專利名稱：一種利用木質纖維素材料發酵生產槐糖脂的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵生產槐糖脂的方法，尤其涉及一種利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)發酵生產槐糖脂的方法。
背景技術：
槐糖脂是一種重要的生物表面活性劑，主要是通過微生物發酵獲得。通常，當疏水性碳源和親水性碳源同時存在時，槐糖脂產生菌可以大量分泌槐糖脂。與化學合成的表面活性劑相比，槐糖脂除具有表面性能優良、乳化能力穩定，起泡效果明顯外，還具有良好的生物可降解性、生物兼容性等優點，并且具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性。這些優點使得槐糖脂在商業上具有很大的應用前景。槐糖脂作為生物表面活性劑，可以應用在各種工業領域，但是槐糖脂的生產成本較高是制約其應用的一個重要因素。目前研究主要采取兩種手段來降低槐糖脂的生產成本，一是優化發酵條件及培養基組分提高槐糖脂產量；二是選擇一些廉價的可再生原料及工農業副產物作為發酵產槐糖脂的底物。曾有學者利用乳清中的乳糖為底物使隱球酵母生長，生產單細胞油，破碎細胞后，將細胞提取物中的甘油三酯用來生產槐糖脂。還有報道利用甘蔗糖漿、去蛋白乳清或廢糖蜜作為親水性底物用以生產槐糖脂。此外，動物脂肪、煎炸廢油、工業脂肪酸廢料、餐飲業廢油等也有報道被作為疏水性底物用于槐糖脂的生產。然而，經檢索利用木質纖維素材料，特別是同時利用生物質資源纖維素酶水解液和水解液來源的單細胞油發酵生產槐糖脂的文獻及專利還未見報道。因而利用地球上最豐富的纖維素作為原料來生產槐糖脂具有極其重要的實際意義。

發明內容
針對目前尚未有利用生物質資源發酵生產槐糖脂的報道，本發明要解決的問題是提供一種利用木質纖維素材料發酵生產槐糖脂的方法，即利用生物質資源水解液及水解液所產單細胞油以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法。本發明所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法的步驟是(1)糖化液制備取木質纖維素材料，以15 35個濾紙酶活單位(FPA)每克干木質纖維素的量添加纖維素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C 下水浴30 60min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于7000 IOOOOrpm下離心6 lOmin，得澄清的糖化液；其中上述木質纖維素材料是包括木素木糖渣，木糖渣，玉米芯粉，玉米秸稈，甘蔗渣，小麥稈，水稻稈，高粱稈或草粉等生物質能源。(2)糖化液的脫毒處理將上述糖化液水浴加熱至80°C，再加入其質量百分比為 0. 6 1. 2%的活性炭，攪拌30 50min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的產油微生物以體積百分比為4 10%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30 士 2°C、200 士 50rpm，搖床震蕩培養60 80h ；發酵液于7000 9000rpm下離心8 15min收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 4次；以酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；
其中上述產油微生物是隱球酵母(Cryptococcus curvatus)，紅東孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，斯達氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粘紅酵母(Rhodotorula giutinis)，亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，皮狀絲孢酵母 (Trichosporon cutaneum)，深黃被抱霉(Mortierella isabellina)或少根根霉(Rhizopus arrhizus)；
(4)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培養基，將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為1 4%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于30士2°C、 150 300rpm，搖床振蕩發酵培養7 9天，得到含槐糖脂的發酵液；
(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液，加入其2 6倍體積的乙酸乙酯萃取， 5000 SOOOrpm離心5 15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品； 或取含槐糖脂的發酵液，加入其3 6倍體積的乙醇，渦旋混合，6000 IOOOOrpm離心5 15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。
上述步驟(1)中所述纖維素酶液是指產纖維素酶真菌經發酵所得粗酶液以及商品化的纖維素酶；其中所述真菌是指青霉屬、木霉屬或曲霉屬菌株。
具體的，上述步驟⑴中所述纖維素酶液的制備方法是將斜臥青霉 (Penicillium decumbens) JU-AlO 以常規量接種于產酶培養基中，30士2°C，150 300rpm 下震蕩培養60 96h，5000 7000rpm下離心15 30min，收集上清液即為纖維素酶液；其中所述產酶培養基配方為20g/l木糖渣，30g/l麩皮，6g/l微晶纖維素，5g/l豆餅粉，2g/l 硫酸銨，lg/Ι尿素，2g/l硝酸鈉，3g/l磷酸二氫鉀，0. 5g/l硫酸鎂，3ml/l吐溫80。
上述步驟(1)所述的纖維素酶添加量優選為20 30個濾紙酶活單位每克干木質纖維素(FPA/g干木質纖維素)，糖化溫度優選為40 50°C，糖化時間優選為70 80h。所述離心轉速優選為8000 9000rpm，所述離心時間優選為8 lOmin。
上述步驟(1)所述木質纖維素材料優選脫木素木糖渣或玉米芯粉。
上述步驟(2)所述活性炭的質量百分比優選為0.8 1.0%，攪拌時間優選為 30 35min。
上述步驟(3)中，產油微生物接種量優選為6 8%，培養時間優選為65 75h， 獲得菌體的離心時間優選為10 12min。
上述步驟(4)所述接種體積優選為2 3%，所述發酵培養轉速優選為200 250rpmo
上述步驟( 所述乙酸乙酯的添加量是含槐糖脂發酵液體積的2 4倍，離心轉速優選為6000 7000rpm，離心時間優選為7 12min。所述乙醇的添加量是含槐糖脂發酵液體積的3 4倍，離心轉速優選為7000 9000rpm，離心時間優選為7 12min。
本發明提供一種利用木質纖維素材料發酵生產槐糖脂的方法，即利用生物質資源 (如脫木素木糖渣，木糖渣，玉米秸稈，玉米芯粉，草粉等)水解液及水解液所產單細胞油以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法。方法中使用木質纖維素糖化液替代單細胞油和槐糖脂生產所需的糖，使用單細胞油替代槐糖脂生產所需的疏水性底物，所得槐糖脂易于分離，產量高。本發明方法具有原料豐富、價格低廉、工藝簡便、顯著降低槐糖脂生產成本的特點，生物質資源的大量利用，處理了廢棄農業廢料，對改善我國能源緊缺狀況，保障我國能源可持續供給，緩解能源危機具有重要的實際意義和重要的經濟價值。


圖1利用脫木素木糖渣發酵生產槐糖脂思路圖。
圖2普通培養基和糖化液培養基所得槐糖脂的形態比較，(A)來源于普通培養基 (B)來源于糖化液培養基。
