專利名稱：一種人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氣管或支氣管是下呼吸道的重要組成部分，氣道上皮細(xì)胞是呼吸道的重要防御屏障，已有研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)的呼吸道感染與粘膜上皮功能失調(diào)密切相關(guān)，因此，氣道上皮細(xì)胞是探尋C0PD、哮喘等呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)疾病發(fā)病機(jī)制的重要研究材料。氣道上皮細(xì)胞離體后， 生物學(xué)特性尚未發(fā)生變化，能在一定程度上反映體內(nèi)狀態(tài)，并顯示親體組織的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞生物學(xué)特性，因此體外氣道上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和細(xì)胞株的建立是研究親體組織生物學(xué)特性的有效手段，同時(shí)也為研究呼吸道疾病發(fā)病機(jī)制及其防治措施提供研究工具。另外，我國(guó)的氣管移植技術(shù)一直處于實(shí)驗(yàn)研究階段，組織工程氣管是氣管移植的重要手段，而氣道上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞是組織工程氣管中不可缺少的部分，因此找到一種簡(jiǎn)便、高效的氣道上皮培養(yǎng)方法對(duì)研究呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)展氣管移植都具有重要的意義。目前，氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有胰酶和/或蛋白酶消化結(jié)合機(jī)械剝離粘膜法和/或機(jī)械刮刷法，這些方法都存在以下缺點(diǎn)(1)機(jī)械剝離粘膜法/機(jī)械刮刷法是采用鑷子等器械在氣管或支氣管上進(jìn)行鈍性分離，其操作難度大，且在剝離過(guò)程中容易損傷上皮細(xì)胞，獲得的存活細(xì)胞少，且細(xì)胞活力差。( 胰酶消化/蛋白酶消化法是采用胰酶/ 蛋白酶溶液對(duì)氣管或支氣管進(jìn)行消化處理，以獲得上皮細(xì)胞，但是胰酶/蛋白酶的消化力很強(qiáng)，且消化時(shí)間不易掌握，易對(duì)上皮細(xì)胞造成損失，細(xì)胞獲得率少，細(xì)胞存活率低且活力差。另外，尚存在以下原因?qū)е乱匀藲獾郎掀ぜ?xì)胞為來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)受到限制1.肺臟為一開(kāi)放性臟器，因此獲得的氣道在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中易發(fā)生污染，同時(shí)由于患者氣道含有大量粘蛋白等渣滓而增加了細(xì)胞分離的難度；2.可用于分離氣道上皮細(xì)胞的標(biāo)本，都是從手術(shù)切除下來(lái)的具病灶的部位，標(biāo)本數(shù)量有限，且標(biāo)本中的正常的氣管或支氣管很少， 如采用一般的氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，對(duì)細(xì)胞損傷大、獲得率低再加上細(xì)胞貼附能力差，最后成活的細(xì)胞數(shù)量極少；3.氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)中，最容易引進(jìn)成纖維細(xì)胞污染，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)快、活力好，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，最終造成原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效、簡(jiǎn)便、高純度的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)獲取原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞取離體人氣管或支氣管，用消化培養(yǎng)基在 40C消化M 4 后收集氣道上皮細(xì)胞，然后接種至培養(yǎng)皿中，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，獲得原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞；(2)獲取傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到70 90%融合密度后，用磷酸緩沖液(PBS)溶液清洗，加入CN 102433296 A
說(shuō)明書(shū)
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0. 25%胰蛋白酶溶液，室溫消化5 10分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、懸浮時(shí)，收集細(xì)胞懸浮液，加入含有蛋白酶抑制劑的等量溶液，離心收集細(xì)胞，然后以1 6X106細(xì)胞/ml的濃度接種于新的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3 5天細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。所述步驟O)中胰蛋白酶溶液中含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)；在培養(yǎng)皿中，每 IOOmm單孔板的胰蛋白酶溶液的用量為1ml。