專利名稱：一種腫瘤抗原特異性t細(xì)胞的獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生和擴(kuò)增方法，特別涉及腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的生產(chǎn)和擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
體外生成和擴(kuò)增具有辨認(rèn)各種抗原能力的T細(xì)胞已成功地用于治療惡性腫瘤和病毒感染性疾病。這種特異性過繼免疫治療策略的誘人之處在于它能誘導(dǎo)只針對疾病細(xì)胞的特異性免疫效應(yīng)，而不傷及正常細(xì)胞，無副作用。因此，常規(guī)、可重復(fù)的體外擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞的方法是實(shí)現(xiàn)腫瘤過繼免疫治療的關(guān)鍵。如今，體外培養(yǎng)產(chǎn)生有腫瘤治療效果的抗原特異性T細(xì)胞技術(shù)還遠(yuǎn)未成熟，需要進(jìn)一步完善，在提高其抗腫瘤功能的同時(shí)簡化抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)出程序，使其得到廣泛應(yīng)用。目前擴(kuò)增T細(xì)胞的方法主要依靠人類白細(xì)胞相容抗原(MHC)配對的抗原提呈細(xì)胞 (APC)和外源性生長因子，如白介素2 (IL-2)聯(lián)合⑶3抗體用于刺激T細(xì)胞分裂，擴(kuò)增的T細(xì)胞主要是CD8陽性T細(xì)胞亞群。然而，由于APC存活期相當(dāng)短，長期培養(yǎng)T細(xì)胞時(shí)要不斷收集和補(bǔ)充死亡的APC。當(dāng)疾病影響到免疫系統(tǒng)，如免疫缺陷，病毒感染等，APC的來源更是無法解決。另外，獲得臨床治療量的抗原特異性T細(xì)胞往往需要在培養(yǎng)過程中多次活化和擴(kuò)增，需投入大量人力，既耗時(shí)，成本又高，且重復(fù)性差，又難標(biāo)準(zhǔn)化。因此，改進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增方法是非常必要的。在改善抗原特異性T細(xì)胞的抗腫瘤功能的同時(shí)簡化抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)出程序無論是提高臨床治療的效果還是細(xì)胞產(chǎn)出的標(biāo)準(zhǔn)化都具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種能產(chǎn)生大量反應(yīng)性極高的抗原特異性T細(xì)胞的方法，獲得的T細(xì)胞無論是細(xì)胞表面受體表達(dá)還是細(xì)胞因子的分泌都是現(xiàn)有其它培養(yǎng)系統(tǒng)無法比擬的。用此方法無需知道特殊抗原(當(dāng)然已知的抗原也可以應(yīng)用)，經(jīng)1-2次擴(kuò)增就能達(dá)到治療量，包含⑶4和⑶8系列的抗原特異性T細(xì)胞，而且可以根據(jù)需要分選⑶4或⑶8細(xì)胞。鑒于此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，包括產(chǎn)生和擴(kuò)增方法，所述產(chǎn)生方法是將含有抗原提呈細(xì)胞(APC)的第一群細(xì)胞與包被有抗原的界面接觸，讓APC攝取包被在界面上的抗原；再將含有T細(xì)胞的第二群細(xì)胞與攝取了抗原的第一群細(xì)胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞?？梢圆捎貌煌姆椒ㄇ擅畹匕芽乖?、黏附、偶聯(lián)或結(jié)合到某些物體的表面，例如交叉鏈接，也可以通過共價(jià)或非共價(jià)，靜電或疏水基團(tuán)結(jié)合的方式，或利用各種黏附方法來完成，包括化學(xué)，力學(xué)，酶學(xué)，靜電等方法，最終目的是讓這些包被有抗原的界面能刺激T細(xì)胞。例如，通過抗生物素蛋白或鏈霉親和素使抗體與生物素化的抗原在界面結(jié)合；抗體與配體通過特異性結(jié)合到界面。另一種辦法是用其它非特異性抗體結(jié)合分子，如A蛋白或G蛋白包被的界面結(jié)合抗體?；瘜W(xué)交叉偶聯(lián)法包被抗原可用Pierce, Rockford III或其它方法,抗原也可以共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)合到界面。另外一種方法是用甲苯磺?；せ畹幕颦h(huán)氧樹脂結(jié)合的DYNABEAD 按廠家的操作步驟與多肽抗原，在磷酸緩沖液的PH 4-9. 5之間，溫度4-37°C之間共培養(yǎng)。進(jìn)一步地，所述APC直接與抗原特異性T細(xì)胞接觸，與抗原特異性T細(xì)胞直接接觸的APC是用磁場分離。進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增方法是將抗原特異性T細(xì)胞植入包被有第一試劑的培養(yǎng)界面擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)入包被有第二試劑的培養(yǎng)界面；所述第一試劑和第二試劑是相同或者不同的抗體或抗體片段；所述界面為磁珠、脂質(zhì)或細(xì)胞。抗原特異性T細(xì)胞先和包被有第一試劑的界面培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入包被有第二試劑的培養(yǎng)界面，目的是讓T細(xì)胞表面相應(yīng)部位與不同試劑結(jié)合，促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的分蘗(擴(kuò)增)。進(jìn)一步地，界面的空間與T細(xì)胞的比例選擇I :2，1 :2. 5,1 :5，I :25，I :50，I :75， I 100。需要說明的是，上述界面的空間與T細(xì)胞的比例是優(yōu)選方案，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，界面的空間與T細(xì)胞的比例介于I :2至I :100均可以選擇的。所述第一試劑是⑶3或⑶2抗體或其片段，所述第二試劑用⑶28抗體或其片段。⑶3抗體與⑶28抗體的比例為I :1至I :100?？乖禺愋訲細(xì)胞可以用針對T細(xì)胞活化標(biāo)記的抗體分離，可供選擇的抗體還包括CD25，CD54，CD69，CD38，CD45R0，CD49d，CD40L，CD137，CD62L 以及 CD134 等抗體。T細(xì)胞的擴(kuò)增時(shí)加入促細(xì)胞分裂素、白介素15、天然⑶137蛋白、⑶137抗體、NKG2D抗體或/和天然NKG2D蛋白。優(yōu)選地，所述促細(xì)胞分裂素選用植物血球凝集素(PHA)，豆蘧酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)和離子素，脂多糖(LPS)，以及超級抗原。所述抗原為抗體/抗原復(fù)合物、腫瘤或病毒感染的細(xì)胞、固定的腫瘤或病毒感染的細(xì)胞、高溫滅活的腫瘤或病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物、不溶解的細(xì)胞碎片、細(xì)胞凋亡體、壞死細(xì)胞、滅活的腫瘤細(xì)胞、放射滅活的異體細(xì)胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的細(xì)胞。對于蛋白類，糖蛋白類，多肽這些抗原亦可用于本發(fā)明所述的方法?？乖墨@取方法有非轉(zhuǎn)化細(xì)胞用3000-3600rad強(qiáng)度的Y射線照射；淋巴母細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞用6000-10000rad強(qiáng)度的、射線照射；用理化或生物學(xué)的方法獲得壞死和凋亡細(xì)胞，如用凍-溶的方法獲得壞死細(xì)胞，而用紫外線照射的方法獲得凋亡細(xì)胞。APC來源于外周血單個(gè)核細(xì)胞采集，淋巴結(jié)，扁桃體，活檢組織，腫瘤組織，脾臟，骨髓，臍血，⑶34+細(xì)胞或單核細(xì)胞。優(yōu)選地，APC來源于⑶34+細(xì)胞。抗原是通過抗體/配體的相互作用吸附或者通過化學(xué)反應(yīng)的方法包被到載體的界面上。選擇的抗體與相對應(yīng)的配體有MARTl抗體/MARTI，WT-I抗體/WT_1，PRl抗體/PRl, PR3抗體/PR3，絡(luò)氨酸酶抗體/絡(luò)氨酸酶，MAGE-I抗體/MAGE-1，MUC-I抗體/MUC-1，甲胎蛋白抗體/甲胎蛋白，Her2Neu抗體/Her2Neu, HIVgpl20抗體/HIVgpl20,流感HA抗體/流感HA抗原，CMVpp65抗體/CMVpp65，C型肝炎病毒抗體/C型肝炎病毒蛋白，EB病毒EBNA 3B抗體/EB病毒EBNA 3B抗原，以及人免疫球蛋白重鏈和輕鏈抗體/來自骨髓瘤或慢性淋巴細(xì)胞性白血病患者的免疫球蛋白。用化學(xué)的方法把抗原黏附到界面上，如利用生物素-親和素的作用。
