專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶產生菌的快速高通量篩選技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌的方法。
背景技術：
纖維素是地球上豐富且可再生的生物聚合物。由于其結構復雜，所以纖維素降解過程依靠復雜的多酶體系即內切纖維素酶、外切纖維素酶與β -葡萄糖苷酶三種酶的協(xié)同作用才能完成，其中葡萄糖苷酶是此過程的限速酶。純培養(yǎng)分離技術與構建基因文庫技術是用于挖掘環(huán)境樣品中微生物資源的主要策略。目前對于葡萄糖苷酶產生菌的主要篩選方法是基于功能篩選，已有文獻報道采用功能篩選法挖掘β -葡萄糖苷酶產生菌的研究策略是基于熒光法與七葉苷顯色底物平板法。使用熒光底物(如MUGG-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷))篩選葡萄糖苷酶產生菌費力、經濟成本高；使用七葉苷平板法篩選β-葡萄糖苷酶產生菌工作量大、效率低、費時費力；而選用對硝基酚葡萄糖苷 (PNPG)作為底物用于葡萄糖苷酶產生菌的高通量篩選尚未有文獻報道。日前pNPG(對硝基酚-β-葡萄糖苷)主要用于葡萄糖苷酶的酶活測定，本發(fā)明基于PNPG與β-葡萄糖苷酶可發(fā)生黃色顯色反應，并且反應產物在400-420nm處有最大吸光值。選用pNPG作為反應底物篩選葡萄糖苷酶產生菌，具有簡便、快速、廉價、結果可信等特點。

發(fā)明內容
針對目前篩選葡萄糖苷酶產生菌的方法存在耗時、費力、效率低以及成本較高等問題，本發(fā)明通過提供一種基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌的方法，從而有效解決上述存在的問題，僅限應用于葡萄糖苷酶產生菌的快速高通量初篩，復篩需進一步驗證。本發(fā)明將公開一種過程簡單，操作方便，成本低，菌株初篩快且適合于工業(yè)化大規(guī)模從備選材料中篩選出β -葡萄糖苷酶產生菌的方法，它以動物糞便或土壤樣品為初篩物，經菌株復活培養(yǎng)、擴培、加入PNPG反應、顯色后根據顏色為初步指標判斷該菌株是否產 β-葡萄糖苷酶。本發(fā)明所述的是一種基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌的方法，其操作步驟如下(1)將待篩選的單菌落在20-50°C，120-220rpm下液體培養(yǎng)基進行菌株復活；(2)復活菌液在 20-50°C，120-220rpm 下進行擴培 4_18h ；(3)取一 96孔板添加一定體積菌種生長培養(yǎng)基，按比例轉接復活菌液，20-50°C， 120-220rpm培養(yǎng)4-1 進行擴培；(4)向96孔板擴培菌液中加入一定體積的反應底物pNPG(同時設置陽性對照與陰性對照)，20-50 0C，120-220rpm,反應一定時間；(5)添加一定體積Na2CO3溶液終止反應；(6)室溫下將反應液轉接96孔酶標板在酶標儀上檢測其吸光值，以陽性對照、陰性對照吸收值為參照，可據數值大小判斷不同菌株所產的葡萄糖苷酶的酶活力，確認初篩結果。上述基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌的方法中，所述96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌一般指細菌；菌種生長培養(yǎng)基一般指細菌生長培養(yǎng)基。上述基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌的方法中，所述待篩選菌株的復活與擴培具體步驟是向菌種生長培養(yǎng)基中轉接接種液比例為0. 5% -10%。上述基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產生菌的方法中，所述顯色是向擴培菌液中添加反應底物PNPG的比例一般為-5%，pNPG的終濃度范圍一般為0. I-IOmmol/ L，與pNPG顯色反應時間在10-90min。