所述步驟⑵中蛋白酶抑制劑為大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean Trypsin hhibitor)，濃度為 0. 5 lmg/ml。所述步驟(1)中獲取原代培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞的具體步驟為1>在顯微鏡下分離棄除氣管或支氣管上所有額外的結(jié)締組織，然后切成小段組織塊，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，將分離干凈的氣管或支氣管浸泡在浸泡培養(yǎng)基中，渦旋震蕩 30 60s后，浸泡5 lOmin，接著用洗滌培養(yǎng)基沖洗干凈，把洗好的組織塊置于離心管內(nèi)， 加入消化培養(yǎng)基，4°C，在搖床上以轉(zhuǎn)速50 60r/min消化氣管或支氣管組織塊M 48h ；2>取出經(jīng)消化的氣管或支氣管組織塊倒入培養(yǎng)皿中，加入胎牛血清至終體積濃度為10 20%，縱向剪開(kāi)氣管，用細(xì)胞刷輕刮內(nèi)表面，然后用磷酸緩沖液沖洗內(nèi)表面和細(xì)胞刷，收集含有脫落細(xì)胞的溶液，4°C離心5min后，用洗滌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，4°C離心5min后， 用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；3>用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，以1 6X IO5細(xì)胞/ml的密度接種于培養(yǎng)板中， 于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2 3天，得到原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。本發(fā)明所述的步驟1>中所述的浸泡培養(yǎng)基、洗滌培養(yǎng)基和消化液的用量以沒(méi)過(guò)氣管或支氣管組織為宜。所述的渦旋震蕩條件為1000 1200r/min，所述的小段組織塊的長(zhǎng)度為5 10cm。本發(fā)明所述的完全培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml鏈霉素的 BEGM培養(yǎng)基
本發(fā)明所述的洗滌培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml鏈霉素的 MEM 培養(yǎng)基(minima essential medium)。本發(fā)明所述的浸泡培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml鏈霉素、0. 5 lmg/ml的二硫代蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)和0. 5 lXl(T2mg/ml的脫氧核糖核酸酶 (DNase)的MEM培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的消化培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml鏈霉素、終濃度為0. 5 lmg/ml的XIV型蛋白酶(ProteaseXIV)和0. 5 IX l(T2mg/ml的脫氧核糖核酸酶(DNase)的MEM培養(yǎng)基。本發(fā)明所述步驟O)中采用的培養(yǎng)皿為包被了 0.05 0.1%的IV型膠原蛋白 (Collagen type IV)的普通的細(xì)胞培養(yǎng)皿。該培養(yǎng)皿的具體制作方法是①I(mǎi)OXCollagen type IV的配制10ml超純水中加入20ul乙酸，混勻，加入 0.05 0. Img Collagen type IV ；②培養(yǎng)皿制備100mm培養(yǎng)皿加入IOXCollagen type IV 1. 5 2. 5ml，搖勻，使其平鋪在培養(yǎng)皿上，之后每半小時(shí)搖勻一次，兩小時(shí)后吸棄剩余液體，在超凈臺(tái)中風(fēng)干，紫外滅菌。
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本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞純度高，形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好，且可以連續(xù)傳代。2.本發(fā)明是在顯微鏡直視下，選擇性的去除氣管或支氣管表面的多余組織，有效減少成纖維細(xì)胞的污染且避免損傷氣道上皮細(xì)胞；采用溫和的還原劑DTT和脫氧核糖核酸酶去除氣管或支氣管表面粘蛋白和核酸；采用特定的含XIV型蛋白酶的消化液在低溫環(huán)境下緩慢消化，消化液中含有基本培養(yǎng)基，在消化的同時(shí)保證細(xì)胞的活性，且消化液反應(yīng)溫和，只消化細(xì)胞間質(zhì)而不會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成損傷，使細(xì)胞貼壁率及成活率顯著提高，培養(yǎng)2 3天即可得到純度為95%以上的氣道上皮細(xì)胞。另外，氣道上皮是假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，僅有一層細(xì)胞，用此法可最大限度的保證原代培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。3.