利用上述方法獲得的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞，與哺乳類癌細(xì)胞接觸，能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長。這些腫瘤細(xì)胞有黑色素瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏病，白血病，漿細(xì)胞瘤，肉瘤，膠質(zhì)瘤，胸腺瘤，乳腺癌，前列腺癌，結(jié)腸直腸癌，腎細(xì)胞癌，胰腺癌，食道癌，腦癌，肺癌，卵巢癌，宮頸癌，多發(fā)性骨髓瘤，肝癌，急性淋巴母細(xì)胞性白血病，急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，以及慢性淋巴細(xì)胞性白血病。相關(guān)術(shù)語解釋。術(shù)語“生物兼容”指的是對活細(xì)胞無明顯毒性作用的特征。術(shù)語“刺激”指的是細(xì)胞表面的某些部位連接后的第一反應(yīng)。例如，就受體而言，“刺激”需要細(xì)胞表面的受體與相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)連接來完成。有關(guān)T細(xì)胞的刺激，這樣的刺激在一種情況下指的是T細(xì)胞表面部位的連接誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生，例如TCR/CD3復(fù)合物的形成。刺激的發(fā)生可能激活一個(gè)細(xì)胞上調(diào)或下調(diào)一個(gè)分子的表達(dá)或分泌，例如，下調(diào)TGF-β。因此，細(xì)胞表面某些部位的連接，即使沒有直接的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生，也可能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重組，提高、調(diào)節(jié)或改變后續(xù)的細(xì)胞反應(yīng)。 術(shù)語“活化”指的是細(xì)胞表面部位充分連接導(dǎo)致明顯的生化或形態(tài)改變的狀態(tài)。T細(xì)胞而言，這樣的活化指的是T細(xì)胞充分刺激后導(dǎo)致細(xì)胞增殖的狀態(tài)。T細(xì)胞活化也可能誘導(dǎo)合成細(xì)胞因子，產(chǎn)生調(diào)節(jié)或溶解細(xì)胞效應(yīng)。對其它細(xì)胞而言，這個(gè)術(shù)語有上調(diào)或下調(diào)一個(gè)特定的理-化作用的意思。術(shù)語“靶細(xì)胞”在這里指的是受到刺激的細(xì)胞。術(shù)語“抗體”包括單克隆和多克隆抗體；人源化，鼠源，鼠-人，鼠-靈長類和嵌合抗體；可以是完整的分子或片段(如sCFv，F(xiàn)v，F(xiàn)d，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab’以及F(ab)’ sub. 2片段)，或是多聚體，聚合物；通過免疫，合成或基因工程的方法獲得?！翱贵w片段”指的是相應(yīng)抗體的衍生物，分子小，能結(jié)合相應(yīng)抗原，易于攝取和清除(例如，與半乳糖殘?jiān)Y(jié)合)。它們包括F(ab)，F(xiàn)(ab)，sub2，scFv，輕鏈易變區(qū)(V. sub. L)，重鏈易變區(qū)(V. sub. H)以及它們的結(jié)合。術(shù)語“蛋白”指的是蛋白，多肽和肽；可以是完整的氨基酸序列，片段或多聚體或完整分子與片段的混合。可以是天然的或通過合成(化學(xué)和/或酶聯(lián))或基因工程獲得。術(shù)語“試劑”，“配體”，或“與細(xì)胞表面結(jié)合的試劑”指的是與限定細(xì)胞結(jié)合的一種分子。試劑可能可以結(jié)合到任何細(xì)胞的表面，如一種受體，一種抗原決定族，或靶細(xì)胞的其它結(jié)合部位。試劑可以是蛋白，肽，抗體和抗體片段，融合蛋白，合成的分子，一種有機(jī)分子(如小分子)等。T細(xì)胞刺激中用規(guī)范的抗體。術(shù)語“與細(xì)胞表面結(jié)合的試劑”和“細(xì)胞表面結(jié)合部位”指的是一對抗體與相對應(yīng)的配體。它們應(yīng)該是互補(bǔ)的、特異性結(jié)合，通常有相當(dāng)高的親和力(親和力常數(shù)，Ka大約是106L/mol 或更高)。術(shù)語“抗原提呈細(xì)胞(APC)”指的是正常情況下使原始和/或T細(xì)胞對抗原作出反應(yīng)的啟動(dòng)細(xì)胞。在這個(gè)意義上，指所有能提呈抗原的細(xì)胞。APC除了樹突狀細(xì)胞,單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，還包括人造抗原提呈細(xì)胞，APC高表達(dá)MHC II型分子，ICAM-I和B7-2分子。術(shù)語“共刺激信號(hào)”指的是與第一信號(hào)，如TCR/CD3結(jié)合，相互作用，導(dǎo)致T細(xì)胞增
殖的信號(hào)。術(shù)語“配體抗體/配體”指的是一對互補(bǔ)的，具特異性結(jié)合的，通常有相當(dāng)高的親和力(親和力常數(shù)，Ka至少IO6LAiol)的分子。分子間的親和力是相對的，視選用的對子有高有低，例如，生物素/鏈酶親和素，鏈酶親和素的結(jié)合率與單體生物素相當(dāng)，而它的解離率只有單體生物素的1/7。酶/酶抑制劑，半抗原/抗體，植物凝血素/碳水化合物，受體/配體以及生物素/抗生物素蛋白或鏈酶親和素都是配體/抗配體對子。此發(fā)明內(nèi)，受體以及其它的細(xì)胞表位是配體抗體，而與其作用的試劑，如抗體和抗體片段被認(rèn)為是配體。術(shù)語“分離”指的是用任何方法，如過濾，磁場，提純一種細(xì)胞成分。術(shù)語“靜息”指的是處于無增殖狀態(tài)的細(xì)胞。術(shù)語“界面”指的是結(jié)合了試劑的表面，材料可以是金屬，玻璃，塑料，共聚合體，膠體，脂質(zhì)，細(xì)胞表面以及類似物。這些表面必須是可以維持試劑黏附。此發(fā)明內(nèi)這種表面的典型例子是一種顆粒。因此，術(shù)語“界面”與“顆?！笔强梢曰Q的。術(shù)語“免疫反應(yīng)或反應(yīng)”指的是免疫細(xì)胞(包括但不限于T細(xì)胞)的活化,誘導(dǎo)產(chǎn)生特殊的效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞的功能包括，但不限于，增殖，分泌細(xì)胞因子，分泌抗體，調(diào)節(jié)和 /或黏附分子的表達(dá)以及溶解細(xì)胞的能力。術(shù)語“刺激免疫反應(yīng)”指的是任何能活化、誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞功能的刺激。術(shù)語“免疫反應(yīng)異?！敝傅氖敲庖呒?xì)胞異常的活化和/或增殖或缺乏，和/或異常分泌或缺乏細(xì)胞因子，和/或免疫系統(tǒng)其它細(xì)胞的異常誘導(dǎo)或不足，如調(diào)節(jié)，黏附和/或歸源受體的表達(dá)，以及誘導(dǎo)細(xì)胞溶解。術(shù)語“防止”或“抑制”一種癌或癌細(xì)胞的發(fā)展指的是預(yù)防癌癥的發(fā)生或延緩癌癥復(fù)發(fā)。術(shù)語“治療”或“減少癌或癌細(xì)胞的出現(xiàn)”指的是用腫瘤體積或惡性細(xì)胞的數(shù)量反應(yīng)癌生長的方法。腫瘤體積用已知的不同方法測量，例如，用帶表卡尺測定腫塊的兩個(gè)長徑,計(jì)算腫瘤大小。術(shù)語“預(yù)防或抑制感染性疾病的發(fā)生”指的是防止感染性疾病的發(fā)生或延緩感染性疾病的發(fā)作，或逆轉(zhuǎn)感染性疾病的擴(kuò)散。術(shù)語“改善”指的是使好轉(zhuǎn)。術(shù)語“顆粒”指的是膠質(zhì)顆粒，微球，納米顆粒，微粒等。一般情況，可以用市場提供的微?；蚱渌w粒，提供這些顆粒表面的公司有Miltenyi Biotec, Germany;PharmaciaFine Chemicals, Sweden;Dynal Inc.，Oslo, Norway;Prometic Biosciences;ImmuniconjHuntingdon Valley, Pa. USAjBangs Laboratories，Inc.，F(xiàn)ishers，Ind. USA。 術(shù)語“常磁性顆粒”指的是能在磁場內(nèi)聚集的磁性顆粒。術(shù)語“抗原”指的是任何分子I)能被特異性的單克隆抗體或衍生物辨識(shí)，并在其特定分子區(qū)域(抗原結(jié)合區(qū))結(jié)合；2)結(jié)合MHC的相關(guān)多肽序列能特異性地與同源T細(xì)胞抗原受體結(jié)合。術(shù)語APC “加載”抗原指的是APC與抗原或抗原肽接觸一段時(shí)間，APC攝取，處理抗原并結(jié)合MHC分子后提呈抗原給T細(xì)胞。一些情況下，抗原，特別是抗原肽，結(jié)合MHC分子后直接提呈給T細(xì)胞，無需APC的參與。術(shù)語“動(dòng)物”或“哺乳動(dòng)物”指的是全部的哺乳類，包括人。這個(gè)專利申請中，更多的是指人體。術(shù)語“接觸”指的是使進(jìn)入立即或直接的接觸狀態(tài)。
術(shù)語“溶解產(chǎn)物”指的是細(xì)胞溶解后的上清液和不溶解的細(xì)胞碎片。有多種細(xì)胞溶解方法和溶解液可供選用(參考Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, New York. N. Y.)。溶解細(xì)胞也可以用凍-溶的方法或其它方法，如超聲降解。術(shù)語“凋亡小體”指的是來自凋亡細(xì)胞的，有完整包膜的小片段。術(shù)語“增殖”指的是新細(xì)胞的倍數(shù)增長。術(shù)語“感染性疾病”指的是由感染性微生物引發(fā)的疾病。感染性微生物包括病毒類有RNA病毒，DNA病毒,人類免疫缺陷病毒(HIV), A, B, C型肝炎病毒,單純皰疫病毒(HSV)，巨細(xì)胞病毒(CMV)，埃-巴病毒(EBV)，人類乳頭狀病毒(HPV);寄生蟲包括原生和后生病原體，如瘧原蟲，利什曼蟲，血吸蟲，錐蟲；細(xì)菌主要是分支桿菌屬,如結(jié)核桿菌,沙門氏菌，鏈球菌，大腸桿菌，葡萄球菌；霉菌包括假絲酵母菌，曲霉菌；以及肺囊蟲和朊病毒(傳 染性瘋牛病的病原體，侵犯牛羊的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致海綿狀腦病)。已知4種朊病毒可傳染人I)苦魯?。?)疫攣性假硬化；3) Gerstmann-Straussler-Scheinker 病(GSS) ；4)致命性家族性失眠癥。這里包括全部由朊病毒引起的疾病。