上述基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產生菌的方法中，所述終止反應是向擴培菌液中添加0. 5-2. 5倍體積Na2CO3溶液，Na2CO3溶液的終濃度范圍一般為0. 5-2. 5mol/ L0上述基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產生菌的方法中，所述陰性對照是細菌培養(yǎng)基中轉接0.5%-10%不產β-葡萄糖苷酶菌的菌液；陽性對照是細菌培養(yǎng)基中轉接 0. 5% -10%濃度為200U/mL的β -葡萄糖苷酶或β -葡萄糖苷酶產生菌的菌液。上述基于96孔板高通量篩選β -葡萄糖苷酶產生菌的方法中，所述細菌培養(yǎng)基一般指LB培養(yǎng)基、SOB培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基、2 X YT培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、GYT培養(yǎng)基、Μ9培養(yǎng)基、NXCYM培養(yǎng)基、NZNM培養(yǎng)基或NZM培養(yǎng)基。技術效果1、該法采用簡單的化學物質反應，使其篩選方法簡單、可靠。2、與MUG熒光法、七葉苷平板法相比，采用pNPG顯色成本低廉，耗費試劑少。3、該法充分利用酶標儀與96孔酶標板的高通量特性，使其篩選方法非常快速準確，大大節(jié)省了實驗人員的時間。
具體實施例方式實施例1 從牛糞便微生物質粒宏基因組文庫中快速篩選產β -葡萄糖苷酶的活性克隆將芒草喂養(yǎng)牛糞便微生物質粒宏基因組文庫(含8，115個單克隆)樣品使用96 孔板保存于_80°C低溫冰箱。配制IOOmL的含Ampicillin(氨芐青霉素)(100mg/mL)LB 培養(yǎng)基并滅菌，隨機從其文庫中取部分樣品370個單菌落進行復活，在96孔板中分別加入10(^1^含々11^(^11111(氨芐青霉素)(1001^/1^)的LB培養(yǎng)基與5 μ L保存菌液，37 °C， 120-150rpm培養(yǎng)10-1 ；復活菌液進行擴培，向96孔板每個微孔中分別加入93 μ L含 Ampicillin (100mg/mL) LB 培養(yǎng)基與待篩菌樣品菌液 4 μ L，37°C，120_150rpm 培養(yǎng) 6_8h ；進行顯示反應，在96孔板每個微孔中加入3 μ L IOmM pNPG,同時設置陰性對照與陽性對照。 陰性對照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL)LB培養(yǎng)基中轉接4 μ L不產β -葡萄糖苷酶的菌液，陽性對照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培養(yǎng)基中轉接4 μ L 200U/mL標準濃度的β -葡萄糖苷酶。反應液37°C，120-150rpm,反應60min ；加入100 μ L IM Na2CO3溶液終止反應5min。觀察溶液顏色變化，以溶液顯黃色為初步指標判斷該重組子是否含編碼 β -葡萄糖苷酶的功能基因。將反應液轉到96孔酶標板上使用普通酶標儀于405nm處測定樣品吸光值。同時，測定陰性對照與陽性對照在405nm處的吸光值。結果表明初篩獲得 3株(M16、B5、L9)陽性克隆。對比施例1 用七葉苷平板法從牛糞便微生物質粒宏基因組文庫中快速篩選產 β-葡萄糖苷酶的活性克隆配制40mL的含Ampicillin (氨芐青霉素)(100mg/mL) LB培養(yǎng)基并滅菌，隨機從其文庫中取部分樣品370個單菌落進行復活，在96孔板中分別加入100 μ L含Ampicillin (氨芐青霉素)(100mg/mL)的LB培養(yǎng)基與5 μ L保存菌液，37°C，120-150rpm培養(yǎng)10_12h ；配制 3700mL七葉苷培養(yǎng)基滅菌后制370個培養(yǎng)平板；各取5 μ L復活菌液直接點在含有七葉苷培養(yǎng)基的平板上，于37°C倒置培養(yǎng)Μ-4 !后，對已接種的370個培養(yǎng)平板進行逐個觀察。 