本發(fā)明的培養(yǎng)方法中使用的培養(yǎng)皿中包被有膠原蛋白IV，上皮細(xì)胞在這樣的培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)，有效地提高了上皮細(xì)胞的貼壁性，通常情況下，在培養(yǎng)約他后上皮細(xì)胞就能幾乎完全貼壁，為氣道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功奠定了扎實(shí)基礎(chǔ)。4.本發(fā)明提供的方法獲得的細(xì)胞經(jīng)過(guò)倒置顯微鏡觀察及細(xì)胞免疫組化鑒定具有典型的氣道上皮細(xì)胞的形態(tài)及特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究C0PD、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制奠定了有利實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并且作為組織工程氣管的種子細(xì)胞，為組織工程提供了充足細(xì)胞源。



圖1是普通倒置顯微鏡圖2是普通倒置顯微鏡圖3是普通倒置顯微鏡圖4是普通倒置顯微鏡圖5是普通倒置顯微鏡圖6是普通倒置顯微鏡圖7是普通倒置顯微鏡
100X)下后的人支氣管上皮細(xì)胞。 100X)下1 后的人支氣管上皮細(xì)胞。 100X)下2天后的人支氣管上皮細(xì)胞。 400X)下3天后的人支氣管上皮細(xì)胞。 100X)下5天后的人支氣管上皮細(xì)胞。 100 X)下傳代后1天的人支氣管上皮細(xì)胞。
:100X)下第二代人支氣管上皮細(xì)胞。 圖8a是免疫組化法鑒定第二代人支氣管上皮細(xì)胞，用角蛋白免疫細(xì)胞染色，DAB 顯色，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)。 圖8b是免疫組化法鑒定的作為陰性對(duì)照的第二代人支氣管上皮細(xì)胞。
具體實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不僅限于此，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用技術(shù)手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其它多種形式的衍化、替換或變更。實(shí)施例11.主要實(shí)驗(yàn)材料(1)細(xì)胞來(lái)源因肺癌等疾病行肺葉切除手術(shù)，取切除所得的離體肺葉的遠(yuǎn)端肺組織標(biāo)本。(2)洗滌培養(yǎng)基溶液95U/ml的青霉素、95U/ml的鏈霉素加入MEM培養(yǎng)基(minima essential medium)。
(3)浸泡培養(yǎng)基是洗滌培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5mg/ml的二硫代蘇糖醇和 0. 5X10-2mg/ml的脫氧核糖核酸酶。(4)消化液培養(yǎng)基是洗滌培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5mg/ml的XIV型蛋白酶和 0. 5X10-2mg/mL的脫氧核糖核酸酶。(5)完全培養(yǎng)基含95U/ml青霉素和95U/ml鏈霉素的BEGM培養(yǎng)基。(6)包被 0. 05% Collagen type IV 的培養(yǎng)皿的制備①I(mǎi)OXCollagen type IV的配制10ml的超純水中加入20ul的乙酸，混勻，加入 0. 05mg 的 Collagen type IV。②培養(yǎng)皿的制備在IOOmm的普通的細(xì)胞培養(yǎng)皿加入1. 5ml的10XCollagen type IV，搖勻，使其平鋪在培養(yǎng)皿上，之后每半小時(shí)搖勻一次，兩小時(shí)后吸棄剩余液體，在超凈臺(tái)中風(fēng)干，紫外滅菌。以上(1) (5)所有溶液配制好經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌。2.人支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法2. 1獲取人支氣管1)將標(biāo)本置于體視顯微鏡下，沿氣管解剖結(jié)構(gòu)用顯微鑷和顯微剪于顯微鏡下鈍性分離氣管周?chē)M織，在此過(guò)程中需反復(fù)用生理鹽水沖洗以使視野清晰；2)將分離獲得的支氣管剪下后放入預(yù)冷的生理鹽水中反復(fù)漂洗至肉眼觀察支氣管壁干凈光滑，調(diào)高顯微鏡的放大倍數(shù)，于顯微鏡下使用顯微鑷和顯微剪小心剝離支氣管外殘留脂肪及纖維組織外膜，然后用洗滌培養(yǎng)基反復(fù)沖洗去除多余結(jié)締組織；2. 2獲取原代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞1)將支氣管切成5cm的小段組織塊，用預(yù)冷的雙抗生理鹽水清洗，浸泡在浸泡培養(yǎng)基內(nèi)，浸泡培養(yǎng)基沒(méi)過(guò)組織即可，然后lOOOr/min渦旋震蕩30s，再浸泡5min，接著用洗滌
培養(yǎng)基沖洗氣管三次；2)將洗好的組織塊放入50ml的錐形離心管中，加入消化培養(yǎng)基至沒(méi)過(guò)組織，4°C， 在搖床上以轉(zhuǎn)速60r/min消化氣管Mh ；3)將消化好的組織及消化液倒入IOOmrn培養(yǎng)皿中，加入胎牛血清到終體積濃度為 10%以中和XIV型蛋白酶。縱向剪開(kāi)氣管，用細(xì)胞刷輕刮內(nèi)表面，然后用磷酸緩沖液(PBS) 沖洗內(nèi)表面和細(xì)胞刷，用50ml的錐形離心管收集含有脫落細(xì)胞的溶液。500g，4°C離心5min 后，棄上清，用洗滌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，500g，4°C離心5min后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)；4)第二天，絕大部分單細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞團(tuán)漂浮，用50ml離心管收集舊完全培養(yǎng)基，500g，4°C離心5min。