專利名稱：產(chǎn)糖苷酶的黑曲霉及其應(yīng)用于提高虎杖中白藜蘆醇含量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株糖苷酶產(chǎn)生菌——黑曲霉(Aspergullis niger) XW-2，及其在生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
中藥材虎杖為蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum)的干燥根莖，主要有效成分為二苯乙烯類和蒽醌類化合物，前者包括虎杖苷和白藜蘆醇，虎杖苷也稱為白藜蘆醇苷。白藜蘆醇是一種活性多酚類物質(zhì)，具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過(guò)敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化和防治冠心病、缺血性心臟病、高血脂癥等療效，白藜蘆醇已被列為抗心血管、抗癌最有前途的藥物之一。干燥虎杖根莖中白藜蘆醇含量?jī)H為0. 0.2%，而虎杖苷的含量明顯高于白藜蘆醇，含量約為2%左右。雖然虎杖苷可在人的腸道中被一些微生物降解而轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，發(fā)揮其藥理作用，但轉(zhuǎn)化率較低，大部分虎杖苷不能充分發(fā)揮其藥理作用。
采用化學(xué)或生物的方法，可以將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。采用酸堿水解可將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，但酸堿容易破壞白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)，并生成大量的異構(gòu)體，造成分離純化困難，轉(zhuǎn)化率，實(shí)際應(yīng)用的可行性不大。生物法則可以專一性地實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)化，微生物產(chǎn)生的糖苷酶可以將虎杖苷中的葡萄糖殘基水解，從而使得虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。相比之下， 生物轉(zhuǎn)化法將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，具有結(jié)構(gòu)不被破壞，轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)ο
目前，有關(guān)采用生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量的國(guó)內(nèi)專利公開的方法有三種(1)將新鮮的虎杖打漿，在一定的溫度和攪拌轉(zhuǎn)速下自然發(fā)酵酶解。此法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化率低、易污染，在生產(chǎn)過(guò)程中新鮮虎杖不便于保存，大批量生產(chǎn)有困難；( 在虎杖粉或虎杖粗提物中加入纖維素酶等糖苷酶，在一定的溫度下酶解。此法專一性好，但使用商品酶的成本高，對(duì)虎杖苷進(jìn)行粗提，操作較繁瑣，效率低；C3)虎杖粉碎后加水，接種某種微生物， 或不接種的自然發(fā)酵。此法具有方法簡(jiǎn)單，成本低優(yōu)點(diǎn)，但微生物菌體及其代謝產(chǎn)物留在中藥材中，影響藥材的品質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一株糖苷酶產(chǎn)生菌——黑曲霉(Aspergullis niger) XW-2，及其在生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量中的應(yīng)用，較好地克服了現(xiàn)有提高虎杖中白藜蘆醇含量方法的缺點(diǎn)，具有成本低、周期短和經(jīng)處理的虎杖品質(zhì)高等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
黑曲霉(Aspergullis niger)XW-2，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)， 武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCC No =M 2011；358，保藏日期2011年10月19日。
本發(fā)明所述黑曲霉XW-2由土壤中分離，經(jīng)過(guò)篩選得到的優(yōu)良菌株。
所述黑曲霉XW-2的菌落特征如下在斜面或平板培養(yǎng)基上，30°C條件下，培養(yǎng)2天，菌落即可長(zhǎng)滿。菌落初期為白色絨毛狀，之后逐漸呈黑色，產(chǎn)生大量黑色分生孢子。顯微鏡下觀察到分生孢子頭呈黑褐色放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一，頂囊球形，雙層小梗，分生孢子黑褐色球形。
所述黑曲霉XW-2的18s rRNA的部分核苷酸序列如下CCGGGATTGCCTCAGTAACGGC GAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGG GTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGC CCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTA AATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAG CACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTAC TTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTT ATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAAC GAC。
本發(fā)明還涉及所述的黑曲霉XW-2在微生物發(fā)酵制備糖苷酶中的應(yīng)用。