根據菌落周圍出現黑色水解圈初步判該菌株是否產葡萄糖苷酶。結果用七葉苷平板法篩選文庫初篩得到1株(Μ16)陽性克隆。實施例2 白蟻腸道微生物中產β -葡萄糖苷酶功能菌株的快速篩選湖南省植物園朽木林中收集白蟻，在超凈工作臺中取白蟻腸道微生物并將其溶于無菌水中，充分震蕩混勻，然后將其梯度稀釋105，IO6倍，再分別吸取0. ImL的稀釋液涂布到 LA平板上，置37°C培養(yǎng)12-24h ；分離得到243株細菌。配制300mL LB培養(yǎng)基并滅菌，將243株細菌分別接種于ImL LB液體培養(yǎng)基中， 37°C，180-200rpm培養(yǎng)ΙΟ-ia!進行復活；復活菌液進行擴培，即在96孔板中分別加入 93 μ L LB培養(yǎng)基與4μ L復活菌液，37°C，120_150rpm培養(yǎng)8_12h ；在96孔板中依次加入 3μ L IOmM反應底物pNPG，37°C，120-150rpm反應40min，同時設置陰性對照和陽性對照。陰性對照為93 μ L LB培養(yǎng)基中轉接4 μ L不產β -葡萄糖苷酶的菌液，陽性對照為93 μ L LB 培養(yǎng)基中轉接4μ L 200U/mL標準濃度的β -葡萄糖苷酶，37°C，120_150rpm，反應30min ； 加入100 μ L IM NaCO3溶液終止反應5min。觀察溶液顏色變化，以溶液顯黃色為指標判斷菌落含編碼β-葡萄糖苷酶功能基因。將反應液轉到96孔酶標板上使用酶標儀于405nm 處測定樣品吸光值。同時，測定陰性對照與陽性對照在405nm處的吸光值。以pNPG為顯色底物，96孔板高通量篩選初篩得到89株產β -葡萄糖苷酶的菌株。對比施例2 用七葉苷平板法從白蟻腸道微生物中產β -葡萄糖苷酶功能菌株的篩選配制M30mL含七葉苷的LB培養(yǎng)基并滅菌，制作成243個平板，將243株細菌分別接種于平板上，于37°C倒置培養(yǎng)對-4他后，對已接種的對3個培養(yǎng)平板進行逐個觀察，初篩選得到73株功能菌株。實施例3 從牛瘤胃微生物Cosmid文庫中快速篩選產生β -葡萄糖苷酶的活性克隆芒草喂養(yǎng)牛瘤胃Cosmid宏基因組文庫(約5，500個單克隆)樣品使用96孔板保存于-80°C低溫冰箱。隨機取部分文庫樣品O70個)進行復活，在96孔板中分別加入10(^1^含々11^(^11111(氨芐青霉素)(1001^/1^)的LB培養(yǎng)基與5 μ L保存菌液，37°C， 120-150rpm培養(yǎng)10-1 ；復活菌液進行擴培，向96孔板每個微孔中分別加入93 μ L含 Ampicillin (100mg/mL) LB 培養(yǎng)基與待篩菌樣品菌液 4 μ L，37°C，120_150rpm 培養(yǎng) 6_8h ；進行顯示反應，在96孔板每個微孔中加入3 μ L IOmM pNPG,同時設置陰性對照與陽性對照。 陰性對照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培養(yǎng)基中轉接4 μ L不產β -葡萄糖苷酶的菌液，陽性對照為93 μ L含Ampicillin (100mg/mL) LB培養(yǎng)基中轉接4 μ L 200U/mL標準濃度的β-葡萄糖苷酶。反應液37°C，120-150rpm，反應90min ；加入IOOyL IM Na2CO3溶液終止反應5min。觀察溶液顏色變化，以溶液顯黃色為初步指標判斷菌落含編碼β-葡萄糖苷酶的功能基因。將反應液轉到96孔酶標板上使用酶標儀于405nm處測定樣品吸光值。以 PNPG為顯示底物，使用96孔板高通量篩選文庫初篩沒有得到陽性克隆。對比施例3 用七葉苷平板法從牛瘤胃微生物Cosmid文庫中篩選產生β -葡萄糖苷酶的活性克隆配制2700mL的含Ampicillin (氨芐青霉素)(100mg/mL) LB培養(yǎng)基并滅菌，配制 270個培養(yǎng)平板，將270株復活細菌分別接種于平板上，于37°C倒置培養(yǎng)后，對已接種的270個培養(yǎng)平板進行逐個觀察，初篩沒有得到有編碼β -葡萄糖苷酶的陽性克隆。表1各實驗所消耗的化學試劑表