圖I⑶8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)中央記憶性T細(xì)胞標(biāo)記。(A)未培養(yǎng)的⑶4+和⑶8+淋巴細(xì)胞的記憶性標(biāo)記表達(dá)；(B)培養(yǎng)后的抗原特異性⑶4+和⑶8+淋巴細(xì)胞的記憶性標(biāo)記表達(dá)。圖2腫瘤抗原特異性T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的體外殺傷作用。(A)腫瘤細(xì)胞CNE，PANC-I和QGY-7701培養(yǎng)24小時(shí)后的觀察(上圖)，加入未培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞24小時(shí)后的觀察(下圖)(B)腫瘤細(xì)胞CNE，PANC-I和QGY-7701培養(yǎng)24小時(shí)后的觀察(上圖)，加入抗原特異性T淋巴細(xì)胞24小時(shí)后的觀察(下圖)。圖3利用本發(fā)明所述方法獲得的特異性T細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌病人治療前后的EGFR特異性T細(xì)胞的觀察。圖4利用本發(fā)明所述方法獲得的特異性T細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌病人治療前后的X光胸側(cè)位片的觀察。圖5利用本發(fā)明所述方法獲得的特異性T細(xì)胞對非小細(xì)胞肺癌病人細(xì)胞治療后的血漿CEA水平的觀察。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖進(jìn)行說明。I、T細(xì)胞的來源T細(xì)胞來源是多方面的，包括自體或異體的外周血單個(gè)核細(xì)胞，骨髓，胸腺，活檢組織，腫瘤，淋巴結(jié)組織，臨近淋巴組織的黏膜，脾臟或任何其它淋巴組織。T細(xì)胞也有來自異種，如小鼠，大鼠，非人類靈長目動(dòng)物和豬。外周血淋巴細(xì)胞最好通過單項(xiàng)采集獲得。單項(xiàng)采集獲得的細(xì)胞包含T細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞和其它一些有核白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板?？梢酝ㄟ^洗滌、分離去除血漿成分，然后置入適當(dāng)?shù)木彌_液，如磷酸緩沖鹽水(PBS)備用。有時(shí)用去除二價(jià)離子，如鈣鎂的洗滌液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)可以選擇不同的方法分離淋巴細(xì)胞，例如用半自動(dòng)流通離心機(jī)，按產(chǎn)家的操作步驟分離(Cobe 2991cell processor,Baxter)。洗漆后的細(xì)胞懸浮于生物相容性緩沖液，如去Ca++和Mg++的PBS。或者，去除不需要的成分后把細(xì)胞直接懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)液。另外一種方法是通過紅細(xì)胞裂解和PERC0LL 梯度離心從外周血提取T細(xì)胞。特殊的T細(xì)胞亞群，如⑶28+，⑶4+，⑶8+，⑶45RA+，⑶45R0+的T細(xì)胞，可以用不同技術(shù)分選，例如，⑶3+，⑶28+的T細(xì)胞可以用⑶3/⑶28接合的磁珠(DYNABEADS)做陽性分選。也可以針對細(xì)胞表面某些特殊標(biāo)記，利用聯(lián)合抗體陰性分選達(dá)到提高某種T細(xì)胞亞群數(shù)量的目的。最好的方法是利用針對細(xì)胞表面標(biāo)記的混合單克隆抗體，用免疫磁附技術(shù)或流式細(xì)胞技術(shù)陰性分選所需的T細(xì)胞，例如，陰性分選⑶4+細(xì)胞通常選擇⑶14，⑶20，⑶11b，⑶16，HLA-DR和⑶8混合單克隆抗體。備制T細(xì)胞也可以用洗滌后凍存的方法，不需要另外步驟去除單核細(xì)胞，因?yàn)榻?jīng)凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞基本可以除去粒細(xì)胞和部分單核細(xì)胞。洗滌去除血漿和血小板后，把細(xì)胞懸浮于凍存液。凍存液是用培養(yǎng)液I :1稀釋的含20%DMS0和8%人血清白蛋白(HSA)的PBS, DMSO和HSA的終末溶度分別是10%和4%。細(xì)胞以每分鐘下降1° C的凍存速率下降 至-80° C后儲(chǔ)存在液氮罐內(nèi)的蒸發(fā)相。2、抗原提呈細(xì)胞(APC)的來源組織來源的抗原提呈細(xì)胞(APC)或APC前體細(xì)胞在抗原和/或必須的細(xì)胞因子的環(huán)境中能增殖和成熟成為專職抗原提呈細(xì)胞(PAPC)。術(shù)語“專職抗原提呈細(xì)胞”或“抗原提呈細(xì)胞”指的是正常情況下使原始和/或記憶性T細(xì)胞對抗原作出反應(yīng)的啟動(dòng)細(xì)胞。pAPC包括，但不限于，樹突狀細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞以及人造抗原提呈細(xì)胞。pAPC高表達(dá)MHCII型分子，ICAM-I和B7-2分子。APC前體細(xì)胞在體外培養(yǎng)成為成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)0 APC可以來自很多組織，如脾，胸腺，活檢組織，腫瘤組織，淋巴結(jié)，輸入淋巴，骨髓，夕卜周血。外周血和骨髓是首選來源。含有豐富生長因子的胚胎組織和臍帶血都是APC和/或APC前體細(xì)胞的來源。優(yōu)秀的前體細(xì)胞可能是胚胎干細(xì)胞，CD34+細(xì)胞，單核細(xì)胞祖細(xì)胞和B細(xì)胞的祖細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選使用APC從單核細(xì)胞或CD34+細(xì)胞的前體細(xì)胞獲得。APC和/或APC前體來源于外周血白細(xì)胞采集。單項(xiàng)細(xì)胞采集技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(參考Bishop et al.，Blood, Vol. 83，No. 2，pp. 610-616，1994)例如，用 HaemoneticsModel V50細(xì)胞單米機(jī)(Haemonetics, Braintree, Mass. USA)。米集的淋巴細(xì)胞包含T細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞，B細(xì)胞以及其他有核白細(xì)胞，紅細(xì)胞和血小板。經(jīng)洗滌去除血漿，把細(xì)胞懸浮于適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)液備用。洗滌液用沒有二價(jià)離子的溶液。洗滌步驟按本領(lǐng)域技術(shù)員熟知的方法進(jìn)行。例如用半自動(dòng)流通離心機(jī)，按廠家的操作步驟分離(Cobe 2991 cellprocessor, Baxter)。洗漆后的細(xì)胞可再懸浮于不同的生物相容性緩沖液中，如去Ca++和Mg++的PBS。或者，去除不需要的成分后把細(xì)胞直接懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)液。如果APC來自全血，用常規(guī)的方法提取APC。血液用無抗凝劑的RPMI培養(yǎng)液以體積I :1稀釋，混勻，分裝到50毫升已加了 12. 5ml淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)的離心管中。700G，室溫離心20分鐘。提取白膜細(xì)胞層加入裝有RPMI1640的離心管中。其它用于細(xì)胞培養(yǎng)的溶液也可以用來分離淋巴細(xì)胞，如PBS，Hanks緩沖液，或含細(xì)胞生長因子的培養(yǎng)液，如 DMEM，MEM，HAMS F-12，X_Vivol5，X_Vivo20。APC 和 / 或 APC 前體細(xì)胞還可以用 BeckmanJ6ME離心設(shè)備配備J5. O轉(zhuǎn)子和40ml凈化腔純化。另一種分離APC和/或APC前體細(xì)胞的方法是全血或單采的細(xì)胞與結(jié)合了抗體的順磁磁珠(4xl09磁珠大約可用于5xl08到2Χ1(Γ細(xì)胞)在22-37° C條件下孵育大約30分鐘到2小時(shí)，然后在磁場中去除與磁珠結(jié)合的細(xì)胞。整個(gè)過程可以按照廠家提供的操作步驟來完成，如DYNAL. RTM. Magnetic Particle Concentrator。提取出來的細(xì)胞質(zhì)量可用這個(gè)領(lǐng)域的已知技術(shù)鑒定，包括細(xì)胞分離前后流式細(xì)胞分析技術(shù)。組織來源的APC通過細(xì)胞原代培養(yǎng)獲得。本發(fā)明對此作出如下改進(jìn)培養(yǎng)基中通常加入1-2種細(xì)胞因子，如人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞生長因子和人白介素-4，在組織相容培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，如各種培養(yǎng)袋(Lifecell culture bags)，培養(yǎng)瓶，多孔培養(yǎng)板，皮氏培養(yǎng)平皿等。表面用膠原或poly-L-lysine處理，促進(jìn)細(xì)胞貼壁。一些特殊細(xì)胞類型需要特異性抗體協(xié)助。培養(yǎng)皿也可用化學(xué)處理的方法，如離子化。植入細(xì)胞密度大約105_7/cm2。優(yōu)選地，原代細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)直到可以把貼壁和非貼壁細(xì)胞分開為止。血液中一些未成熟的APC，特別是未成熟的DC細(xì)胞，開始是不貼壁的，單核細(xì)胞則 相反，因此，24小時(shí)內(nèi)就能把前體細(xì)胞分離。一般認(rèn)為大多數(shù)貼壁細(xì)胞是單核細(xì)胞和纖維母細(xì)胞，通常在培養(yǎng)30分鐘到24小時(shí)內(nèi)貼壁。非貼壁細(xì)胞一般在1-16小時(shí)就可以從貼壁細(xì)胞中分離出來。分離非貼壁細(xì)胞時(shí)，無論用震蕩還是用移液的方法，注意維持貼壁細(xì)胞的貼壁狀態(tài)，盡量不要把太多的貼壁細(xì)胞混入非貼壁細(xì)胞。通常選用移液的方法。把分離的包含APC前體細(xì)胞的貼壁細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)成未成熟APC，依本發(fā)明，一般需要4小時(shí)到7天時(shí)間。