圖3HPLC分析普通培養基和糖化液培養基所得槐糖脂的組成。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明內容作進一步的說明。
實施例1
(1)纖維素酶液的制備將斜臥青霉(Penicillium decumbens) JU-AlO以常規量接種于產酶培養基中，300C，250rpm下震蕩培養產酶，6000rpm下離心30min，收集上清液即為纖維素酶粗酶液；
上述產酶培養基配方為20g/l木糖渣，30g/l麩皮，6g/l微晶纖維素，5g/l豆餅粉，2g/l硫酸銨，lg/Ι尿素，2g/l硝酸鈉，3g/l磷酸二氫鉀，0. 5g/l硫酸鎂，3ml/l吐溫80 ；
(2)糖化液制備取脫木素木糖渣，以25個FPA每克干底物添加纖維素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于 8000rpm下離心lOmin，得澄清的糖化液；
(3)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；
(4)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus)以6%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養72h ；發酵液于SOOOrpm下離心 IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3次；酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；
(5)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培m^iti^^W^^iW·^·7^^ (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為2%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于30°C、 200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得含槐糖脂的發酵液；(6)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm 離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。實驗結果斜臥青霉粗酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖的濃度達到了 49g/l，在未經脫毒處理的產油糖化液培養基中的隱球酵母的菌體干重達到了 15. 00g/l，單細胞油達到了 6. 14g/l，油脂含量為40. 92%。在脫毒后產油糖化液培養基中，隱球酵母菌體干重和單細胞油分別達到了 15. 16g/l和6. 18g/l，油脂含量為40. 73%。使用上述所得糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，擬威克酵母變種生長良好，經過7天的發酵培養，葡萄糖基本被耗盡，內酯型槐糖脂的產量達到了 30. 37g/l，總槐糖脂的產量達到了 53. 16g/l。實施例2(1)纖維素酶液的制備將斜臥青霉以常規量接種于產酶培養基中，30°C，250rpm 下震蕩培養84h產酶，6000rpm下離心30min，收集上清液即為纖維素酶粗酶液；上述產酶培養基配方為20g/l木糖渣，30g/l麩皮，6g/l微晶纖維素，5g/l豆餅粉，2g/l硫酸銨，lg/Ι尿素，2g/l硝酸鈉，3g/l磷酸二氫鉀，0. 5g/l硫酸鎂，3ml/l吐溫80 ；(2)糖化液制備取脫木素木糖渣，以30個FPA每克干底物添加纖維素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于 9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；(3)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(4)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的紅東孢酵母(Miodosporidium toruloides)以8%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養75h ；發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3次；酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HCl，漩渦混合lmin，每0. 5h 一次，共混合5次；沸水浴60min， 中間混合一次，冰水浴30min ；將混合液轉入分液漏斗，按每3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按每3g濕菌體15ml的比例用乙醚分洗試管，合并入分液漏斗，振蕩約lmin，再按每 3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，待上層液體清晰，小心的地將上層有機試劑轉移至干凈的離心管，置于50°C烘箱中烘干揮發去除有機試劑；(5)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為2%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于32°C、 200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得含槐糖脂的發酵液；(6)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm 離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。實驗結果斜臥青霉粗酶液酶解脫木素木糖渣所得的糖化水解液的葡萄糖的濃度達到了 52g/l.經過80h的培養，紅東孢酵母在產油糖化液培養基中的菌體干重達到了 16.30g/l，單細胞油達到了 7.0(^/1，油脂含量為42.92%。當使用上述所得糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，擬威克酵母變種生長良好，經過7天的發酵培養，菌體干重達到了 8. Og/Ι，葡萄糖基本被耗盡，內酯型槐糖脂的產量達到了 32. 51g/l，總槐糖脂的產量達到了 53. 79g/l。實施例3(1)糖化液制備取脫木素木糖渣，以25個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于青島康地恩生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于8000rpm下離心lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以8%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養72h ；發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；(4)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為2%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于30°C、 200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得含槐糖脂的發酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm 離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。實驗結果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液中，康地恩酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖濃度達到了 Mg/Ι。用于隱球酵母的培養時，隱球酵母的菌體干重達到了 23. 43g/ 1，油脂含量達到了 46. 74%，單細胞油產量達到了 10.95g/l。當使用該糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，經過7天的發酵培養，內酯型槐糖脂的產量為13. 04g/l，總槐糖脂的產量達到了 30. 25g/l。實施例4(1)糖化液制備取脫木素木糖渣，以20個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于青島康地恩生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；