具體的，所述應(yīng)用為將黑曲霉XW-2菌種接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25 30°C培養(yǎng) 48 72h，獲得含有糖苷酶的發(fā)酵液。所得發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾或離心除去菌體的清液為糖苷酶粗酶液，可以直接應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量；也可以保藏于4°C冰箱10 天內(nèi)使用；也可以經(jīng)過(guò)冷凍干燥，制成粗酶粉保藏于4°C冰箱長(zhǎng)期使用。
所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成如下蔗糖40 60g/L、NH4Cl 2 4g/L、K2HP040. 5 lg/L、 KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 0. 05g/L，溶劑為水，pH 6. 5 7. 5。
本發(fā)明還涉及所述的黑曲霉XW-2在生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量中的應(yīng)用。
具體的，所述應(yīng)用為將黑曲霉XW-2菌種接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25 30°C培養(yǎng) 48 72h，發(fā)酵液經(jīng)固液分離獲得糖苷酶粗酶液，往粗酶液中加入50 150g/L的虎杖粉， 于25 35°C、200 400r/min振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化8 24h后，過(guò)濾除去粗酶液，虎杖粉經(jīng)烘干備用。經(jīng)生物轉(zhuǎn)化法處理后的虎杖粉，既可作為中藥材使用，也可用于白藜蘆醇的提取制備。
所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成如下蔗糖40 60g/L、NH4Cl 2 4g/L、K2HP040. 5 lg/L、 KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 0. 05g/L，溶劑為水，pH 6. 5 7. 5。
所述菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，然后經(jīng)種子培養(yǎng)基擴(kuò)培、獲得種子液，或斜面孢子直接接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)。
具體的，所述活化及種子培養(yǎng)和產(chǎn)酶方法如下
(1)將黑曲霉XW-2菌種孢子接種于斜面培養(yǎng)基，于25 30°C培養(yǎng)48 72h，得到活化后的黑曲霉XW-2菌種；所述的斜面培養(yǎng)基組成為馬鈴薯100 200g/L(馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加5倍質(zhì)量水煮沸20 30min，4層紗布過(guò)濾去除馬鈴薯塊)、葡萄糖10 20g/L、NaCl 5 10g/L、瓊脂15 20g/L，溶劑為自來(lái)水，pH自然；
(2)將步驟(1)活化培養(yǎng)后黑曲霉XW-2孢子接種至種子培養(yǎng)基中，于25 30°C、 100 250r/min振蕩條件下培養(yǎng)36 48h，得種子液；所述種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖 30 60g/L、(NH4)2SO4 5 10g/L、KH2PO4 3 5g/L、MgSO4 0. 5 1. Og/L，溶劑為自來(lái)水， PH自然；
(3)將步驟⑵種子液以5% 10%的體積比的接種量，移種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，或?qū)⒉襟E(1)的黑曲霉XW-2孢子直接接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基，產(chǎn)酶培養(yǎng)基于25 30°C、150 250r/ min振蕩條件下培養(yǎng)48 72h，得到黑曲霉XW-2的發(fā)酵液；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為蔗糖 40 60g/L、NH4Cl 2 4g/L、K2HPO4 0. 5 lg/L、KCl 0. 3 0. 5g/L、MgSO4 0. 3 0. 5g/ L、FeSO4O. 02 0. 05g/L,溶劑為自來(lái)水，pH 6. 5 7. 5。
本發(fā)明將虎杖粉碎后直接為原料，利用特異性較高的微生物產(chǎn)生以糖苷酶為主要活性成分的粗酶液直接進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化處理，糖苷酶將其中的虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，而且微生物產(chǎn)生其他類水解酶對(duì)虎杖中淀粉、纖維素等的降解，也有利于白藜蘆醇的釋放，因此經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖中，白藜蘆醇的含量便可大幅度提高。虎杖經(jīng)過(guò)此法處理后，既可作為中藥材使用，也可用于白藜蘆醇的提取制備，其藥理作用或白藜蘆醇的提取收率將大幅度提高。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)黑曲霉是發(fā)酵工業(yè)中常用菌種，無(wú)毒無(wú)害，使用安全；(2)黑曲霉XW-2營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、容易培養(yǎng)；(3)黑曲霉XW-2產(chǎn)生的糖苷酶為胞外酶，分離除去菌體后，粗酶液直接作為生物轉(zhuǎn)化體系，虎杖粉碎加入轉(zhuǎn)化后，其中的白藜蘆醇的含量最高可提高4倍；(4)生物轉(zhuǎn)化處理過(guò)的虎杖中無(wú)菌體及其代謝產(chǎn)物殘留，既可作為中藥材使用，也可用于白藜蘆醇的提取制備。