這里用的術(shù)語“未成熟APC”指的是APC向成熟分化的一個(gè)中間狀態(tài)，在這個(gè)狀態(tài)的APC具有內(nèi)吞或吞噬抗原，異物，壞死和/或凋亡組織和/或細(xì)胞的功能。視前體細(xì)胞的來源，未成熟APC可以是CD14+或CD14-細(xì)胞。它也可以表達(dá)⑶la，⑶40，⑶86，⑶54以及中度水平的MHC II型分子(用流式細(xì)胞分析技術(shù)與MHCII型分子表達(dá)陽性/陰性的細(xì)胞對比)。典型的未成熟APC不表達(dá)CCR7。其實(shí)，T細(xì)胞沒有必要從APC中分離出來。例如，包含APC和T細(xì)胞的PBMC如描述的那樣與抗原接觸，獲得的抗原特異性T細(xì)胞再按本發(fā)明的方法進(jìn)一步擴(kuò)增。 這里描述的APC或T細(xì)胞并不一定都要來自自體，也可以來自配對或不配對的異體供者，細(xì)胞系，或其它體外培養(yǎng)的細(xì)胞，或來自異種，如小鼠，大鼠，非人靈長動(dòng)物和豬的APC和T細(xì)胞?；蚺鋵Φ姆椒ㄊ且阎?。3、抗原的來源根據(jù)發(fā)明，抗原可以是，但不限于，蛋白，包括糖蛋白，肽(包括相互交叉的組合肽)，超級抗原(如SEA，SEB, TSST-I )，抗原/抗體復(fù)合物，腫瘤溶解物，病毒溶解物(如CMV溶解物)，不溶解的細(xì)胞碎片，凋亡小體，壞死細(xì)胞，活的、固定的、輻射過的、高溫滅活的、或其它方法備制的全細(xì)胞，滅活的、來自腫瘤組織或細(xì)胞系的腫瘤全細(xì)胞，滅活的異體細(xì)胞，輻射過的腫瘤細(xì)胞和異體細(xì)胞，天然或合成的碳水化合物，脂蛋白，脂多糖，RNA或RNA翻譯產(chǎn)物，以及DNA或DNA編碼的多肽。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞用3000-3600rad強(qiáng)度的、射線照射。淋巴母細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞用6000-10000rad強(qiáng)度的、射線照射。用理化或生物學(xué)的方法獲得壞死和凋亡細(xì)胞。如用凍-溶的方法獲得壞死細(xì)胞，而用紫外線照射的方法獲得凋亡細(xì)胞。(參閱Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, JohnWiley & Sons, New York. N. Y.)。
抗原也包括非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或細(xì)胞系?？梢詰?yīng)用已知的以逆轉(zhuǎn)錄酶病毒為載體的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)使宿主細(xì)胞表達(dá)重組抗原分子。具體的操作步驟可參考 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, New York. N. Y.試劑盒供應(yīng)商:Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.USA.表達(dá)牛痘疫苗載體的細(xì)胞是其中抗原之一。重組抗原可以包括以下描述的任何數(shù)量的抗原。采用的抗原有病毒抗原，如CMV pp65, HIV pgl20之類的抗原。優(yōu)選地，所述抗原為腫瘤特殊抗原，如黑色素瘤Melan-A抗原(也稱T細(xì)胞或MART-I識(shí)別的黑色素瘤抗原)，黑色素瘤抗原基因1,2，3編碼的抗原(MAGE-1, -2，-3)，黑色 素瘤GP-100抗原，癌胚抗原(CEA)，乳腺癌抗原，Her-2/Neu，血清前列腺特異性抗原(PSA)，維爾姆斯氏瘤抗原(WT-1)，PRl, PR3 (慢性粒細(xì)胞性白血病中移植物抗白血病的抗原)，粘蛋白抗原，MUC-I, -2，-3，-4，B型細(xì)胞淋巴瘤特異性抗原等。在這個(gè)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇不同的腫瘤抗原。4、抗原特異性T細(xì)胞的活化發(fā)明的其中一個(gè)驚人的發(fā)現(xiàn)是抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增取決于細(xì)胞與磁珠的比例。選擇細(xì)胞與磁珠的比例就能調(diào)節(jié)記憶性抗原特異性細(xì)胞的數(shù)量。因此，選擇適當(dāng)?shù)拇胖榕c細(xì)胞的比例，選擇性地?cái)U(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞。如來自單采的PBMC，血液或腫瘤活檢組織的T細(xì)胞與上述包被了第一和第二試劑的磁珠接觸后，第一試劑和第二試劑分別與T細(xì)胞表面相應(yīng)部位結(jié)合，誘發(fā)抗原特異性T細(xì)胞增殖(擴(kuò)增)。抗原特異性T細(xì)胞致敏后受到刺激，誘發(fā)增殖。因此，刺激T細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)弱是關(guān)鍵，“弱”信號(hào)刺激記憶性抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增，而“強(qiáng)”信號(hào)則相反。信號(hào)強(qiáng)弱取決于與配體結(jié)合的CD3/TCR和CD28受體的量。因此，磁珠與細(xì)胞的比例越高，刺激T細(xì)胞的信號(hào)就越強(qiáng)，引起抗原特異性T細(xì)胞的過刺激而死亡。降低磁珠與細(xì)胞的比例，適當(dāng)?shù)拇碳ば盘?hào)將誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞的增殖。改進(jìn)之一上述方法提取的T細(xì)胞用負(fù)載抗原的APC激活生成抗原特異性T細(xì)胞。另一改進(jìn)APC與足夠量的上述抗原在培養(yǎng)皿內(nèi)孵育足夠長的時(shí)間(一般需要1-4天)，讓APC有足夠的時(shí)間結(jié)合和/或攝入抗原。但是，不同抗原或來源不同的抗原，所需的時(shí)間也不相同。特殊改進(jìn)孵育時(shí)間36，48或72小時(shí)。進(jìn)一步改進(jìn)抗原孵育時(shí)間2. 5,3,
3.5，或4天。一些優(yōu)化抗原孵育時(shí)間4天以上，從4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5,8,8. 5,9,9. 5到10天不等。APC攝取抗原的量和必須的孵育時(shí)間根據(jù)抗原的來源和類型有所不同，可以用本領(lǐng)域常規(guī)的免疫檢測方法檢測。也可以用檢測APC表面MHC抗原復(fù)合物的方法檢測。另一改進(jìn)單采獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)直接按如上所述的方法與承載抗原的APC共培養(yǎng)，刺激并活化PBMC的里的T細(xì)胞，生成抗原特異性T細(xì)胞。操作步驟收集一個(gè)人的PBMC，加入抗原，如腫瘤抗原，或病毒溶解物等。這時(shí)，PBMC里的APC攝取抗原后提呈給PBMC里的T細(xì)胞。另一改進(jìn)用肽-MHC四聚物刺激抗原特異性T細(xì)胞(參閱Altmanet al. , Science 1998 Jun. 19;280(5371):1821)。APC可以用基因改良的方法負(fù)載抗原，包括用已知的方法轉(zhuǎn)染RNA或DNA，如電穿孔法(如用 the Gene Pulser II, BioRad, Richmond, Calif. USA),各種陽離子脂質(zhì)(LIPOFECTAMINE , Life Technology, Carisbad, Calif. USA)或其它技術(shù)，如 CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.里的方法憐酸I丐轉(zhuǎn)染。例如，500 μ I 含 5-50 μ g RNA 或 DNA 的 Opti-ΜΕΜ 室溫與 10-100 μ g/ml 混合 20-30 分鐘。其它脂質(zhì)包括LIPOFECTIN ，LIPOFECTAMINE 。產(chǎn)生的核酸-脂質(zhì)復(fù)合物加入1_3χ106(首選2xl06)抗原提呈細(xì)胞，液體(如Opti-ΜΕΜ)總體積大約2毫升，37° C孵育2_4小時(shí)。APC也可以用下面描述的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。另一改進(jìn)把抗原黏附、包被或用其它辦法固定在顆粒的表面負(fù)載給APC。市場銷售的各種微球或顆粒都可以用作這樣的抗原載體，如MiItenyi顆粒(MiItenyiBiotec.，Germany) ;Sepharose 微粒(Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) ；DYNABEADS (Dynallnc. , New York,USA)。其中改進(jìn)應(yīng)用市場銷售的順磁顆?；蛭⒘?。例如,Dynal AS生產(chǎn)的商標(biāo)名為Dynabeads 的常用磁珠有M-280，M-450和M-500。一個(gè)改進(jìn)活的、固定的、輻射后的、高溫、或其它方法滅活的整個(gè)細(xì)胞用抗體/配體特異性結(jié)合或其它方法固定在可被攝取的微粒的表面。腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞溶解物，或其它抗原都可以用相似的方法固定在微粒的表面。這些抗原/細(xì)胞/溶解物包被或黏附的微粒與動(dòng)物或人的PBMC 共培養(yǎng)時(shí)，其中的APC就能攝取攜帶抗原的微粒，處理其中的抗原并把相關(guān)抗原信息提呈給PBMC里的T細(xì)胞。巨噬細(xì)胞攝取顆粒/微粒，處理相關(guān)抗原，并提呈給PBMC里的T細(xì)胞。只有抗原特異性的T細(xì)胞才會(huì)與相應(yīng)APC相互作用。帶有磁珠的APC可以通過磁場與抗原特異性T細(xì)胞分離。一個(gè)特殊改進(jìn)細(xì)胞也可以用作抗原載體。