(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；
(3)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica)以6%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養65h ；發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HCl，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；
(4)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為2%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于32°C、 200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得含槐糖脂的發酵液；
(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液加入其4倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm 離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其4倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。
實驗結果在pH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液中，康地恩纖維素酶酶解脫木素木糖渣所得糖化液的葡萄糖的濃度達到了 56g/l。用于亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica) 的培養時，亞羅解脂酵母的菌體干重達到了 17. 36g/l，油脂含量達到了 44. 35%，單細胞油產量達到了 7. 70g/l。當使用該糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，經過7天的發酵培養，內酯型槐糖脂的產量為19. 36g/l，總槐糖脂的產量達到了 42. 06g/l.
實施例5
(1)糖化液制備取脫木素木糖渣，以25個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于杰能科生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于 8000rpm下離心lOmin，得澄清的糖化液；
(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；
(3)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的深黃被孢霉(Mortierella isabellina)以6%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養72h ；發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HCl，漩渦混合lmin，每0. 5h 一次，共混合5次；沸水浴60min，中間混合一次，冰水浴30min ；將混合液轉入分液漏斗，按每3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按每3g濕菌體15ml的比例用乙醚分洗試管，合并入分液漏斗，振蕩約lmin，再按每3g 濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，待上層液體清晰，小心的地將上層有機試劑轉移至干凈的離心管，置于50°C烘箱中烘干揮發去除有機試劑；(4)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為2%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于30°C、 200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得含槐糖脂的發酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液加入其2倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm 離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。實驗結果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液中，杰能科酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖濃度達到了 52g/l。用于深黃被孢霉(Mortierella isabellina)的培養時， 深黃被孢霉的菌體干重達到了 15. 31g/l，油脂含量達到了 40. 21 %，單細胞油產量達到了 6. 16g/l。當使用該糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，經過7天的發酵培養，內酯型槐糖脂的產量為21. 12g/l，總槐糖脂的產量達到了 53. 79g/l。實施例6(1)糖化液制備取甘蔗渣，以20個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于杰能科生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液在50°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的粘紅酵母(Miodotorula giutinis)以7%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養65h ；發酵液于SOOOrpm下離心 IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；(4)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以體積百分比為2%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于30°C、 200rpm，搖床振蕩發酵培養7天，得含槐糖脂的發酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液加入其3倍體積的乙酸乙酯萃取，6000rpm離心15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液加入其4倍體積的乙醇，渦旋混合，6000rpm離心15min，收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。