然后用PBS沖洗離心管一次，再加入IOml新鮮制備的含有2mM EDTA, 0. 5mg/mL DTT, 0. 25mg/ml 膠原酶(collagenase)，10ug/ml DNase 的洗滌培養(yǎng)基，37°C 溫育15min，然后加胎牛血清到10% (V/V)，500g，4°C離心5min，棄上清，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，以IXlO5細(xì)胞/ml的密度種植于培養(yǎng)板，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。2. 3獲取傳代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%后，即可傳代。屆時(shí)，用IOmlPBS溶液清洗細(xì)胞3次， 加入Iml 0. 25% (m/v)含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液室溫消化5分鐘，當(dāng)出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞時(shí)，加入含有0. 5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑的等量溶液，離心收集細(xì)胞，然后以1 X IO6
7細(xì)胞/ml的濃度接種于新的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，5天細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的人支氣管氣道上皮細(xì)胞。3.培養(yǎng)結(jié)果3. 1倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞剛種植的細(xì)胞呈圓形、透亮、 單個(gè)均勻分布。原代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)他左右可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞貼壁。大部分為多角形細(xì)胞，呈鋪路石狀，還有一些體積較小的圓形細(xì)胞和少量體積較大的圓形細(xì)胞(圖1和 2)。2天后細(xì)胞有融合趨勢(shì)，呈多角形鑲嵌排列，細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞呈放射狀或渦旋狀分布，胞核多為卵圓形，多數(shù)細(xì)胞為單核，少數(shù)細(xì)胞有雙核或三核，核大居中，細(xì)胞質(zhì)透明，無(wú)顆粒，細(xì)胞間排列緊密(圖幻。3天后細(xì)胞數(shù)量明顯增多呈積聚性生長(zhǎng)，可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)梭形細(xì)胞與鋪路石樣細(xì)胞互相摻雜，生長(zhǎng)細(xì)胞間常有突起相連(圖4)。5天細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，部分區(qū)域細(xì)胞重疊堆積生長(zhǎng)(圖5)。3. 2倒置相差顯微鏡下觀察傳代培養(yǎng)氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)速度較原代細(xì)胞明顯加快。傳代后3天生長(zhǎng)為單層細(xì)胞，形態(tài)與原代相似，但細(xì)胞體積有所增大，并逐漸拉長(zhǎng) (圖6禾口 7)。3. 3細(xì)胞免疫組化鑒定用鼠抗人細(xì)胞角蛋白(AE1/AE3)單克隆抗體進(jìn)行免疫組化鑒定，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞核為深藍(lán)色(圖8a)，同時(shí)不加鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體作為陰性對(duì)照進(jìn)行免疫組化鑒定，只可見(jiàn)細(xì)胞核為深藍(lán)色(圖8b)。具體步驟參見(jiàn)福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的即用型免疫組織化學(xué)超敏UltraSensitve SP試劑盒 (KIT-9710)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在光鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)。純度(％)=陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)/ 細(xì)胞總數(shù)X100%，重復(fù)3次取平均值。每張片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野至少檢測(cè)200 個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每個(gè)視野中細(xì)胞純度，平均達(dá)95%以上。實(shí)施例21.主要實(shí)驗(yàn)材料(1)細(xì)胞來(lái)源因肺癌等疾病行肺葉切除手術(shù)，取切除所得的離體肺葉的遠(yuǎn)端肺組織標(biāo)本。(2)洗滌培養(yǎng)基溶液105U/ml的青霉素、105U/ml的鏈霉素加入MEM培養(yǎng)基。(3)浸泡培養(yǎng)基是洗滌培養(yǎng)基中加入終濃度為lmg/ml的二硫代蘇糖醇和 1 X 10_2mg/ml的脫氧核糖核酸酶。