專利名稱：一種腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法，本發(fā)明涉及一種以親和層析為主要手段的腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法。
背景技術(shù)：
腈水合酶(Nitrilehydratase，簡稱 NHase，EC 4. 2. 1. 84)，是一種催化腈基化合物轉(zhuǎn)變?yōu)轷０坊衔锏慕饘倜浮Ｓ眠@種酶所生產(chǎn)的丙烯酰胺已近百萬噸，占整個(gè)丙烯酰胺產(chǎn)量的三分之一。生物技術(shù)相對于傳統(tǒng)的化學(xué)法有著成本低、能耗少、少污染的優(yōu)勢。目前，在美國、日本、法國等發(fā)達(dá)國家，這項(xiàng)生物技術(shù)正在取代傳統(tǒng)的化學(xué)法。在我國，腈水合酶合成丙烯酰胺的生物技術(shù)雖然起步較晚，但發(fā)展很快，2008年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國生物法生產(chǎn)的丙烯酰胺占整個(gè)丙烯酰胺產(chǎn)量的41%。丙烯酰胺是一種應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)化工原料，在石油開采、造紙、裝潢等方面發(fā)揮著重要的作用。隨著市場的不斷拓展，對丙烯酰胺的需求也在不斷增長。另外這種酶也被應(yīng)用在尼克酰胺的生產(chǎn)上。尼克酰胺是一種B組維生素，以輔酶I及輔酶II的形式參與機(jī)體代謝，在人體和動(dòng)物代謝方面起著十分重要的作用，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品添加劑及飼料生產(chǎn)上。
腈水合酶的廣泛應(yīng)用促使科學(xué)工作者開始研究這種金屬酶的合成機(jī)制和催化機(jī)理。腈水合酶按所含金屬離子的不同分為含鐵和含鈷兩種，按基因結(jié)構(gòu)的不同又可以分為四類。雖然它們催化的是同一類化學(xué)反應(yīng)，這幾類酶的合成模式卻不同，這些不同突出表現(xiàn)在金屬離子攝取方式的不同。其中第一類和第二類腈水合酶中鈷離子的攝取機(jī)理已經(jīng)判明，而第三類還沒有報(bào)道，第四類腈水合酶(含鐵型)的相關(guān)結(jié)論也不明確。阻礙探明第三類鈷離子攝取機(jī)理的關(guān)鍵原因就是該類腈水合酶(以惡臭假單胞菌腈水合酶為代表)調(diào)控蛋白目前尚無成功克隆表達(dá)的方法更無法純化精制。其原因在于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調(diào)控基因序列的ORF部分報(bào)道有誤，而且即使正確識別該調(diào)控蛋白的0RF，該調(diào)控蛋白在SDS-PAGE上也很難檢測到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法，是在SEQ ID NO. 1 前端加SD序列和His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯(lián)，在大腸桿菌BL21中表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白，采用鎳柱分離純化腈水合酶調(diào)控蛋白。
本發(fā)明的具體步驟如下
1)將發(fā)酵液離心收集菌體用磷酸緩沖液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)重懸，超聲破碎G00W，工作5秒，間隔5秒)；
2)將破碎后的粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進(jìn)行透析；
3)將透析后的酶液加入到用磷酸緩沖液A (含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)平衡好的鎳柱Hitrap crude Iml中，用磷酸緩沖液B (含500mmol/L咪唑，pH 7. 5)流速lml/min，梯度洗脫收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應(yīng)出峰的蛋白部分；
4) HPLC檢測腈水合酶酶活；
5)腈水合酶調(diào)控蛋白N端測序。
本發(fā)明所述發(fā)酵液是指出發(fā)菌株為基因工程菌大腸桿菌BL21(含pET_Ma(+)和來源于惡臭假單胞菌I3Seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列，其中調(diào)控蛋白N端加His-tag)。TB發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件37°C培養(yǎng)2 4h使大腸桿菌BL210D值為 0. 6左右，再添加終濃度0. 4mmol/L IPTG 低溫誘導(dǎo)表達(dá)16h。
所述惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列中開放閱讀框序列如SEQ ID NO. 1所示。
本發(fā)明的詳細(xì)的步驟為
(1)將基因工程菌大腸桿菌BL21 (含pET_Ma(+)來源于惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列，其中調(diào)控蛋白N端加His-tag) 發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)條件為37°C培養(yǎng)2 4h使大腸桿菌BL210D值為0. 6左右，再添加終濃度 0. 4mmol/L IPTG 24°C低溫誘導(dǎo)表達(dá) 16h ；
(2)將發(fā)酵液離心收集的菌體用磷酸緩沖液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)重懸，超聲破碎約30min (400W,工作5秒，間隔5秒)；
(3)硫酸銨沉淀
將破碎液加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全溶解。調(diào)節(jié)pH值， 使酶液的PH保持在7. 5，靜置半小時(shí)后IOOOOXg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉淀。 將沉淀溶解在磷酸緩沖液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)中并且4°C透析數(shù)小時(shí)；
⑷鎳柱分離
將透析后的酶液加入到用磷酸緩沖液A (含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)平衡好的鎳柱Hitrap crude Iml中，用磷酸緩沖液B (含500mmol/L咪唑，pH 7. 5)流速lml/min，設(shè)五個(gè)梯度水平洗脫5ml, 8. 3% 5ml, 22% 5ml, 58. 3% 5ml, 100% 5ml)，收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應(yīng)出峰的蛋白部分；
(5) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC檢測條件流動(dòng)相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18 柱；
(6)腈水合酶調(diào)控蛋白N端測序