圖1為標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇(濃度為0. 05g/L)高效液相色譜圖2為未經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖乙醇浸提液的高效液相色譜圖3為經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖乙醇浸提液的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1 產(chǎn)糖苷酶微生物的富集、分離和篩選
250mL三角瓶中加入約50g虎杖干粉(粉碎后過(guò)80目篩)，加適量自來(lái)水和5g田園土壤，攪拌均勻，置于30°C的恒溫箱培養(yǎng)7天，進(jìn)行產(chǎn)糖苷酶微生物的富集。
將長(zhǎng)滿霉菌的上述富集物用無(wú)菌水稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，于30°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取形態(tài)和顏色不同的霉菌菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，斜面置于30°C恒溫培養(yǎng)48h，得孢子豐富的斜面菌種。
用接種環(huán)分別挑取上述菌株斜面菌種的孢子，接入50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中Q50mL三角瓶裝)，于30°C、200r/min振蕩條件下發(fā)酵培養(yǎng)4 后，將發(fā)酵液用4層紗布過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入另一只250mL的三角瓶中，加入5g的虎杖粉。三角瓶于30°C、300r/min的水浴振蕩箱中生物轉(zhuǎn)化24h后，三角瓶中轉(zhuǎn)化物用布氏漏斗抽濾，虎杖粉于烘箱中烘干，得經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖。
用薄層色譜法分析經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖中白藜蘆醇含量，由此比較不同菌株所產(chǎn)糖苷酶將虎杖苷為轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的能力大小，經(jīng)過(guò)比較，黑曲霉XW_2(CCTCC No =M 2011358)的能力最高。
所述的平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基的組成相同，按如下組成和方法配制馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，稱取200g，加自來(lái)水IOOOmL煮沸30min，4層紗布濾去除馬鈴薯塊，濾液補(bǔ)足到IOOOmL,再加入葡萄糖20g、NaCl 5g、瓊脂20g，pH自然，加熱至各成分溶化后分裝試管。
所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基按如下組成配制蔗糖40g/L、酵母浸出粉6g/L、K2HPO4 lg/L、 KCl 0. 5g/L, MgSO4 0. 5g/L, FeSO4 0. 05g/L，溶劑為自來(lái)水，pH 6.5。
實(shí)施例2 用于虎杖苷生物轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇糖苷酶的發(fā)酵
以黑曲霉XW-2為產(chǎn)酶菌種，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化后，粗酶液中糖苷酶的活性較實(shí)施例1的活性有大幅度提高，優(yōu)選的制備方法如下
(1)將試管斜面保藏的黑曲霉XW-2菌種接種于斜面培養(yǎng)基，斜面于30°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。所述的斜面培養(yǎng)基按如下組成和方法配制馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，稱取200g，加自來(lái)水IOOOmL煮沸30min，4層紗布濾去馬鈴薯塊，濾液補(bǔ)足到lOOOmL，再加入葡萄糖20g、NaCl 5g、瓊脂20g，pH自然，加熱至各成分溶化后分裝試管。
(2)用接種環(huán)挑去步驟(1)活化培養(yǎng)后黑曲霉XW-2孢子至種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基于3(TC、2(K)r/min振蕩條件下培養(yǎng)48h，得種子液；所述種子培養(yǎng)基按如下組成配制 葡萄糖 60g/L、(MM)2SO4 10g/L, KH2PO4 5g/L, MgSO4 lg/L、溶劑為自來(lái)水，pH 自然；
(3)步驟(2)種子液以5%的體積比接種量接至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，30°C、200r/min振蕩條件下培養(yǎng)48h，得到含糖苷酶的發(fā)酵液；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基按如下組成配制蔗糖40g/ L、NH4Cl 2g/L、K2HPO4 lg/L、KCl 0. 5g/L、MgSO4 0. 5g/L、FeSO4 0. 05g/L，溶劑為自來(lái)水， pH6. 5 7· 5。
(4)將步驟(3)黑曲霉XW-2的發(fā)酵液，用4層紗布紙過(guò)濾除去菌體，所得清液即為糖苷酶粗酶液。
所得糖苷酶粗酶液可以用于生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量，可以立即使用，也可以保藏于4°C冰箱10天內(nèi)使用，也可以經(jīng)過(guò)冷凍干燥后保藏于4°C冰箱長(zhǎng)期保藏使用。
實(shí)施例3 生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量
