。
5.如權利要求1所述的從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述丁酸鈉在誘導培養基I中的終濃度為1 10mM。
6.如權利要求1所述的從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述誘導培養是以丁酸鈉結合誘導培養基I對人胚胎干細胞于37°C，5% CO2,100%濕度條件下預誘導培養1 3天，傾去培養液，再加入誘導培養基II中繼續于37°C，5% CO2,100%濕度條件下分化誘導培養8 14天，獲得所述神經細胞。
7.如權利要求6所述的從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，其特征在于所述預誘導培養2天，分化誘導培養8 12天。
8.如權利要求1所述的從胚胎肝細胞分化成神經細胞的方法，其特征在于所述方法為(1)分離純化將人胚胎干細胞接種至0. 1 2%明膠包被的培養孔板中的小鼠成纖維飼養層細胞上，于人胚胎干細胞培養液中，37°C，5% C02，100%濕度條件下培養5 8天， 獲得擴增人胚胎干細胞和小鼠成纖維細胞混合物；將獲得的混合物于消化液中，37°C消化 5min，獲得懸浮液，并置于含人胚胎干細胞培養液的0. 1 2 %明膠包被的培養瓶中，37°C 貼壁培養1 2h，貼壁結束，將培養液離心，棄去上清液，獲得人胚胎干細胞單體；所述的消化液為終濃度0. 05%胰蛋白酶和終濃度0. 02%乙二胺四乙酸混合溶液；所述人胚胎干細胞培養液以KO-DMEM為基礎培養基，加入終濃度如下的物質10% 1胎牛血清，10% KO-血清替代物，2mM L-谷氨酰胺，0. ImM 2_β -巰基乙醇，1 %非必需氨基酸，10U/ml人白細胞抑制因子(LIF)，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和10U/ml堿性成纖維細胞生長因子， PH7. 0 7. 4 ； (2)將分離純化的人胚胎干細胞單體以3X IO4個/cm2的細胞密度接種于 10 μ g/ml多聚賴氨酸包被的培養孔板上，于含2. 5mM 丁酸鈉的誘導培養基I中37°C，5% CO2,100%濕度條件下預誘導培養2天，傾去培養液，再加入誘導培養基II中繼續37°C，5% CO2,100%濕度條件下分化培養10天，獲得所述神經細胞。
全文摘要
本發明公開了一種從人胚胎干細胞誘導分化神經細胞的方法，所述方法為將人胚胎干細胞進行分離純化，獲得人胚胎干細胞單體，將人胚胎干細胞單體按1～5×104個/cm2的細胞密度接種進行單層貼壁誘導培養，所述誘導培養是以丁酸鈉結合誘導培養基I對人胚胎干細胞進行預誘導，再以誘導培養基Ⅱ進行分化誘導培養，獲得神經細胞；本發明可克服已有分化方法中神經細胞異質程度大，分化效率低、不便實時觀察和操作，需要后期分選過程等弊端，具有操作簡便、誘導周期短(10～12天)、神經細胞均一度高(比例高達85％)等優點，電生理檢測發現該神經細胞具有驚厥樣放電功能。
文檔編號C12N5/079GK102559593SQ20111037404
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月22日 優先權日2011年11月22日
發明者張遵義, 張銘, 楊曉娟, 黃華榮 申請人:杭州師范大學