在這種情況下，抗原通過與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合或通過基因改造的方法把抗原吸附在細(xì)胞表面。Current Protocol inMolecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.里的各種基因轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、或細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)都可以應(yīng)用，其中的試劑盒也都有商家提供。一種較好的轉(zhuǎn)染技術(shù)是電穿孔技術(shù)，可應(yīng)用于不同的細(xì)胞類型，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，真菌和細(xì)菌。通過實(shí)驗(yàn)確定對特定細(xì)胞類型的理想電穿孔條件，包括電壓，電阻和脈沖的波長。廠家也會(huì)提供這方面的一般準(zhǔn)則。不同的細(xì)胞類型可選擇不同的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如真菌用醋酸鋰的方法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后維持在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中促進(jìn)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)，條件的設(shè)定取決于細(xì)胞類型和基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用?？乖梢酝ㄟ^抗體/配體特異性結(jié)合方法結(jié)合到微粒上。適合的抗體/配體對包括，但不限于，MART-I抗體/MART-I，WT-I抗體/WT-I，PRl抗體/PRl，PR3抗體/PR3，絡(luò)氨酸酶抗體/絡(luò)氨酸，MAGE-I抗體/MAGE-I，MUC-I抗體/MUC-I，甲胎蛋白抗體/甲胎蛋白，Her2Neu 抗體 /Ner2Neu, HIV gpl20 抗體 /HIVgpl20,流感 HA 抗體 / 流感 HA, CMVpp65 抗體/CMVpp65，C型肝炎抗體/C型肝炎蛋白，EB病毒EBNA 3B抗體/EB病毒EBNA3B抗原，以及來自腫瘤病人的人免疫球蛋白重鏈和輕鏈抗體/人免疫球蛋白抗原。也可以通過蛋白/蛋白之間的相互作用，如受體/配體，把抗原結(jié)合到微球上。一些改進(jìn)抗原/蛋白用化學(xué)的方法吸附到微球上。只要抗原與微球孵育一定時(shí)間，利用抗原/蛋白與微球非共價(jià)結(jié)合的方式，或通過生物素/親和素或鏈酶親和素的相互作用把抗原結(jié)合到微球上。進(jìn)一步改進(jìn)利用甲苯磺酰基與微球表面裸露的疏水基團(tuán)的反應(yīng)，24小時(shí)內(nèi)通過氨基(NH2)和巰基(SH)的共價(jià)連接把蛋白吸附在微球上。連接反應(yīng)可以在中性PH的環(huán)境中完成，然而，37°C堿性環(huán)境能加速共價(jià)結(jié)合。承載抗原的APC用如上所述的方法刺激從組織分離獲得的T細(xì)胞，孵育時(shí)間大約從數(shù)小時(shí)到 0. 5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20 天不等。一個(gè)改進(jìn)T細(xì)胞與上述抗原或抗原承載的APC在活體內(nèi)接觸。為了在活體內(nèi)激活T細(xì)胞，上述抗原或承載抗原的APC可以注射到體內(nèi)，然后在體內(nèi)或體外擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞，體外擴(kuò)增,如上所述,用CD3/CD28抗體微球。注射的量和次數(shù)視疾病的嚴(yán)重程度而定，也可以通過臨床試驗(yàn)確定。如果抗原或承載抗原的APC在疾病發(fā)生前或在疾病開始治療前注射，然后從外周血中分離產(chǎn)生的抗原特異性T細(xì)胞，體外擴(kuò)增備用。一個(gè)改進(jìn)利用磁場把結(jié)合了抗原磁珠的APC的抗原特異性T細(xì)胞分離出來。分離方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的 DYNAL Magnetic Particle Concentrator (DYNAL)或 MACS (MiltenyiBiotec, Germany)提供的操作步驟。此時(shí),只有抗原特異性T細(xì)胞與APC充分作用，攜帶抗原特異性T細(xì)胞的抗原磁珠-APC通過磁場分離出來。然后，可以用各種方法活化/擴(kuò)增分離出來的抗原特異性T細(xì)胞，如XCELLERATE技術(shù)。另一個(gè)改進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞陽性分選。這個(gè)步驟可用于分離PBMC里的T細(xì)胞或已經(jīng)與抗原或承載抗原的APC結(jié)合的T細(xì)胞。Current Protocols in Immunology, JohnWiley & Songs, New York. N. Y.里描述的各種免疫分選的方法都可以應(yīng)用。用于陽性分選的標(biāo)記包括，但不限于，CD25, CD54, CD69, CD38, CD45R0, CD49d, CD40L, CD137,⑶62L，以及⑶134。另外，熒光活化細(xì)胞分選法可用于分選理想的抗原特異性T細(xì)胞， 也可以利用肽-MHC四聚體分選抗原特異性T細(xì)胞(參閱Atlman, et al. Science 1998Jun. 19;280(5371) :1821)。進(jìn)一步改進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的基因改造。基因改造包括用常規(guī)的RNA或DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，例如電穿孔法(the Gene Pulser II,BioRad, Richmond, Calif.)，各種陽離子脂質(zhì)(LIPOFECTAMINE , Life Technologies, Carlsbad, Calif.),或其他技術(shù)，例如 CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.描述的憐酸I丐轉(zhuǎn)染技術(shù)。500毫升含5-50 μ g RNA或DNA的Opti-ΜΕΜ與10-100 μ g溶度的陽離子脂質(zhì)，如LIPOFECTIN 或LIP0FECTAMINW ，室溫下孵育20-30分鐘。產(chǎn)生的核酸-脂質(zhì)復(fù)合物與
1-3χ106(首選2x106)APC細(xì)胞在總體積大約2毫升的0pti_MEM，37° C，孵育2-4小時(shí)。APC基因改造也可以用下面描述的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法。抗原特異性T細(xì)胞的基因改造也可以用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是雙向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，最好有一個(gè)長末端重復(fù)序列(LTR)，例如來自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)，骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)，鼠胚胎干細(xì)胞病毒(MESV)，鼠干細(xì)胞病毒(MSCV)，形成脾病灶病毒(SFFV)，或腺相關(guān)病毒(AAV)。大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒來源于鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒。來源于鳥類和哺乳類細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒都適用于本發(fā)明。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒最好是雙向性的，能感染包括人在內(nèi)的多種宿主細(xì)胞。一種方法是把逆轉(zhuǎn)錄病毒gag，pol和/或eny序列換成要表達(dá)的基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的選用可參考Miller and Rosman (1989)BioTechniques7:980-990;Miller,A.D. (1990)Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpaet al. (1991) Virology 180: 849-852 ; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:8033-8037;and Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109。另一方面，基因改造的抗原特異性T細(xì)胞可以用常規(guī)的免疫分選法，選用特異性抗體，受體/配體或針對轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的蛋白的抗體分選，方法可參考Current Protocolsin Immunology, Hohn Wiley & Sons, New York. N. Y.一個(gè)特殊改進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)自殺基因，如單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) (Bonini, et al. Science, 276(5319) :1719-24)和 / 或其它細(xì)胞表面標(biāo)記，例如，用截?cái)嗌窠?jīng)生長因子受體dNGFR跟蹤和/或控制輸入的抗原特異性T細(xì)胞，或表達(dá)靶向腫瘤組織的蛋白。