專利名稱：乙型肝炎病毒突變體、突變擴增試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及乙型肝炎病毒的新突變、突變擴增試劑盒及應用。
背景技術：
目前全球估計有3. 5億慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，有三分之一的人口感染過 HBV0在我國，乙型肝炎是最為嚴重、最廣泛的傳染病之一，感染率高達60%，約有1. 2億人攜帶HBV。乙型肝炎的發病率居傳染病首位，死亡數居傳染病第三位。
根據臨床表現的不同HBV感染可分為多種類型無癥狀攜帶狀態，急性自限性肝炎，慢性肝炎，暴發型肝炎(fulminant h印atitits，FH)。母嬰傳播是HBV的重要傳播途徑，患者通常處于免疫耐受狀態的，對HBV不發生應答，但是往往絕大部分無癥狀攜帶者會發生肝炎，甚至有一部分最終發展為ra。乙型肝炎重癥化的機制一直未明確，目前認為是由宿主免疫和病毒兩方面的作用所致。關于HBV變異和重肝的發生仍存在爭議，尚沒有一個基因變異可以作為重型乙型肝炎的標志性變異。而且大量的研究表明HBV在病人體內時以準種形式存在的，要研究病毒突變與肝炎的關系，必須考慮到HBV的準種特性。目前大多數研究采用的PCR-克隆-測序的方法研究HBV準種。因此，找到與肝炎加重密切相關的基因位點，將會為HBV的臨床早期診斷和干預提供幫助。發明內容
本發明的目的在于提供與肝炎加重密切相關的乙肝病毒突變體，突變擴增試劑盒，及應用，為HBV的臨床早期診斷和干預提供幫助。
本發明一方面公開了一種乙型肝炎病毒(簡稱乙肝病毒或HBV)突變體，包括乙肝病毒基因組，所述乙型肝炎病毒突變體的突變發生在乙型肝炎病毒基因組序列第216位和 /或第285位，所述第216位發生的突變為堿基T突變為C (216T — C)，所述第285位發生的突變為堿基G突變為A (285G — A)。
較優的，所述乙型肝炎病毒基因組的核苷酸序列選自SEQ ID NO =USEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO :11ο
進一步的，所述乙肝病毒突變體HBV基因組序列的互補序列上，與基因組第216位對應位點的突變為A突變為G，與基因組第285位對應位點的突變為C突變為Τ。
較優的，所述乙型肝炎病毒突變體編碼的S蛋白與正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位發生突變，第21位氨基酸的突變是由亮氨酸(L)突變為絲氨酸(S)，第44位氨基酸的突變是由甘氨酸(G)突變為谷氨酸(E)。
更優的，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :12。
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLR
RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLffVY I(SEQ IDNO 12)本發明第二方面公開了一種擴增乙肝病毒基因組序列第216位和觀5位基因片段的HBV突變擴增試劑盒，包括引物、dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶、ddH20，所述引物包括上游引物和下游引物，所述引物特異性擴增包括乙肝病毒基因組序列第216位和第285位的基因片段。較優的，所述DAN聚合酶為高保真DNA聚合酶；更優的，所述高保真DNA聚合酶為 Prime Star。較優的，PCR緩沖溶液為 5 XPrime Star buffer。較優的，所述上游引物和下游引物序列如下
引物序列
上游弓丨物 5，-ggagcgggagcattcgg-3 ‘(SEQ IDΝ0:8)下游弓丨物 5，_ataaaacgccgcagasacatccagc3，(SEQ IDΝ0:9)
本發明試劑盒PCR體系如下
權利要求
1.一種乙型肝炎病毒突變體，包括乙肝病毒基因組，所述乙型肝炎病毒突變體的突變發生在乙型肝炎病毒基因組序列第216位和/或第285位，所述第216位發生的突變為堿基T突變為C，所述第285位發生的突變為堿基G突變為A。
2.如權利要求1所述的乙型肝炎病毒突變體，其特征在于，所述乙型肝炎病毒基因組的核苷酸序列選自 SEQ ID NO =USEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11。
3.如權利要求1所述的乙型肝炎病毒突變體，其特征在于，所述乙型肝炎病毒突變體編碼的S蛋白與正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位發生突變，第21位氨基酸的突變是由亮氨酸突變為絲氨酸，第44位氨基酸的突變是由甘氨酸突變為谷氨酸。
4.如權利要求3所述的乙型肝炎病毒突變體，其特征在于，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO 12。
5.一種擴增乙肝病毒基因組序列第216位和觀5位基因片段的HBV突變擴增試劑盒， 包括引物、dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶、ddH20，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述引物特異性擴增包括乙肝病毒基因組序列第216位和第285位的基因片段。