(4)消化液培養(yǎng)基是洗滌培養(yǎng)基中加入終濃度為lmg/ml的XIV型蛋白酶和 1 X 10_2mg/mL的脫氧核糖核酸酶。(5)完全培養(yǎng)基含105U/ml青霉素和105U/ml鏈霉素的BEGM培養(yǎng)基。(6)包被0. 1% Collagen type IV的培養(yǎng)皿的制備①I(mǎi)OXCollagen type IV的配制10ml的超純水中加入20ul的乙酸，混勻，加入 0. Img 的 Collagen type IV。②培養(yǎng)皿的制備在IOOmm的普通的細(xì)胞培養(yǎng)皿加入2. 5ml的10XCollagen type IV，搖勻，使其平鋪在培養(yǎng)皿上，之后每半小時(shí)搖勻一次，兩小時(shí)后吸棄剩余液體，在超凈臺(tái)中風(fēng)干，紫外滅菌。以上(1) (5)所有溶液配制好經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌。2.人支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法
2. 1獲取人支氣管1)將標(biāo)本置于體視顯微鏡下，沿氣管解剖結(jié)構(gòu)用顯微鑷和顯微剪于顯微鏡下鈍性分離支氣管周?chē)M織，在此過(guò)程中需反復(fù)用生理鹽水沖洗以使視野清晰。2)將分離獲得的支氣管剪下后放入預(yù)冷的生理鹽水中反復(fù)漂洗至肉眼觀察支氣管壁干凈光滑，調(diào)高顯微鏡的放大倍數(shù)，于顯微鏡下使用顯微鑷和顯微剪小心剝離支氣管外殘留脂肪及纖維組織外膜，然后用洗滌培養(yǎng)基反復(fù)沖洗去除多余結(jié)締組織。2. 2獲取原代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞1)將支氣管切成IOcm的小段組織塊，用預(yù)冷的雙抗生理鹽水清洗，浸泡在浸泡培養(yǎng)基內(nèi)，浸泡培養(yǎng)基沒(méi)過(guò)組織即可，然后1200r/min渦旋震蕩60s，再浸泡5min，接著用洗滌
培養(yǎng)基沖洗支氣管三次；2)將洗好的組織塊放入50ml的錐形離心管中，加入消化培養(yǎng)基至沒(méi)過(guò)組織，4°C， 在搖床上以轉(zhuǎn)速50r/min消化氣管36h ；3)將消化好的組織及消化液倒入IOOmm培養(yǎng)皿中，加入胎牛血清到終體積濃度為 20%以中和XIV型蛋白酶。縱向剪開(kāi)氣管，用細(xì)胞刷輕刮內(nèi)表面，然后用磷酸緩沖液PBS沖洗內(nèi)表面和細(xì)胞刷，用50ml的錐形離心管收集含有脫落細(xì)胞的溶液。500g，4°C離心5min 后，棄上清，用洗滌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，500g，4°C離心5min后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)；4)第二天，絕大部分單細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞團(tuán)漂浮，用50ml離心管收集舊完全培養(yǎng)基，500g，4°C離心5min。然后用PBS沖洗離心管一次，再加入IOml新鮮制備的含有2mM EDTA，0. 5mg/mLDTT，0. 25mg/ml 膠原酶(collagenase)，10ug/ml DNase 的洗滌培養(yǎng)基，37°C 溫育lh。然后加胎牛血清到10% (V/V)，500g，4°C離心5min，棄上清，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度， 以IXlO5細(xì)胞/ml的密度種植于培養(yǎng)板，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。2. 3獲取傳代培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%后，即可傳代。屆時(shí)，用IOmlPBS溶液清洗細(xì)胞3次， 加入Iml 0. 25% (m/v)含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液室溫消化10分鐘，當(dāng)出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞時(shí)，加入含有l(wèi)mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑等量溶液，離心收集細(xì)胞，然后以6 X IO6細(xì)胞/ml的濃度接種于新的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3天細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 獲得傳代培養(yǎng)的人支氣管氣道上皮細(xì)胞。3.培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果與實(shí)施例一相同。實(shí)施例31.主要實(shí)驗(yàn)材料(1)細(xì)胞來(lái)源因肺氣腫等嚴(yán)重肺部疾病行肺移植手術(shù)，取切除所得的離體肺組織標(biāo)本。(2)洗滌培養(yǎng)基溶液105U/ml的青霉素和105U/ml的鏈霉素加入MEM培養(yǎng)基。(3)浸泡培養(yǎng)基是洗滌培養(yǎng)基中加入終濃度為lmg/ml的二硫代蘇糖醇和1 X 10_2/ ml的脫氧核糖核酸酶。(4)消化液培養(yǎng)基是洗滌培養(yǎng)基中加入終濃度為lmg/ml的XIV型蛋白酶和 1 X 10_2mg/mL的脫氧核糖核酸酶。