實施例1對比施例1實施例2對比施例2實施例3對比施例3所耗培養(yǎng)基約 IOOmL約 37OOmL約 300mL約 M30mL約 IOOmL約 2700mLpNPG4mg4mg4mg七葉苷370g243g270gAmpicillin6g3g6g3gβ-葡萄糖苷酶2 OU2 OU2 OUNa2CO3 (碳酸鈉)IgIgIg 附各種試劑配方LB培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中，以質量體積百分比濃度計，添加蛋白胨 1. O%，酵母提取物0. 5%, NaCl 1. 0%，121°C滅菌30min，室溫放存。IOmM pNPG的配方為每ImL去離子水中，以質量體積百分比濃度計，添加3. Olmg PNPG，溶解后過濾除菌，-20°C保存。IM Na2CO3溶液的配方為每IOOmL蒸餾水中，以質量體積百分比濃度計，添加 10. 6g Na2CO3,121°C 滅菌 30min，室溫放存。100mg/mL Ampicillin 配方為稱取 Ig Ampicillin 置于 IOmL離心管中，加 5mL滅菌水，充分混合溶解后，定容至10mL，用0. 22 μ m濾器過濾除菌，小份分裝后，_20°C保存。七葉苷培養(yǎng)基的配方為每IOOOmL蒸餾水中，以質量體積百分比濃度計，添加蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1. 0%，瓊脂糖1. 0-1. 5%，七葉苷0. 10%，檸檬酸高鐵銨0. 25%，121°C滅菌30min，室溫放存。
權利要求
1.本發(fā)明提供一種基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產生菌的方法，步驟包括(1)將待篩選的單菌落在20-50°C，120-220rpm下液體培養(yǎng)基進行菌株復活；(2)復活菌液在20-50°C，120-220rpm下進行擴培4_18h；(3)取一96孔板添加一定體積菌種生長培養(yǎng)基，按比例轉接復活菌液，20-50°C， 120-220rpm培養(yǎng)4-1 進行擴培；(4)向96孔板擴培菌液中加入一定體積的反應底物pNPG(同時設置陽性對照與陰性對照)，20-50 0C，120-220rpm,反應一定時間；(5)添加一定體積Na2CO3溶液終止反應；(6)室溫下將反應液轉接96孔酶標板在酶標儀上檢測其吸光值，以陽性對照、陰性對照吸收值為參照，可據數值大小判斷不同菌株所產的葡萄糖苷酶的酶活力，確認初篩結果。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟1所述的篩選菌株為細菌。
3.根據權利要求1或2的方法，其中步驟2、3中所述待篩選菌株的復活與擴培具體步驟是向菌種生長培養(yǎng)基中轉接接種液比例為0. 5% -10%。
4.根據權利要求3的方法，其中步驟4中顯色是向擴培菌液中添加反應底物pNPG的比例一般為_5%，pNPG的終濃度范圍一般為0. l-10mmol/L,與pNPG顯色反應時間在 10-90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于96孔板高通量篩選β-葡萄糖苷酶產生菌的方法，尤其將pNPG用于β-葡萄糖苷酶的高通量篩選。具體包括(1)菌株復活；(2)復活菌液擴培；(3)顯色反應；(4)吸光值測定等步驟。本發(fā)明能夠以純培養(yǎng)分離技術與構建基因文庫技術從不同樣品中挖掘產β-葡萄糖苷酶的微生物菌株。本發(fā)明使用pNPG用于β-葡萄糖苷酶產生菌的篩選，與目前文獻所報道用于β-葡萄糖苷酶篩選的七葉苷平板法與熒光法相比較，具有方便、快速、結果準確、廉價等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/34GK102392072SQ20111040561
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權日2011年12月8日
發(fā)明者劉虎虎, 盧向陽, 田云, 趙飛, 辛盛 申請人:湖南農業(yè)大學