6.如權利要求5所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述引物序列為SEQID NO 8 9。
7.如權利要求5所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為高保真 DNA聚合酶。
8.如權利要求7所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶為 PrimeStar0
9.如權利要求5所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖溶液為 5XPrimeStar buffer。
10.如權利要求5-9任一權利要求所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的擴增程序為預變性 94°C 3min，然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 個循環，72°C延伸 IOmin0
11.權利要求5-10任一權利要求所述的試劑盒的使用方法，步驟如下DDNA模板的制備抽取外周靜脈血并提取HBV基因組作為DNA模板；2)PCR擴增通過權利要求5-10任一權利要求所述HBV突變擴增試劑盒，對步驟1)制備的DNA模板經擴增程序進行PCR擴增反應；3)純化PCR產物。
12.如權利要求11所述的使用方法，其特征在于，所述擴增程序為預變性94°C3min, 然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 個循環，72°C延伸 lOmin。
13.如權利要求1-4任一權利要求所述的乙型肝炎病毒突變體或權利要求5-10任一權利要求所述的HBV突變擴增試劑盒在制備重癥乙型肝炎疾病早期診斷及預防試劑中的應用。
14.一種重癥乙型肝炎疾病早期診斷及預防的方法，為檢測對象血液中是否含有權利要求1-4任一權利要求所述的乙型肝炎病毒突變體。
15.如權利要求14所述重癥乙型肝炎疾病早期診斷及預防的方法，所述檢測對象血液中是否含有所述乙型肝炎病毒突變體的步驟如下DDNA模板的制備抽取檢驗對象外周靜脈血并提取HBV基因組作為DNA模板；2)PCR擴增將步驟1)制備的DNA模板加入到PCR反應體系中，擴增包括乙肝病毒基因組序列第216位和第285位的基因片段；3)純化PCR產物；4)PCR產物測序將步驟幻純化獲得的PCR產物通過基因測序技術進行測序；5)結果分析將步驟4)的測序結果與SEQID NO :1、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11 的序列進行比對，確認PCR產物對應的乙肝病毒基因組序列第216位和/或285位是否存在突變。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的PCR反應體系包括引物、 dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶、ddH20 ；所述引物包括上游引物和下游引物。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述引物序列為SEQID NO :8 9。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為I^rimeStar,所述PCR 緩沖溶液為 5Xft~ime Star buffer
19.如權利要求15所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述PCR反應體系的擴增程序為預變性 94°C 3min，然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 個循環，72°C延伸 IOmin0
20.如權利要求15所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述的基因測序技術為sanger 測序技術或solexa測序技術。
21.如權利要求15所述的方法，其特征在于，步驟5)中所述的PCR產物對應的乙肝病毒基因組序列第216位發生的突變為堿基T突變為C，所述的PCR產物對應的乙肝病毒基因組序列第285位發生的突變為堿基G突變為A。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種乙型肝炎病毒突變體、突變擴增試劑盒及應用。本發明的HBV突變體在乙型肝炎病毒基因組序列第216位和/或第285位發生突變，所述第216位發生的突變為堿基T突變為C，所述第285位發生的突變為堿基G突變為A。這兩個突變與乙型肝炎炎癥加重密切相關。本發明還提供了檢測前述突變的HBV突變擴增試劑盒、試劑盒的使用方法及應用，從而為重型乙肝的臨床早期診斷和干預提供幫助，為深入研究HBV基因突變引起的功能改變提供參考依據。
文檔編號C12Q1/68GK102492660SQ20111038473
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者徐航娣, 樓園華, 陳智 申請人:浙江大學