細(xì)胞分離和培養(yǎng)可以用常規(guī)組織細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和容器，包括各種培養(yǎng)袋(如 Lifecell Culture bags)，培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)瓶，生物反應(yīng)器 CellCube 或 CELL-PHARM(⑶-Medical，Inc. of Hialeah, Fla.)，皮氏培養(yǎng)皿以及多孔培養(yǎng)板，或其它容器。改進(jìn)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，例如，本專利技術(shù)可結(jié)合現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備培養(yǎng)T細(xì)胞。用于培養(yǎng)APC和抗原特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)基有RPMI 1640，DMEM，alpha-MEM, AIM-V, HAMS F-12, X-Vivo 15，或 X-Vivo 20.培養(yǎng)基含有的細(xì)胞因子包括IL-12，IFN- Y , IL-4，GM-CSF, IL-10，IL-12，TGF^ 以及 TNF-α 和維生素。除此之外，培養(yǎng)基還包含細(xì)胞表面活化劑，如抗體，人血漿蛋白或還原劑(如N-乙酰半胱氨酸，2-巰基乙醇)。本專利應(yīng)用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的每一個(gè)步驟都保證APC和抗原特異性T細(xì)胞的生長。按照本專利培養(yǎng)細(xì)胞的方法，應(yīng)用的細(xì)胞生長培養(yǎng)基均加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子，血清，抗生素，維生素，氨基酸以及其它的添加劑。細(xì)胞因子包括，但不限于，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4 (IL-4)或白介素13 (IL-13)。其它可以加入的細(xì)胞因子和生長因子還有，但不限于，白介素lalpha (IL-Ia)和白介素Ibeta (IL-Ιβ), IL-2,腫瘤壞死因子alpha (TNF-α)，白介素3 (IL_3)，單核細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，干細(xì)胞因子(SCF)，白介素6 (IL-6)，白介素15 (IL-15)，以及Flt3配體。首選含有氨基酸和維生素，無/有適當(dāng)量的血清/血漿或良定集合的激素，和足以支持抗原特異性 T 細(xì)胞擴(kuò)增的 RPMI1640，AIM-V, DMEM, MEM, alpha-MEM, F-12, X_Vivol5，和 X_Vivo20。其中一種培養(yǎng)基的組成是，I升X_Vivol5 (Bioffhittaker)加50ml熱滅活的人血清,20mlIM Hepes, IOml 200mM L-谷氨酸，加也可以不加100，0001. U. IL-2。有時(shí)還需要加脂質(zhì)和/ 或蛋白，如加入1-5%人AB血清或混合的細(xì)胞因子。細(xì)胞也會(huì)適應(yīng)其它的生長培養(yǎng)環(huán)境，如胎牛血清(FCS/FBS)，不同濃度的血清或無血清培養(yǎng)液。例如無血清培養(yǎng)基加激素也適合培養(yǎng)APC前體細(xì)胞。培養(yǎng)基不一定要加入抗菌素來防止細(xì)菌的生長。常用抗菌素是青霉素，鏈霉素和慶大霉素單用或聯(lián)用。培養(yǎng)過程中要定時(shí)添加新鮮培養(yǎng)液，給細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)，包括GM-CSF，IL-4，IL-13，IL-15以及其它細(xì)胞因子。5、抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞通過細(xì)胞表位的結(jié)合來重新刺激抗原特異性T細(xì)胞的增殖。一個(gè)改進(jìn)與抗原承載的APC接觸后先用上述的方法分離抗原特異性T細(xì)胞。另外一個(gè)改進(jìn)抗原特異性T與抗原承載的APC共培養(yǎng)后，直接在APC存在的情況下擴(kuò)增，無需分離。一個(gè)特殊改進(jìn)用XCELLERATE 活化和擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞，而無需加入抗原或攜帶抗原的顆粒。相關(guān)技術(shù)是，提供活體內(nèi)已受過刺激或激活的抗原特異性T細(xì)胞(記憶性T細(xì)胞)活化的第一信號(hào)，如CD3抗體，以及共刺激信號(hào)，如CD28抗體，把這兩種試劑攜帶在同一界面，如順磁微球。細(xì)胞培養(yǎng)過程中調(diào)整微球與細(xì)胞的比例，低比例有利于抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。微球與細(xì)胞的比例，如I :200,1 :150,1 125,1 :100，1 -.75,1 :50，I :25，I 20，I :15，I :10，I :5或I :2. 5都可以用于抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。這個(gè)技術(shù)的好處在于擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞時(shí)無需抗原的參與?？乖禺愋訲細(xì)胞的擴(kuò)增通常除了刺激信號(hào)，同時(shí)，細(xì)胞表面的一種輔助分子與相對應(yīng)的配體結(jié)合。
一般來說，細(xì)胞表位的結(jié)合完成再刺激，如通過T細(xì)胞受體(TCR) /⑶3復(fù)合體或⑶2表面蛋白達(dá)到。市場有數(shù)種⑶3單克隆抗體供選擇，如BC3(XR-⑶3 ；Fred HutchinsonCancer Research Center, Seattle, Wash.)，美國模式培養(yǎng)庫(ATCC)提供的來自雜交瘤細(xì)胞的0KT3，以及單克隆抗體G19-4。通過⑶2表面蛋白刺激需要使用至少2種⑶2抗體，這2種抗體的選擇包括Tll. 3抗體配合Tll. I或者Tll. 2抗體(Meuer et al. Cell36:897-906，1984)，9. 6 抗體配合 9. I 抗體(Yang et al. J. Immunol. 137:1097-1100，1986)可以結(jié)合上述相同表位的其它抗體也可以應(yīng)用。抗原，肽，蛋白，肽-MHC四聚體也可以達(dá)到再刺激的目的(參閱 Altman, et al. Science 19960ct. 4; 274 (5284) :94-96),超級抗原，如 葡萄球菌腸毒素A (SEA)，葡萄球菌腸毒素B (SEB)，中毒性休克毒素I (TSST-1 )，內(nèi)毒素，以及不同的促細(xì)胞分裂素，包括但不僅限于植物血球凝集素(PHA)，醋酸佛波豆蘧酯(PMA)以及離子霉素，脂多糖，促T細(xì)胞分裂素和IL-2。固定在一個(gè)界面上的CD3抗體或CD2抗體，或結(jié)合了鈣離子載體的蛋白激酶C激活物(如苔蘚抑素)也可以刺激或再刺激抗原特異性T細(xì)胞。T細(xì)胞表面的共刺激輔助分子要與相對應(yīng)的配體作用。例如，適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，CD3和CD28抗體刺激CD4+細(xì)胞增殖；CD3 抗體和 CD28 抗體 B-T3，XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)刺激 CD28+ 細(xì)胞增殖。(參閱 Berg et al. , Transplant Proc. 30(8) :3975-3977, 1998; Haanen et al. , J. Exp. Med 190(9):1319-1328, 1999;Garland et al. , J. Tmmunol. Meth. 227 (1-2):53-63，1999)。要進(jìn)一步再刺激抗原特異性T細(xì)胞，就要用相對應(yīng)的配體刺激T細(xì)胞表面的共刺激分子，如⑶28。常用的配體有⑶28抗體或能與⑶28交聯(lián)的片段，或天然⑶28配體。本專利使用的配體包括單克隆抗體 9. 3 (IgG2a) (Bristol-Myers Squibb, Princeton, N. J.),K0LT-2 (IgGl), 15E8 (IgGl),248. 23. 2 (IgM)，克隆 B-T3 (XR-CD28) (Diaclone,Besancon,France)以及EX5. 3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。天然配體包括B7 蛋白家族，如 B7_1(CD80)和 B7-2 (CD86) (Freedman et al. , J. Tmmunol. 137:3260-3267, 1987;Freeman et al. , J.Tmmunol. 143:2714-2722，1989;Freeman et al. , J. Exp. Med. 174:625-631，1991;Freemanet al. , Science 262:909-911, 1993;Azuma et al. , Nature366:76-79, 1993;Freeman etal, J. Exp. Med. 178:2185—2192，1993)。進(jìn)一步改進(jìn)通過刺激T細(xì)胞的其它結(jié)構(gòu)蛋白促進(jìn)T細(xì)胞的活化,例如,天然配體ICAM-I與T細(xì)胞整合素LFA-I結(jié)合；很晚期抗原4 (VLA-4)與另外一個(gè)可作為共刺激因子的細(xì)胞表面分子VCAM-I結(jié)合(CD106)結(jié)合增進(jìn)T細(xì)胞的活化?；罨腡細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激受體4-1BB (CD137)與NKG2D結(jié)合擴(kuò)展T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。