(5)完全培養(yǎng)基含105U/ml青霉素和105U/ml鏈霉素的BEGM培養(yǎng)基。(6)包被0. 1% Collagen type IV的培養(yǎng)皿的制備①I(mǎi)OXCollagen type IV的配制10ml的超純水中加入20ul的乙酸，混勻，加入 0. Img 的 Collagen type IV。②培養(yǎng)皿的制備在IOOmm的普通的細(xì)胞培養(yǎng)皿加入2. 5ml的10XCollagen type IV，搖勻，使其平鋪在培養(yǎng)皿上，之后每半小時(shí)搖勻一次，兩小時(shí)后吸棄剩余液體，在超凈臺(tái)中風(fēng)干，紫外滅菌。以上(1)-( 所有溶液配制好經(jīng)0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌。2.人支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法2. 1獲取人氣管1)將標(biāo)本置于體視顯微鏡下，沿氣管解剖結(jié)構(gòu)用顯微鑷和顯微剪于鏡下快速鈍性分離氣管周?chē)M織，在此過(guò)程中需反復(fù)用生理鹽水沖洗以使視野清晰；2)將分離獲得的氣管剪下后放入預(yù)冷的生理鹽水中反復(fù)漂洗至肉眼觀察氣管壁干凈光滑，調(diào)高顯微鏡的放大倍數(shù)，于顯微鏡下使用顯微鑷和顯微剪小心剝離氣管外殘留脂肪及纖維組織外膜，然后用洗滌培養(yǎng)基反復(fù)沖洗去除多余結(jié)締組織；2. 2獲取原代培養(yǎng)的人氣管上皮細(xì)胞1)將氣管切成5cm的小段組織塊，用預(yù)冷的雙抗生理鹽水清洗，浸泡在浸泡培養(yǎng)基內(nèi)，浸泡培養(yǎng)基沒(méi)過(guò)組織即可，然后1200r/min渦旋震蕩60s，再浸泡5min，接著用洗滌培
養(yǎng)基沖洗氣管三次；2)將洗好的組織塊放入50ml的錐形離心管中，加入消化培養(yǎng)基至沒(méi)過(guò)組織，4°C， 在搖床上以轉(zhuǎn)速55r/min消化氣管48h ；3)將消化好的組織及消化液倒入IOOmm培養(yǎng)皿中，加入胎牛血清到終體積濃度為 20%以中和XIV型蛋白酶。縱向剪開(kāi)氣管，用細(xì)胞刷輕刮內(nèi)表面，然后用磷酸緩沖液PBS沖洗內(nèi)表面和細(xì)胞刷，用50ml的錐形離心管收集含有脫落細(xì)胞的溶液。500g，4°C離心5min 后，棄上清，用洗滌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，500g，4°C離心5min后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)；4)第二天，絕大部分單細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞團(tuán)漂浮，用50ml離心管收集舊完全培養(yǎng)基，500g，4°C離心5min。然后用PBS沖洗離心管一次，再加入IOml新鮮制備的含有2mM EDTA, 0. 5mg/mLDTT, 0. 25mg/ml 膠原酶，10ug/ml DNase 的洗滌培養(yǎng)基，37°C溫育 lh。然后加胎牛血清到10% (V/V)，500g，4°C離心5min，棄上清，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，以1父105細(xì)胞/ ml的密度種植于培養(yǎng)板，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。2. 3獲取傳代培養(yǎng)的人氣管上皮細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%后，即可傳代。屆時(shí)，用IOmlPBS溶液清洗細(xì)胞3次， 加入Iml 0. 25% (m/v)含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液室溫消化10分鐘，當(dāng)出現(xiàn)大量懸浮細(xì)胞時(shí)，加入含有l(wèi)mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑的等量溶液，離心收集細(xì)胞，然后以6X106 細(xì)胞/ml的濃度接種于新的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3天細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的人氣管氣道上皮細(xì)胞。3.培養(yǎng)結(jié)果結(jié)果與實(shí)施例一相同。
權(quán)利要求
1.一種人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)獲取原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞取離體人氣管或支氣管，用消化培養(yǎng)基在4°c消化M 4 后收集氣道上皮細(xì)胞，然后接種至培養(yǎng)皿中，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)， 獲得原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞；(2)獲取傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到70 90%融合密度后，用磷酸緩沖液溶液清洗，加入0. 25%胰蛋白酶溶液，室溫消化5 10分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、懸浮時(shí)，收集細(xì)胞懸浮液，加入含有蛋白酶抑制劑的等量溶液，離心收集細(xì)胞，然后以1 6X106細(xì)胞/ml的濃度接種于新的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3 5天細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟( 中胰蛋白酶溶液中含0. 