實驗結果在pH4. 8的H2O緩沖液中，杰能科酶液酶解甘蔗渣所得糖化液的葡萄糖的濃度達到了 51g/l。用于粘紅酵母(Iihodotorula giutinis)的培養時，粘紅酵母的菌體干重達到了 17.86g/l，油脂含量達到了 37. 35%，單細胞油產量達到了 6.67g/l。當使用該糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，經過7天的發酵培養，內酯型槐糖脂的產量為 16. 33g/l，總槐糖脂的產量達到了 33. 78g/l。
實施例7
(1)糖化液制備取玉米芯粉，以30個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于杰能科生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液在50°C下糖化75h ；收集糖化液于80°C下水浴40min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；
以下步驟同實施例6中(2) (5)。
實驗結果在pH4. 8的H2O緩沖液中，杰能科酶液酶解玉米芯粉所得糖化液的葡萄糖的濃度達到了 53g/l。用于粘紅酵母(Iihodotorula giutinis)的培養時，粘紅酵母的菌體干重達到了 18.96g/l，油脂含量達到了 47. 35%，單細胞油產量達到了 7.67g/l。當使用該糖化液和單細胞油進行槐糖脂的發酵時，經過7天的發酵培養，內酯型槐糖脂的產量為 19. 33g/l，總槐糖脂的產量達到了 43. 78g/l。
權利要求
1.一種利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法，步驟是(1)糖化液制備取木質纖維素材料，以15 35個濾紙酶活單位每克干木質纖維素的量添加纖維素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C下水浴30 60min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于7000 IOOOOrpm下離心6 lOmin，得澄清的糖化液；其中上述木質纖維素材料是脫木素木糖渣，木糖渣，玉米芯粉，玉米秸稈或草粉；(2)糖化液的脫毒處理將上述糖化液水浴加熱至80°C，再加入其質量百分比為0.6 1. 2%的活性炭，攪拌30 50min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液制備單細胞油以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的產油微生物以體積百分比為4 10%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30 士 2 °C、200 士 50rpm，搖床震蕩培養60 80h ；發酵液于7000 9000rpm 下離心8 15min收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 4次；以酸熱-有機試劑法提取單細胞油， 即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HCl，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ； 然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；上述產油微生物是隱球酵母(Cryptococcus curvatus)，紅東孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，斯達氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粘紅酵母(Rhodotorula giutinis)，亞羅解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum), "MMW^^M= (Mortierella isabellina) 13 ^(Rhizopus arrhizus)；(4)發酵生產槐糖脂以脫毒的糖化液、60ml/l單細胞油、1.5g/l酵母粉、1. Og/Ι磷酸二氫鉀、1. Og/Ι磷酸氫二鈉、0. 5g/l硫酸鎂的配方制備產槐糖脂糖化液發酵培養基，將活化好的擬威克酵母變種(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 以體積百分比為1 4%接種量接種于產槐糖脂糖化液發酵培養基中，于30士2°C、150 300rpm，搖床振蕩發酵培養7 9天，得到含槐糖脂的發酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的發酵液，加入其2 6倍體積的乙酸乙酯萃取，5000 SOOOrpm離心5 15min，收集乙酸乙酯層，減壓濃縮后烘干，得內酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的發酵液，加入其3 6倍體積的乙醇，渦旋混合，6000 IOOOOrpm離心5 15min， 收集上清，減壓濃縮后烘干，得總槐糖脂粗品。
2.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法， 其特征在于步驟(1)所述木質纖維素材料選脫木素木糖渣或玉米芯粉。
3.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法， 其特征在于步驟(1)所述纖維素酶添加量為20 30個濾紙酶活單位每克干木質纖維素， 糖化溫度為40 50°C，糖化時間為70 80h。
4.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法， 其特征在于步驟(2)所述活性炭的質量百分比為0. 8 1. 0%，攪拌時間為30 35min。
5.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法， 其特征在于步驟C3)所述產油微生物的培養條件是30°C、200rpm搖床震蕩培養65 75 小時。
6.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂方法，其特征在于步驟(4)所述擬威克酵母變種的發酵條件是30°C、200 250rpm搖床振蕩發酵培養7 8天。
7.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法， 其特征在于步驟( 所述乙酸乙酯的添加量是含槐糖脂發酵液體積的2 4倍，離心轉速為6000 7000rpm，離心時間為7 12min。
8.如權利要求1所述利用木質纖維素材料以擬威克酵母變種發酵生產槐糖脂的方法， 其特征在于步驟( 所述乙醇的添加量是含槐糖脂發酵液體積的3 4倍，離心轉速為 7000 9000rpm，離心時間為7 12min。
全文摘要
本發明公開了一種利用木質纖維素材料發酵生產槐糖脂的方法，是利用脫木素木糖渣，木糖渣，玉米秸稈，玉米芯粉，草粉等生物質資源水解液及水解液所產單細胞油，以擬威克酵母變種在30±2℃、150～300rpm搖床振蕩發酵條件下得到含槐糖脂的發酵液，再經對發酵液粗提獲得槐糖脂。本發明方法使用木質纖維素糖化液替代單細胞油和槐糖脂生產所需的糖，使用單細胞油替代槐糖脂生產所需的疏水性底物，所得槐糖脂易于分離，產量高；具有原料豐富、價格低、工藝簡便、成本低的特點，生物質資源的大量利用，處理了廢棄農業廢料，對改善我國能源緊缺狀況，保障我國能源可持續供給，緩解能源危機具有重要的實際意義和重要的經濟價值。
文檔編號C12P19/12GK102492753SQ20111040382
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者宋欣, 馬曉靜 申請人:山東大學