將表達(dá)出來的蛋白過鎳柱純化后N端測序，測序結(jié)果(見附件圖3)為His-tag對應(yīng)序列，而這個(gè)His-tag是我們?nèi)藶樘砑拥模@就說明該蛋白就是腈水合酶調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步解析腈水合酶金屬離子攝取機(jī)理和改進(jìn)腈水合酶的工業(yè)化生產(chǎn)工藝打下良好的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法，該方法工藝簡單，能得到純度較高的腈水合酶調(diào)控蛋白。


圖1.親和層析色譜圖
圖2.腈水合酶表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖(1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、分離純化的腈水合酶調(diào)控蛋白)。
圖3.腈水合酶調(diào)控蛋白純化后N端測序圖
具體實(shí)施例方式
材料和檢測方法
基因工程菌大腸桿菌BL21 (含pET_Ma(+)和來源于惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列)。
腈水合酶HPLC檢測條件流動(dòng)相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18柱。
實(shí)施例1
基因工程菌大腸桿菌BL21 (含pET_Ma(+)和來源于惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列)，構(gòu)建方法如下
1)從NCBI上下載GenBank號為U89363. 1的序列并且識別SEQ ID NO. 1 ；
2)在調(diào)控蛋白基因序列前加SD序列(AAGGAG)和His-tag序列；
3)將上一步驟中構(gòu)建的序列串聯(lián)在腈水合酶成熟酶下游克隆到pET_Ma(+)，導(dǎo)入大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)；
4) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活。
實(shí)施例2
將大腸桿菌BL21(含pET-Ma(+)和來源于惡臭假單胞菌I^seudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因全序列)按接種量接種到TB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2 4h使大腸桿菌BL210D值為0. 6左右，再添加終濃度0. 4mmol/L IPTG 低溫誘導(dǎo)表達(dá)16h。
實(shí)施例3
(1)將發(fā)酵液離心收集菌體用磷酸緩沖液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)重懸，超聲破碎約30min (400W,工作5秒，間隔5秒)；
(2)硫酸銨沉淀
將破碎液加入硫酸銨粉末，至飽和度為35%，緩慢攪拌使其完全溶解。調(diào)節(jié)pH值， 使酶液的PH保持在7. 5，靜置半小時(shí)后IOOOOXg低溫離心lOmin，低溫離心收集蛋白沉淀。 將沉淀溶解在磷酸緩沖液(含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)中并且4°C透析數(shù)小時(shí)；
(3)鎳柱分離
將透析后的酶液加入到用磷酸緩沖液A (含20mmol/L咪唑，pH 7. 5)平衡好的鎳柱Hitrap crude Iml中，用磷酸緩沖液B (含500mmol/L咪唑，pH 7. 5)流速lml/min，設(shè)五個(gè)梯度水平洗脫5ml,8. 3% 5ml, 22% 5ml, 58. 3% 5ml, 100% 5ml)，收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應(yīng)出峰的蛋白部分；
(4) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC檢測條件流動(dòng)相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18 柱；
(5)腈水合酶調(diào)控蛋白N端測序
將表達(dá)出來的蛋白過鎳柱純化后N端測序，測序結(jié)果(見附件圖3)為His-tag對應(yīng)序列，而這個(gè)His-tag是我們?nèi)藶樘砑拥模@就說明該蛋白就是腈水合酶調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步解析腈水合酶金屬離子攝取機(jī)理和改進(jìn)腈水合酶的工業(yè)化生產(chǎn)工藝打下良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法，是在SEQ ID NO. 1所示序列前端加SD序列和His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯(lián)，在大腸桿菌BL21中表達(dá)腈水合酶調(diào)控蛋白，采用鎳柱分離純化腈水合酶調(diào)控蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌BL21構(gòu)建方法如下1)從NCBI上下載GenBank號為U89363.1的序列并且識別SEQ ID NO. 1 ；2)在調(diào)控蛋白基因序列前加SD序列和His-tag序列；3)將上一步驟中構(gòu)建的序列串聯(lián)在腈水合酶成熟酶下游克隆到pET-Ma(+)，導(dǎo)入大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌BL21的發(fā)酵培養(yǎng)基為 1.2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取物，0.4%甘油，17mM KH2P04,72mM K2HP04。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)條件為 37°C培養(yǎng)2 4h，再添加終濃度0. 4mmol/L IPTG，低溫誘導(dǎo)表達(dá)16h。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鎳柱為Hitrapcrude lmL。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟如下1)將發(fā)酵液離心收集菌體用磷酸緩沖液重懸，超聲破碎；2)將破碎后的粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進(jìn)行透析；3)將透析后的酶液加入到用含咪唑的磷酸緩沖液平衡好的鎳柱Hitrapcrude Iml 中，用含咪唑的磷酸緩沖液梯度洗脫收集咪唑濃度約為250 350mmol/L對應(yīng)出峰的蛋白部分。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述用于洗脫的含咪唑的磷酸緩沖液，流速 lml/min，設(shè)五個(gè)梯度水平洗脫 4. 2% 5ml, 8. 3% 5ml, 22% 5ml, 58. 3% 5ml, 100% 5ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腈水合酶調(diào)控蛋白的分離純化方法，是采用鎳柱分離純化腈水合酶調(diào)控蛋白，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法工藝簡單，能得到純度較高的腈水合酶調(diào)控蛋白。
文檔編號C07K1/30GK102492016SQ201110382079
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者劉義, 周哲敏, 崔文璟 申請人:江南大學(xué)