特別需要提的是，同時(shí)刺激兩個(gè)以上(任何兩個(gè))這些共刺激因子有助于實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞擴(kuò)增的預(yù)期目標(biāo)。另外，其它的無論是天然的還是用化學(xué)或基因重組技術(shù)合成的配體還包括，但不僅限于，其它抗體或片段，肽，多肽，生長因子，細(xì)胞因子，趨化因子，糖肽，可溶性受體，糖皮質(zhì)激素，激素，促細(xì)胞分裂劑，如PHA，或其它超級抗原?？梢杂貌煌姆椒ㄌ峁㏕細(xì)胞激活的初始信號(hào)和共刺激信號(hào)。例如，提供信號(hào)的每個(gè)試劑可以溶解在液體中或鏈接在一個(gè)界面上。如果是鏈接在界面上，初始信號(hào)和共刺激信號(hào)刺激劑就需要以不同的方式(順式和反式)鏈接在同一界面?；蛞粋€(gè)試劑溶解在液體中，另一個(gè)鏈接在界面。一個(gè)改進(jìn)共刺激信號(hào)結(jié)合在細(xì)胞表面，而初始信號(hào)試劑溶于液體中或鏈接在界面。另外改進(jìn)兩種試劑在液體中，另外改進(jìn)可溶性試劑溶解在液體中，然后交聯(lián)到一個(gè)界面，如表達(dá)Fe受體的細(xì)胞或可與其結(jié)合的抗體或其它因子。優(yōu)先改進(jìn)把兩種試劑固定在微球表面，或是同一微珠(cis)或不同微珠(trans)。例如，提供初始活化信號(hào)的試劑用CD3抗體，提供共刺激信號(hào)的試劑是CD28抗體；兩種試劑以相同的分子量固定在一個(gè)界面，如微球表面。一個(gè)改進(jìn)兩個(gè)抗體以I :1的比例結(jié)合在微球表面用于擴(kuò)增和培養(yǎng)⑶4+細(xì)胞。本專利的重要發(fā)現(xiàn)之一降低微球上⑶3抗體與⑶28抗體的比例增進(jìn)T細(xì)胞，包括抗原特異性T細(xì)胞在內(nèi)的擴(kuò)增。結(jié)合在微球上的CD3 CD28抗體的最佳的比例是通過一系列不同比例與I :1比較它們的擴(kuò)增效率后得出來的。特殊改進(jìn):與I :1比較，擴(kuò)增數(shù)量增加O. 5至大約3倍，結(jié)合微球的CD3:CD28抗體比例從100 :1至I :100之間比較。進(jìn)一步地微球上的⑶28抗體多于⑶3抗體，即⑶3:⑶28小于I ;進(jìn)一步地微球上的⑶28抗體與⑶3抗體的比例大于2:1。優(yōu)選地微球上的⑶3抗體與⑶28抗體的比例是I :100 ;更優(yōu)選地微球上⑶3抗體與⑶28抗體的比例分別是I :75，1 50,1 :30，I : 10，I :3以及3 :1。用于刺激T細(xì)胞的微球與細(xì)胞的比例從I :500至500 :1不等，根據(jù)微球大小與靶細(xì)胞的關(guān)系而定。因?yàn)槲⑶蛐〗Y(jié)合的細(xì)胞數(shù)量就少，微球大結(jié)合細(xì)胞的數(shù)量就多。進(jìn)一步地微球與細(xì)胞的比例從I :100到100 1之間。優(yōu)選地選擇I :9到9 :1之間用于刺激T細(xì)胞。如上所述，能刺激T細(xì)胞擴(kuò)增的連接在微球表面的CD3與CD28抗體的比例可以不同，但是，改進(jìn)后的比例是I :150或更低。優(yōu)先考慮的比例是1 :150,1 :100,1 :75，I :50，I :40，I 30,1 25,1 20,1 :15，I :20，I :15，I :10，I :9，I :8，I :7，I :6，I :5，I :4，I :3，I 2. 5，I :2，I :1，2 :1，3 :1，4 :1，5 :1，6 :1，7 :1，8 :1，9 :1，10 :1，15 :1 和 20 :1。一個(gè)改進(jìn)微球與細(xì)胞的比例是I :1或以下。一個(gè)特別改進(jìn)首選I :2. 5或I :5。進(jìn)一步改進(jìn)微球與細(xì)胞的比例在刺激過程中的不同時(shí)間調(diào)整，例如，其中一個(gè)改進(jìn)第一天微球與細(xì)胞的比例從I :5，I :2.5,1 1至10 :1，接著根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)每天或每隔一天加入微球，使微球與細(xì)胞的終比例從I :1，I :5，I 20,1 25,1 :50或I :100。特殊一個(gè)改進(jìn)第一天刺激的微球與細(xì)胞的比例是I :2. 5，I :5或I :1，第三天和第五天調(diào)整為I :5。進(jìn)一步改進(jìn)第一天微球與細(xì)胞的比例是I :2. 5,1 :5，或 I :1，第五、七、九天調(diào)整到 I :10，1 :20，I :25，I 50 或 I :100。另一個(gè)改進(jìn)第一天，微球以I :1的比例加入細(xì)胞內(nèi)，第三和第五天以I :5的比例加入。另一個(gè)改進(jìn)第一天微球與細(xì)胞的比例是2 :1，第三和第五天調(diào)整到I :10。另一個(gè)改進(jìn)每天或隔天加入微球使第一天微球與細(xì)胞的比例是I :1，第三和第五天的比例是I :10。專利的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)微球與細(xì)胞的比例不同導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果也不一樣。特別是，改變微球與細(xì)胞的比例可以選擇性擴(kuò)增或抑制抗原特異性T細(xì)胞。一個(gè)改進(jìn)選擇微球與細(xì)胞的特殊比例抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖。另一個(gè)改進(jìn)選擇微球與細(xì)胞的特殊比例促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞的擴(kuò)增。例如，選擇微球與細(xì)胞的比例I :100，1 50，I 25,1 :5或I :2. 5用于擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞。而且，在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間(如第五、七、九天)加入很低比例的微球(I :10，1 :25，1 :50，1 :100)可以提高甚至促進(jìn)記憶性細(xì)胞的擴(kuò)增。微球與細(xì)胞開始時(shí)的比例是I :5或I :2. 5，第五和第七天把比例調(diào)至I :10，1 25直至I :50和I :100似乎保留和加強(qiáng)記憶性細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)增，這種現(xiàn)象在單一刺激的時(shí)候是看不到的。因此，這里描述的微球與細(xì)胞比例和方法可以用來選擇性地?cái)U(kuò)增或去除 不同T細(xì)胞，應(yīng)用于不同的免疫治療。注意這里描述的微球與細(xì)胞比例適用于攜帶各種比例抗體的微球。例如，⑶3抗體與⑶28抗體以I :5至I :10的比例結(jié)合的微球可以用于微球與細(xì)胞比例介于I :5至I 10之間，而I :1的⑶3與⑶28比例的微球也可以用于I :5微球與細(xì)胞比例。因此，⑶3與⑶28抗體的比例從100 :1至I :100之間的微球適用于任何微球與細(xì)胞比例在I :500至500 1之間。T細(xì)胞激活12-14天后把它們分離出來，維持它們的激活狀態(tài)。定期(如每天)檢測T細(xì)胞的增殖率，例如觀察T細(xì)胞的大小或用庫爾特計(jì)數(shù)器測量T細(xì)胞的體積。靜息T細(xì)胞平均直徑大約是6. 8 μ M，在刺激因子存在的情況下，第四天平均直徑可以增加至12 μ M以上，大約第六天開始縮小。當(dāng)T細(xì)胞的直徑減小到大約8 μ M時(shí)，可以再一次刺激誘導(dǎo)進(jìn)一步增殖。除此之外，還可以根據(jù)T細(xì)胞表面的活化分子表達(dá)，如⑶154，⑶54，⑶25，⑶137，CD 134等監(jiān)測T細(xì)胞的增殖率和確定再刺激的時(shí)間。一個(gè)改進(jìn)用包被有⑶3和⑶28抗體的微球(⑶28微球3倍于⑶3微球)充分刺激(大約8-14天)使T細(xì)胞回到靜息狀態(tài)(低或無增殖狀態(tài))。去除微球后，洗滌T細(xì)胞，然 后回輸入患者體內(nèi)。這樣的T細(xì)胞表現(xiàn)記憶性，能及時(shí)對抗原作出反應(yīng)，處于極佳的可誘導(dǎo)狀態(tài)。無論是體外再刺激還是回輸后體內(nèi)對抗原的反應(yīng)，活化的T細(xì)胞都穩(wěn)定表達(dá)CD154，并增加細(xì)胞因子的合成。進(jìn)一步改進(jìn)細(xì)胞，如T細(xì)胞與包被試劑的微球結(jié)合，然后分離，接著培養(yǎng)細(xì)胞。或者培養(yǎng)前，沒有分離試劑包被的微球，而是與細(xì)胞一起培養(yǎng)。進(jìn)一步改進(jìn)用外力使細(xì)胞和微球集中濃縮在一起，促使細(xì)胞表位結(jié)合，刺激細(xì)胞。另一個(gè)改進(jìn)調(diào)整刺激劑，如包被在微球上的⑶3/⑶28抗體，與T細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間來獲得理想的T細(xì)胞表型。調(diào)整培養(yǎng)條件可以獲得想要的細(xì)胞群，如輔助性T細(xì)胞(Th)擴(kuò)增，通常是指CD4+細(xì)胞而不是CD8+細(xì)胞(細(xì)胞毒或抑制性細(xì)胞，Tc), Th細(xì)胞擴(kuò)增能誘發(fā)抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌的效應(yīng)器功能。CD4+細(xì)胞分泌很重要的免疫調(diào)節(jié)因子，如粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，⑶40L以及IL-2。需要⑶4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答時(shí)，應(yīng)用本專利描述的培養(yǎng)方法，提高CD4與CD8細(xì)胞的比例特別有幫助。