02%乙二胺四乙酸；在培養(yǎng)皿中，每IOOmm單孔板的胰蛋白酶溶液的用量為Imlo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟( 中蛋白酶抑制劑為大豆胰蛋白酶抑制劑，濃度為0. 5 lmg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(1)中獲取原代培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞的具體步驟為1>在顯微鏡下分離棄除氣管或支氣管上所有額外的結(jié)締組織，然后切成小段組織塊， 用預(yù)冷的生理鹽水清洗，將分離干凈的氣管或支氣管浸泡在浸泡培養(yǎng)基中，渦旋震蕩30 60S后，浸泡5 lOmin，接著用洗滌培養(yǎng)基沖洗干凈，把洗好的組織塊置于離心管內(nèi)，加入消化培養(yǎng)基，4°C，在搖床上以轉(zhuǎn)速50 60r/min消化氣管或支氣管組織塊M 48h ；2>取出經(jīng)消化的氣管或支氣管組織塊倒入培養(yǎng)皿中，加入胎牛血清至終體積濃度為 10 20%，縱向剪開(kāi)氣管，用細(xì)胞刷輕刮內(nèi)表面，然后用磷酸緩沖液沖洗內(nèi)表面和細(xì)胞刷， 收集含有脫落細(xì)胞的溶液，4°C離心5min后，用洗滌培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，4°C離心5min后，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；3>用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，以1 6X IO5細(xì)胞/ml的密度接種于培養(yǎng)板中，于 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2 3天，得到原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟1>中所述的浸泡培養(yǎng)基、洗滌培養(yǎng)基和消化液的用量要沒(méi)過(guò)氣管或支氣管組織；所述的渦旋震蕩條件為1000 1200r/min，所述的小段組織塊的長(zhǎng)度為5 10cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的完全培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml鏈霉素的BEGM培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的洗滌培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素和95 105U/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的浸泡培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml鏈霉素、0. 5 lmg/ml的二硫代蘇糖醇和0. 5 1 X 10_2mg/ml的脫氧核糖核酸酶的MEM培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的消化培養(yǎng)基為含95 105U/ml青霉素、95 105U/ml鏈霉素、終濃度為0. 5 lmg/ml的XIV型蛋白酶和0. 5 1 X 10_2mg/ml的脫氧核糖核酸酶的MEM培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟O)中采用的培養(yǎng)皿為包被了 0. 05 0. 的IV型膠原蛋白的普通的細(xì)胞培養(yǎng)皿。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人氣道上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)獲取原代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞；(2)獲取傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞當(dāng)原代細(xì)胞達(dá)到70～90％融合密度后，用磷酸緩沖液溶液清洗，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室溫消化5～10分鐘，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)回縮、懸浮時(shí)，收集細(xì)胞懸浮液，加入含有蛋白酶抑制劑的等量溶液，離心收集細(xì)胞，然后以1～6×106細(xì)胞/ml的濃度接種于新的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，3～5天細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲得傳代培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞。本發(fā)明的培養(yǎng)方法技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好，培養(yǎng)的細(xì)胞純度高，形態(tài)均一，生長(zhǎng)良好，且可以連續(xù)傳代。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102433296SQ201110416809
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者何建行, 盧文菊, 鞏雪芳, 張晨婷, 徐小明, 王健, 鐘南山, 陳豫欽 申請(qǐng)人:呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院