將市售中藥材虎杖根莖于85°C的烘箱中烘干Mh，用粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)80目篩。 將實(shí)施例2中制備的糖苷酶粗酶液50mL于250mL三角瓶中，加入5g虎杖干粉，三角瓶用保鮮膜封口后，于30°C、300r/min的水浴振蕩箱中生物轉(zhuǎn)化Mh。三角瓶中轉(zhuǎn)化物用布氏漏斗抽濾，虎杖粉于85°C的烘箱中烘干，得經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖。采用高效液相色譜法分析經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理的虎杖中白藜蘆醇含量，達(dá)到了 0. 92% (圖幻，而未經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理虎杖中白藜蘆醇含量為0. 23% (圖幻，可見，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理虎杖中，白藜蘆醇含量提高了 4. 1 倍。
權(quán)利要求
1.黑曲霉(Aspergullisniger) XW-2，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)， 武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號(hào)CCTCC No =M 2011；358，保藏日期2011年10月19日。
2.如權(quán)利要求1所述的黑曲霉XW-2，其特征在于所述黑曲霉XW-2的18srRNA的部分核苷酸序列如下CCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCT TCGGAGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTGGGTGCGGCCCCCGTCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCAGA GAGGGTGAGAATCCCGTCTTGGGCGGGGTGTCCGTGCCCGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAAT GCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATC GAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACT CGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTC AAAGGCCCCTGGAATGTAGTACCCTCCGGGGTACCTTATAGCCAGGGGTGCAATGCGGCCAGCCTGGACCGAGGAAC GCGCTTCGGCACGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAACGAC。
3.如權(quán)利要求1所述的黑曲霉XW-2在微生物發(fā)酵制備糖苷酶中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將黑曲霉XW-2菌種接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25 30°C培養(yǎng)48 72h，獲得含有糖苷酶的發(fā)酵液。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成如下蔗糖40 60g/L、 NH4Cl 2 4g/L、K2HP04 0.5 lg/L、KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 — 0. 05g/L，溶劑為水，pH 6. 5 7. 5。
6.如權(quán)利要求1所述的黑曲霉XW-2在生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將黑曲霉XW-2菌種接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25 30°C培養(yǎng)48 72h，發(fā)酵液經(jīng)固液分離獲得糖苷酶粗酶液，往粗酶液中加入 50 150g/L的虎杖粉，于25 35°C、200 400r/min振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化8 24h后，過(guò)濾除去粗酶液，虎杖粉經(jīng)烘干備用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成如下蔗糖40 60g/L、 NH4Cl 2 4g/L、K2HP04 0.5 lg/L、KCl 0. 3 0. 5g/L、MgS04 0. 3 0. 5g/L、FeS04 0 . 02 — 0. 05g/L，溶劑為水，pH 6. 5 7. 5。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株糖苷酶產(chǎn)生菌株——黑曲霉(Aspergullisniger)XW-2，及其在生物轉(zhuǎn)化法提高虎杖中白藜蘆醇含量中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NoM2011358，保藏日期2011年10月19日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)黑曲霉是發(fā)酵工業(yè)中常用菌種，無(wú)毒無(wú)害，使用安全；(2)黑曲霉XW-2營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、容易培養(yǎng)；(3)黑曲霉XW-2產(chǎn)生的糖苷酶為胞外酶，分離除去菌體后，粗酶液直接作為生物轉(zhuǎn)化體系，虎杖粉碎加入轉(zhuǎn)化后，其中的白藜蘆醇的含量最高可提高4倍；(4)生物轉(zhuǎn)化處理過(guò)的虎杖中無(wú)菌體及其代謝產(chǎn)物殘留，既可作為中藥材使用，也可用于白藜蘆醇的提取制備。
文檔編號(hào)C12N9/24GK102533565SQ20111037476
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者應(yīng)國(guó)清, 梅建鳳, 王瓊芝, 王鴻, 羅溜彬, 許南兒 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)