一方面，提高輸入細(xì)胞中分泌GM-CSF或IL-2細(xì)胞的量，因?yàn)檫@些因子主要是CD4細(xì)胞分泌的。相反，需要提高Y干擾素水平時(shí)，就需要增加CD8+細(xì)胞的數(shù)量，應(yīng)用這里描述的活化T細(xì)胞的方法，先分選CD8+細(xì)胞，再刺激或培養(yǎng)擴(kuò)增。有時(shí)根據(jù)需要使用！^/!^細(xì)胞比例，或它們的上清液。有時(shí)還需要用到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。為了有效分離不同抗原特異性T細(xì)胞，細(xì)胞表位結(jié)合，誘導(dǎo)再次刺激的時(shí)間長短可能不同或有波動(dòng)。例如，細(xì)胞的表達(dá)取決于擴(kuò)增時(shí)間的長短和/或不同的刺激劑(如抗體或其片段，肽，多肽，MHC/肽多聚體，生長因子，細(xì)胞因子，趨化因子，糖肽，可溶性受體，糖皮質(zhì)激素，激素，促細(xì)胞分裂素，如ΡΗΑ，或其它超級抗原)。細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)隨時(shí)間而變，因此，控制培養(yǎng)時(shí)間和刺激劑的類型可以獲得特殊的T細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞類型，應(yīng)用相應(yīng)的刺激劑和培養(yǎng)時(shí)間，從4周到I周不等，或更短的時(shí)間。改進(jìn)刺激和擴(kuò)增6-2天，甚至更短的時(shí)間，如24小時(shí)或更短時(shí)間，最好4-6小時(shí)內(nèi)完成?？s短刺激T細(xì)胞的時(shí)間，T細(xì)胞的數(shù)量可能不會(huì)大量增加，但這些健康且穩(wěn)固的抗原特異性T細(xì)胞相當(dāng)于活體T細(xì)胞池內(nèi)的效應(yīng)細(xì)胞能不斷增殖。一個(gè)改進(jìn)細(xì)胞混合培養(yǎng)數(shù)小時(shí)(大約3小時(shí))至大約14天，或21天。另優(yōu)選地細(xì)胞與微球混合培養(yǎng)大約8天。更有選地Τ細(xì)胞與微球共培養(yǎng)2-3天。細(xì)胞可能需要幾次刺激，T細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間可長達(dá)60天或更長。適當(dāng)?shù)腡細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)該是培養(yǎng)基(如基本必須培養(yǎng)基或RPMI 1640，X-vivol5 (BioWhittaker))加上細(xì)胞活力和增殖因子，包括血清(胎?；蛉搜?，白介素-2 (IL-2)，胰島素，Y -干擾素(INF- Y )，IL_4，GM-CSF, IL-10，IL-12，TGF-β , TNF-α以及其它需要加入的細(xì)胞生長因子。其它細(xì)胞生長因子包括，但不限于，表面活性劑，人血漿蛋白和還原劑，如N-乙酰半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養(yǎng)基包括RPMI1640, AIM-V, DMEM, MEM, α -MEM，F(xiàn)-12，X_Vivol5，和 X_Vivo20 加入氨基酸和維生素，無血清或適當(dāng)量血清或血漿，或固定的幾種激素和/或足以使T細(xì)胞生長和擴(kuò)增的細(xì)胞因子?？咕刂挥糜谠囼?yàn)中的細(xì)胞培養(yǎng)，用于輸入到體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)不用抗菌素。細(xì)胞在37°C，100-120%的空氣濕度以及5%C02的條件下培養(yǎng)。一些改進(jìn)加入一定量的供給細(xì)胞加強(qiáng)活化和/或擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞的效果。供給細(xì)胞可以單用自體或異體的輻射后的外周血淋巴細(xì)胞或與EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(自體或異體)同用，永生化或非永生化髓系單核細(xì)胞系，如巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，紅細(xì)胞，B細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞系，如 U937, Jurkat, Daudi, MOLT-4, HUT, CEM, Colo205, HTB-13 和 HTB-70。供給細(xì)胞不一定用人源細(xì)胞，只要有供給功能的，例如能支持原代T細(xì)胞和后來的抗原特異 性T細(xì)胞的存活和生長，就可以用。6、有益效果腫瘤抗原特異性T細(xì)胞表達(dá)中央記憶性T細(xì)胞標(biāo)記CMV溶解物與Dynabead M-450混和，室溫孵育1_2小時(shí)后洗滌一次，加入PBMC ;數(shù)小時(shí)后APC吞噬攜帶CMV抗原的微球；72小時(shí)內(nèi)，CMVpp65特異性⑶8+T細(xì)胞表達(dá)中央記憶性T細(xì)胞標(biāo)記,如圖I所示。腫瘤抗原特異性T細(xì)胞(試驗(yàn)組)與相應(yīng)腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)白介素2 (IL-2)和伽瑪干擾素(IFN-Y )分泌明顯增高(與對照組比較)，提示其抗腫瘤活性(表I示)。表I:
權(quán)利要求
1.一種腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，包括產(chǎn)生和擴(kuò)增方法，其特征在于，所述產(chǎn)生方法是將含有抗原提呈細(xì)胞(APC)的第一群細(xì)胞與包被有抗原的界面接觸，讓APC攝取包被在界面上的抗原；再將含有T細(xì)胞的第二群細(xì)胞與攝取了抗原的第一群細(xì)胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述APC直接與抗原特異性T細(xì)胞接觸，與抗原特異性T細(xì)胞直接接觸的APC是用磁場分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述擴(kuò)增方法是將抗原特異性T細(xì)胞植入包被有第一試劑的培養(yǎng)界面擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)入包被有第二試劑的培養(yǎng)界面；所述第一試劑和第二試劑是相同或者不同的抗體或抗體片段；所述界面為磁珠、脂質(zhì)或細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在干，界面的空間與 T 細(xì)胞的比例選擇 I :2，I :2. 5，I :5，I 25,1 :50，I :75，I :100。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述第一試劑是CD3或CD2抗體或其片段，所述第二試劑用CD28抗體或其片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在干，T細(xì)胞的擴(kuò)增時(shí)加入促細(xì)胞分裂素、白介素15、天然CD137蛋白、CD137抗體、NKG2D抗體或/和天然NKG2D蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在干，所述促細(xì)胞分裂素選用植物血球凝集素(PHA)，豆蓮酸-佛波醇-こ酸酯(PMA)和離子素，脂多糖(LPS),以及超級抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，所述抗原為抗體/抗原復(fù)合物、腫瘤或病毒感染的細(xì)胞、固定的腫瘤或病毒感染的細(xì)胞、高溫滅活的腫瘤或病毒感染的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞裂解物、不溶解的細(xì)胞碎片、細(xì)胞凋亡體、壞死細(xì)胞、滅活的腫瘤細(xì)胞、放射滅活的異體細(xì)胞、天然或合成的碳水化合物、脂蛋白、脂多糖、以及基因改造的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在干，APC來源于外周血單個(gè)核細(xì)胞采集，淋巴結(jié)，扁桃體，活檢組織，腫瘤組織，脾臟，骨髄，臍血，CD34+細(xì)胞或單核細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，其特征在于，抗原是通過抗體/配體的相互作用吸附或者通過化學(xué)反應(yīng)的方法包被到載體的界面上。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的獲取方法，包括產(chǎn)生和擴(kuò)增方法，所述產(chǎn)生方法是將含有抗原提呈細(xì)胞(APC)的第一群細(xì)胞與包被有抗原的界面接觸，讓APC攝取包被在界面上的抗原；再將含有T細(xì)胞的第二群細(xì)胞與攝取了抗原的第一群細(xì)胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞。一種能產(chǎn)生大量反應(yīng)性極高的抗原特異性T細(xì)胞的方法，獲得的T細(xì)胞無論是細(xì)胞表面受體表達(dá)還是細(xì)胞因子的分泌都是現(xiàn)有其它培養(yǎng)系統(tǒng)無法比擬的。用此方法無需知道特殊抗原(當(dāng)然已知的抗原也可以應(yīng)用)，經(jīng)1-2次擴(kuò)增就能達(dá)到治療量，包含CD4和CD8系列的抗原特異性T細(xì)胞，而且可以根據(jù)需要分選CD4或CD8細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102816734SQ20121014200
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月9日
發(fā)明者阮潤生 申請人:阮潤生